Abstract
Oxigenación simultánea y seguimiento de los factores de acoplamiento estímulo-secreción de glucosa en una sola técnica es crítico para el modelado de estados fisiopatológicos de la hipoxia de los islotes, especialmente en entornos de trasplante. Técnicas de cámara de hipoxia estándar no pueden modular ambas estimulaciones al mismo tiempo ni proporcionar supervisión en tiempo real de los factores de acoplamiento estímulo-secreción de glucosa. Para hacer frente a estas dificultades, hemos aplicado una técnica de microfluidos de capas múltiples para integrar tanto acuosas como modulaciones de fase de gas a través de una membrana de difusión. Esto crea un sándwich de estimulación alrededor de los islotes microscaled dentro de la polidimetilsiloxano transparente (PDMS) de dispositivo, que permita el control de los factores de acoplamiento antes mencionados a través de microscopía de fluorescencia. Además, la entrada de gas es controlado por un par de Microdosificador, proporcionando, modulaciones cuantitativos sub-minuto de oxígeno entre 0-21%. Esta hipoxia intermitente se aplica para investigar un nuevo fenómeno de la islat preacondicionamiento. Por otra parte, armado con microscopía multimodal, hemos sido capaces de mirar calcio detallada y dinámica del canal K ATP durante estos eventos de hipoxia. Tenemos la visión de la hipoxia de microfluidos, especialmente esta técnica de fase dual simultáneo, como una herramienta valiosa en el estudio de los islotes, así como muchos tejidos in vivo ex.
Introduction
Hipoxia dinámica es importante en la biología, especialmente para los trasplantes de islotes
Hipoxia dinámica es una fisiológico importante, así como parámetro fisiopatológico en muchos tejidos biológicos. Cambio en oxígeno, por ejemplo, es una señal potente del desarrollo en la angiogénesis. Por otra parte, los patrones espaciales y temporales de la hipoxia modulan HIF1-alfa y juegan un papel en enfermedades como el cáncer de páncreas. La hipoxia es también un factor de confusión que afectan los resultados del trasplante de islotes. Recientemente, temporalmente, las oscilaciones de la hipoxia, o hipoxia intermitente (IH) han demostrado beneficios en los islotes "de preacondicionamiento" 1. Sin embargo, los efectos de la hipoxia estáticos y transitorios sobre la fisiología del islote aún no han sido bien entendidas o estudiadas, sobre todo debido a la falta de herramientas adecuadas para controlar el microambiente de los islotes.
Los islotes están bien vascularizados in vivo
Islotes pancreáticos son 50-400 Agregados esferoidales m de células endocrinas, incluyendo las células beta y alfa-células que son responsables de la homeostasis de la glucosa; 56. Cuando los islotes se exponen a la glucosa estimulador en la sangre, la absorción y la glucólisis plomo para la producción de ATP, que se abre de potasio sensibles a ATP (KATP) canales y los resultados en el influjo de calcio que desencadena la exocitosis de los gránulos de insulina. El oxígeno es importante para conducir este proceso en gran medida metabólica y la secreción de insulina está influenciada significativamente por la dinámica del flujo de sangre y el suministro de oxígeno además de los gradientes de glucosa. Islotes realizar fácilmente esta respuesta de la glucosa de la insulina in vivo, ya que son altamente perfundidos en el páncreas, cada uno dentro de una longitud de la célula de un vaso capilar. Sin embargo, la densa red de capilares intraislet se elimina por la colagenasa durante islote aislamiento 2,3. En consecuencia, los suministros de oxígeno y de nutrientes se ven limitados a un perímetro de 100 m debido a las limitaciones de difusión.
paso éxito "> Las técnicas actuales han limitado en la recreación microambiente isloteDinámica de oxígeno y de glucosa nativos Recreating de los islotes, clave para el modelado de condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, es difícil de lograr con cámaras hipóxicas estándar que requieren flujo elaborada y carecen de un seguimiento continuo de las funciones de los islotes. Por otra parte, las terapias de trasplante para la diabetes Tipo I exponen islotes aislados a la hipoxia en el sistema portal hepático 4 que tiene pO mucho más bajo 2 (<2%, 5-15 mm de Hg) en comparación con el páncreas fisiológica (5,6%, 40 mmHg). Post-trasplante, los injertos de islotes tomar dos semanas o más para ser revascularizado. Se ha demostrado que la exposición hipóxica deteriora la glucosa-insulina mecanismo de acoplamiento de los islotes. Entre los factores de acoplamiento estímulo-secreción, señalización de calcio, potenciales mitocondriales, y la cinética de la insulina puede ser fácilmente monitoreada usando microfluidos. Nuestra técnica de microfluidos anterior demostró esta reseguimiento de al-tiempo con una modulación precisa del microambiente acuosa alrededor solo islote 5,6. Sin embargo, la cuantificación de deterioro hipóxico del islote está obstaculizado por la falta de técnicas de estimulación y la monitorización simultánea. Por lo tanto, la combinación de control de microfluidos de oxígeno y monitoreo de los islotes puede mejorar estudios de hipoxia de los islotes.
