Abstract
Samtidig oksygenering og overvåking av glukose stimulus-sekresjon koblings faktorer i en enkelt teknikk er avgjørende for modellering patofysiologiske tilstander av holme hypoksi, spesielt hos transplantasjonsmiljøer. Standard hypoksiske kammer teknikker kan ikke modulere både stimulations samtidig heller ikke gi sanntids overvåking av glukose stimulus-sekresjon koblings faktorer. For å løse disse problemene, søkte vi en flerlags microfluidic teknikk for å integrere både vandig og gassfase modulasjoner via en diffusjonsmembran. Dette gir en sandwich-stimulering rundt microscaled holmer innenfor det gjennomsiktige polydimetylsiloksan (PDMS)-enhet, slik at overvåkning av de nevnte koplingsfaktorene via fluorescens mikroskopi. I tillegg er gassinngang styres av et par i microdispensers, og gir kvantitative, sub liten modulasjoner av oksygen mellom 0-21%. Dette intermitterende hypoksi er benyttet for å undersøke et nytt fenomen av islet prekondisjonering. Videre, bevæpnet med multimodal mikroskopi, var vi i stand til å se på detaljerte kalsium og K ATP-kanal dynamikk i løpet av disse hypoksiske hendelser. Vi ser for oss microfluidic hypoksi, spesielt dette samtidig dual fase teknikk, som et verdifullt verktøy i å studere holmer samt mange ex vivo vev.
Introduction
Dynamisk hypoksi er viktig i biologi, spesielt for holmen transplantasjoner
Dynamisk hypoksi er en viktig fysiologisk og patofysiologisk parameter i mange biologiske vev. Endring av oksygen, for eksempel, er en potent utviklings signal i angiogenese. Videre, romlige og tidsmessige mønstre i hypoksi modulere HIF1-alfa og spille roller i sykdommer som kreft i bukspyttkjertelen. Hypoksi er også en problemfaktor som påvirker holme transplantasjon utfall. Nylig har timelig svingninger av hypoksi, eller periodisk hypoksi (IH) demonstrerte fordeler i "prekondisjonering" holmer en. Men både statiske og forbigående hypoksi effekter på holme fysiologi har ennå å bli forstått eller studert, primært på grunn av mangel på egnede verktøy for å kontrollere holme sin mikromiljøet.
Holmer er godt vascularized in vivo
Bukspyttkjertelen holmer er 50-400 56, m kuleformede aggregater av endokrine celler, innbefattende beta-celler og alfa-celler som er ansvarlige for glukose-homeostase. Når holmer utsettes for stimulerende glukose i blodet, opptak og glykolyse fører til ATP-produksjon, noe som åpner for ATP-sensitive kalium (K) ATP-kanaler og fører til kalsiuminnstrømningen som utløser exocytose av insulinkorn. Oksygen er viktig for å drive dette tungt metabolisme og insulinsekresjon er betydelig påvirket av dynamikken i blodstrømmen og oksygentilførselen i tillegg til glukose-gradient. Islets lett utføre denne glukose-insulin respons in vivo når de er sterkt perfundert i bukspyttkjertelen, hver i løpet av en cellelengde fra en kapillær fartøy. Imidlertid er tett nettverk av blodkar intraislet fjernet ved kollagenase under holme isolert 2,3. Følgelig blir både oksygen-og nærings leverer begrenset til en 100 mikrometer omkrets på grunn av diffusjons-begrensninger.
trinn "> Dagens teknikker har begrenset suksess i å gjenskape holme mikromiljøetGjenskaper holmen innfødte oksygen og glukose dynamikk, nøkkelen til modellering fysiologiske og patofysiologiske forhold, er vanskelig å oppnå med standard hypoksiske kamre som krever forseggjort flyt og mangler kontinuerlig overvåking av holmen funksjoner. Videre transplantasjon terapi for type I diabetes eksponere isolerte øyer på hypoksi i lever-portsystem 4 som har mye lavere pO 2 (<2%, 5 til 15 mmHg) i forhold til fysiologisk bukspyttkjertelen (5,6%, 40 mm Hg). Post-transplantasjon, holmen grafts ta to uker eller mer å bli revascularized. Det har blitt vist at hypoksisk eksponering svekker holme glukose-insulin koblingsmekanisme. Blant de stimulus-sekresjon koblings faktorer, kalsium signal, mitokondrie potensialer og insulinkinetikk kan være lett overvåkes ved hjelp MicroFluidics. Vår forrige microfluidic teknikken demonstrert denne real-tid overvåking med nøyaktig modulering av vandige mikromiljøet rundt enkelt holme 5,6. Men, kvantifisering av holme sin hypoksisk fall blir hindret av mangelen på samtidige stimulering og overvåking teknikker. Derfor kan kombinere microfluidic kontroll av oksygen og holme overvåking forbedre holmen hypoksi studier.
Microfluidics kan gjenskape og modulere den vandige og oksygen mikromiljøet
Den standard teknikk for vev og kultur hypoksi studier har vært basert på hypoksiske kamre. Generelt, de hypoksiske kamrene gi enkeltoksygenkonsentrasjoner med ekvilibreringstider i ~ 10-30 min, inkompatible med minutt-skalert dynamisk hypoksi. To nyere studier brukte små tilpassede kamre for periodisk hypoksi eksponering på hele mus, med motstridende resultater på glukose-indusert insulinrespons 7,8. Husk at på hele dyret nivå, er det respirerer oksygen ikke direkte tranplanlagt å holmen kapillær pO 2, på grunn av kontroller i luftveiene. Videre gjør disse studiene ikke har standardiserte oksygennivå, heller ikke de gir deg sanntids tiltak på vevet nivå av holmer.
På den annen side, kan oksygen MicroFluidics overgår disse begrensninger ved å kontrollere oksygen via gasskanalnett. Videre er MicroFluidics kompatibel med levende avbildning under oksygen modulasjon, en prestasjon for øyeblikket ikke mulig med standard hypoksiske kamre. En rekke av disse nye MicroFluidics nærmer utnytte gasspermeabilitet av polydimetylsiloksan for å oppløse oksygen konsentrasjoner i mikrokanaler som strømmer media over målceller 9-14. Disse enhetene har også integrert flere diskrete oksygenkonsentrasjoner, fluorescens basert oksygen sensorer, og selv kjemisk oksygen generasjon on-chip.
Flytende solvatisering baserte MicroFluidics har en hard tid å opprettholde stabile og kontinuerlige gradienter som jegt er avhengig av konvektiv blanding som er følsom for strømningsforholdene. Til sammenligning, den teknikken vi bruker her fokuserer på å redusere spredningen banen for oksygentilførsel. Gassen solvatisering og skjærstrøm, elimineres ved direkte å diffundere oksygen over en membran utsådd med celler eller islet vev. Dette fjerner de ekstra MicroFluidics kreves for å kontrollere solvation og hindrer unødvendig skjærspenning til holmer, som i seg selv kan utløse insulin release. Denne plattformen har blitt brukt til å demonstrere reaktive oksygen arter (ROS) oppregulering på både hyperoksiske og hypoksiske ytterpunktene (2-97% O 2) i cellekultur 1,15. På grunn av den direkte levering av oksygen og fjerning av skjærstrøm, gir vår diffusjons-basert plattform optimal mikrofluid løsning for å studere holme hypoksi.