Microfluídica pueden recrear y modular el microambiente acuosa y oxígeno
La técnica estándar para estudios de tejidos y la cultura de hipoxia se ha basado en cámaras de hipoxia. En general, las cámaras de hipoxia proporcionan concentraciones individuales de oxígeno con tiempos de equilibrio en ~ 10-30 min, incompatibles con la hipoxia dinámico minutos en escala. Dos estudios recientes utilizan pequeñas cámaras personalizadas para exposición a la hipoxia intermitente en ratones enteros, con resultados contradictorios sobre la respuesta a la insulina inducida por glucosa 7,8. Tenga en cuenta que en todo el nivel animal, el oxígeno respirado no es directamente tranprogramado para islotes capilar pO 2, debido a los controles en el sistema respiratorio. Además, estos estudios no tienen los niveles de oxígeno estandarizados, ni prevén medidas en tiempo real a nivel de tejido de los islotes.
Por otro lado, la microfluídica de oxígeno pueden superar estas limitaciones mediante el control de oxígeno a través de redes de canales de gas. Por otra parte, la microfluídica es compatible con imágenes en vivo durante la modulación de oxígeno, una hazaña en la actualidad no es posible con cámaras hipóxicas estándar. Un número de estos nuevos enfoques de microfluidos utilizar la permeabilidad a los gases de polidimetilsiloxano para disolver las concentraciones de oxígeno en microcanales que fluyen los medios de comunicación sobre las células diana 9-14. Estos dispositivos también se han integrado varias concentraciones discretas de oxígeno, sensores de oxígeno basados en fluorescencia, e incluso la generación química de oxígeno en el chip.
Microfluidos basada en solvatación líquidos tienen dificultades para mantener, gradientes continuos estables como iT depende de mezcla convectiva que es sensible a las condiciones de flujo. En comparación, la técnica que usamos aquí se centra en la disminución de la trayectoria de difusión de la entrega de oxígeno. La solvatación de gas y el flujo de cizallamiento se eliminan mediante la difusión de oxígeno directamente a través de una membrana sembrada con células o tejidos de los islotes. Esto elimina los microfluidos adicionales necesarios para el control de solvatación y evita el estrés de cizalla innecesarios a los islotes, que a su vez puede desencadenar la liberación de insulina. Esta plataforma se ha utilizado para demostrar las especies reactivas del oxígeno (ROS) sobre regulación en los extremos tanto hiperóxicas e hipóxicas (2-97% O 2) en el cultivo de células 1,15. Debido a la prestación directa de oxígeno y la eliminación del flujo de tensiones, nuestra plataforma basada en la difusión proporciona la solución óptima de microfluidos para el estudio de la hipoxia de los islotes.
Estimulación y monitoreo multimodal
Microfluidos basada en la difusión también aporta beneficios adicionales cuando se adapta para el estudio de millas del islotecrophysiology. Mediante el uso de una membrana como barrera de difusión, el líquido puede ser aislado de las modulaciones de oxígeno, lo que permite controles de estimulaciones acuosas de glucosa independientemente de estímulos hipóxicos. Esto crea una estimulación simultánea de sándwich que espacialmente pin-puntos de entrega a los islotes. Además, como el gas es modulada temporalmente a través de microinyectores computarizados, que pueden modular la concentración de oxígeno 21 a 0% digitalmente con el tiempo transitorio menos de 60 seg. Los controles dinámicos de oxígeno y el microambiente de la glucosa en el microscopio permiten un protocolo multimodal en tiempo real que no sería posible o extraordinariamente engorroso el uso de cámaras de hipoxia estándar. El uso de este dispositivo, la señalización de calcio (Fura-AM), los potenciales mitocondriales (rodamina 123), y la cinética de insulina (ELISA) fueron monitorizados para proporcionar una imagen completa de la respuesta dinámica de la glucosa de la insulina en condiciones de hipoxia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in | |
References
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