Multimodal stimulering og overvåking
Diffusion-baserte MicroFluidics bringer også ytterligere fordeler når tilrettelagt for å studere holmen microphysiology. Ved å bruke en membran som en diffusjonsbarriere, kan væsken være isolert fra oksygen modulasjoner, slik at kontroll av vandige glukosestimuleringer uavhengig av hypoksiske stimuleringer. Dette skaper en sandwich-aktig samtidig stimulering som romlig pin-poeng levering til holmer. Videre, når gassen midlertidig modulert via datastyrt microinjectors, kan vi modulere oksygenkonsentrasjonen 21-0% digitalt med transient tid under 60 sek. De dynamiske kontroller av oksygen og glukose mikromiljøet i mikroskopet tillate en sanntids multimodal protokoll som ikke ville være mulig, eller usedvanlig tungvint å bruke standard hypoksiske kamre. Ved hjelp av denne enheten, ble kalsium signalisering (Fura-AM), mitokondrie potensialer (rodaminmolekyler 123), og insulin kinetikk (ELISA) overvåket for å gi et fullstendig bilde av den dynamiske glukose-insulin respons under hypoksi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbereder muse holmer
- Dissekere C57BL / 6 mus og isolere holmer av collagenase fordøyelsen og Ficoll tettshetsgradient separasjon. (Se Jove artikler referert i 2,3).
- Inkuber holmer i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 20 mM HEPES i petriskåler (37 ° C, 5% CO2). Post-isolasjon, holmer kultur for 24 timer før bruk i eksperimenter. Bruk holmer innen 1-2 dager for å sikre konsistente resultater.
2. Gjøre Microfluidic Platform
- Generering av mikro geometrier på transparentfotomasker for hver enhet lag: 1) innløp og utløp, 2) Glukose microfluidic lag med perifusion kammeret (diameter 8 mm x 3 mm, 150 ul), 3) 200 mikrometer membran med mikrobrønnene (500 mikrometer i diameter, 100 mikrometer dyp), og 4) gass microfluidic lag.
- Å dikte innløp og utløp lag, hell avgassede, ferdigblandet PDMS tilen høyde på 1,5 mm i en tom petriskål og herding ved 80 ° C i 2 timer. Punch 2 mm diameter input / ut porter.
- For å fremstille glukose mikrofluidsjikt, spinne to 350 um lag av SU8-2150 for å danne en enkelt 700 mikrometer lag på et 4 i silisiumskive.
- Expose UV lys gjennom den aktuelle fotosjablonen å overføre microchannel mønsteret på SU8 etter utvikling, produserer en 700 mikrometer høy mester.
- Hell avgassede, forhåndsblandede PDMS på denne master til en høyde på 3 mm og herde ved 80 ° C i 2 timer. Skjær dette PDMS å forme med et barberblad.
- Punch 2 mm diameter inn / ut porter samt 8 mm diameter kammer.
- For å fremstille en 200 mikrometer membran med mikrobrønner, spinn SU8-2100 nm til 100 um. Påfør samme UV-litografi å overføre mikro mønstre på denne 100 mikrometer høye herre.
- Spin avgasset, forhåndsblandede PDMS på denne master ved 900 opm i 30 s og herde ved 80 ° C i 10 min. Spina andre lag på toppen av den første ved hjelp av de samme betingelser, noe som resulterer i en 200 mikrometer PDMS membran inneholdende mikromønster.
- Punch 2 mm diameter input / output porter gjennom denne membranen
- For å fremstille gassmikrofluidsjikt, spinne SU8-2100 nm til 100 um. Påfør samme UV-litografi å overføre gass microfluidic mønstre på denne 100 mikrometer høye herre.
- Hell avgassede, forhåndsblandede PDMS på denne master til en høyde av 1,5 mm og herde ved 80 ° C i 2 timer. Kutt PDMS å forme med et barberblad.
- Punch 2 mm diameter input / output porter gjennom dette laget
- For å binde de flere lag, forberede dem ved å rense med teip, utsette til corona bue, og deretter justere for hånd i følgende rekkefølge.
- Bond membranen til bunnen gass lag med mikro vendt opp.
- Bond glukose microfluidic oppå mikro membran.
- Bond innløps-og utløps lag on helt på toppen, innkapsle hele forsamlingen.
- Forsterk binding ved tilsetning av 1 kg vekt på toppen og baking ved 100 ° C i 3 timer.
- Lekkasje-teste den ferdige enhet ved å laste vannet inn i det vandige lag, og deretter å senke hele enheten under vann. Deretter strømmer luften gjennom gasslaget med en tom sprøyte.
- Sterillekkasjefrie enheter med 70% etanol gjennom det vandige lag deretter i flukt med PBS-buffer, karakterisert ved at enheten er lagret ved 4 ° C inntil bruk.
Tre. Microdispenser Setup
- Skaffe to microdispensers, 5 V og 20 V DC strømforsyninger og en digital I / O-kort for å konstruere oksygenblanding og oppsett levering.
- Koble microdispensers 'styreledninger til de inkluderte driverenhetene.
- Koble driverne til digital I / O-kort i havner som tilsvarer LabView kontroller.
- Koble 5 V og 20 V strømforsyninger til tilsvarende kontakter på stasjonen units.
- Koble digital I / O til en bærbar PC til å utføre LabView koder for gasskontroll (vedlegg).
- Koble en microdispenser til nitrogen, mens et annet for å komprimert luft, begge deler med 5% CO2. Sett begge gasser til 2 psi. Hook opp dispenserens utganger i et T-kryss før innreise microfluidic enheten.
- Ved hjelp av en lekkasje-testet enhet, karakterisere den transiente respons av oksygen modulasjon ved å sykle de microdispensers mellom 5 til 21% oksygen, mens måling av oppløst oksygen i vann med en fiberoptisk oksygensensor (se utstyrsliste og representative resultater).
4. Sette opp på Mikros
- Montere enheten til oppvarmet scenen på invertert mikroskop.
- Koble 0% og 21% O 2 gasser til enheten og kalibrere med oksygen sensor.
- Koble utgang av glukose MicroFluidics til en brøkdel samler.
- Klargjør Krebs Ringer bikarbonatbuffer (KRB): 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 1,2 mM MgSo4 · 7H 2 O, 10 mMHEPES pH 7,35 til 7,40 , 2 mM basal glukose, og 5% FBS.
- Forbered to bufferløsninger inneholdende 2 mM og 14 mM glukose henholdsvis i 50 ml koniske rør badet i 37 ° C vannbad.
- Koble en peristaltisk pumpe for å trekke buffer ved 250 mL / min inn i slangen. Flow slangen over en 37 ° C kokeplate før vi går i microfluidic enhet.
- Å farge holmer, legge Fura-2 AM i DMSO og Rh123 i 100% etanol til 2 ml av KRB å nå slutt fargestoff konsentrasjoner av 5 mikrometer og 2,5 mikrometer, henholdsvis.
- Ta opp holmer med en 10 mL pipette og inkuberes i fargestoffer i 30 minutter ved 37 ° C.
- Legge ca 20 holmer inn i enheten via glukose microchannel innløpet. Direkte holmer inn i kammeret ved priming buffer fra uttaket tilbake til than fjord.
- Perfuse holmer i buffer for 10 min å vaske bort overflødig fargestoffer.
5. Kjøre Samtidig oksygen og glukose Stimulering
- Levere en glukose stimulering puls med 5 min av baseline etablert av KRB2, etterfulgt av 15 min på 14 mm stimulering, vask deretter i 15 min i KRB2.
- Record 340/380 nm eksitasjon bølgelengde for Fura-2 og 534 utslipp for Rh123.
- Foreta målinger av en normal puls (14 mM normoksiske) før hvert eksperiment.
- For oksygen modulasjon (hypoksi / intermitterende hypoksi), bare gjelder buffer strømmen under stimulering og vasketrinn og ingen flyt i andre trinn, for å minimere konvektive forstyrrelser.
- Samle utslipp fra glukose uttak med 1 minutts intervaller for ELISA insulin analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in | |
References
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
