Summary
Overview
Die Plasmidpräparation ist ein Verfahren, mit dem man Plasmid-DNA von der bakteriellen genomischen DNA, Proteinen, Ribosomen und Zellwänden trennt und aufreinigt. Ein Plasmid ist ein kleines, ringförmiges, doppelsträngiges DNA Molekül, das als Träger bestimmter DNA Moleküle benutzt wird. Wenn sie in Gastorganismen durch Transformation eingefügt werden, können Plasmids repliziert werden, wodurch vielfache Kopien des DNA Fragments entstehen.
In diesem Video stellen wir ein Schritt-für-Schritt Verfahren vor, mit dem man Plasmide isoliert. Plasmidpräparationen beinhalten 3 Schritte: das Wachsen der bakteriellen Kultur, dem Ernten und der Lysierung der Bakterien, und der Aufreinigung der Plasmid-DNA. Dieses Video erklärt wo sich die Plasmid-DNA in jedem Schritt des Protokolls befindet und wie man die Plasmid-DNA quantitativ und qualitativ mit einem Spektrophotometer oder mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Es gibt verschiedene Arten von Plasmidpräparationsverfahren, die auf die Ausbeute, den Replikationsursprung und das bakterielle Kulturvolumen ausgerichtet sind.
Procedure
Plasmide sind ringförmige, extrachromosomale DNA Moleküle, die in der molekularen Biologie als Träger, oder Vektoren, für spezifische DNA Fragmente fungieren. Bakterien werden benutzt, um die DNA zu vervielfältigen. Der Prozess mit dem man Plasmide von Bakterien isoliert, wird Plasmidpräparation genannt. Dieses Verfahren wird in diesem Video erklärt.
Es ist offensichtlich das die Plasmidpräparation die Isolierung des Plasmids aus den Bakterien beinhaltet – aber was genau bedeutet das eigentlich? Für die Plasmidpräparation müssen Plasmide von bakteriellen Chromosomen, Proteinen, Membranen und Ribosomen isoliert werden.
Es gibt viele verschiedene Kits für Plasmidpräparationen. Das grundlegende Prinzip der Aufreinigung ist jedoch immer das Gleiche. Zuerst wird die ausgewählte bakterielle Kolonie in dem Kulturmedium, welches das richtige Antibiotikum enthält, vervielfältigt. Da das Plasmid ein antibiotisches Resistenz-Gen enthält, wachsen nur die Bakterien, die das Plasmid tatsächlich enthalten. Die Bakterien werden geerntet und bei einem hohen pH-Wert lysiert. Dann wird der pH-Wert neutralisiert und Salz wird hinzugegeben. Danach wird das Gemisch zentrifugiert, um Abbauprodukte und genomische DNA zu entfernen.
Das neutralisierte Zell-Lysat wird dann auf eine Silica-Säule aufgetragen. Die Plasmid-DNA klebt dabei durch einen Mechanismus, den man Anionen-Austausch nennt, an der Säule fest. Beim Anionen-Austausch bindet die stark anionische DNA durch kationische Salzbrücken an die negativ geladene Säule. Andere Stoffe in dem Lysat, wie beispielsweise Proteine, werden mit Waschpuffern mit hoher Salzkonzentration durch die Säule gespült. Letztendlich wird das Plasmid von der Säule durch die Zugabe eines Puffers mit niedriger Salzkonzentration isoliert, da die Salzbrücke unterbrochen wird.
Bei diesem Verfahren sollte man einen Laborkittel, Handschuhe und eine Sicherheitsbrille tragen.
Die bakteriellen Kulturen, die mit dem gewünschten Plasmid transformiert worden sind, werden über Nacht mit dem geeigneten Antibiotikum bei 37°C in einem Schüttler angesetzt.
Am nächsten Tag werden die Bakterien in ein Pellet abzentrifugiert, wobei der Überstand aspiriert wird. Das bakterielle Pellet wird in dem Resuspensionspuffer resuspendiert.
Nach dem Resuspendieren können die Bakterien in ein kleineres Reaktionsgefäß überführt werden, in welchem dann der Lysispuffer hinzugefügt wird. Der Lysispuffer hat einen hohen pH-Wert und enthält Detergenzien, wie zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, welche die Zellwände zerstören, wodurch die Bakterieren lysiert werden. Bei der Zugabe des Lysispuffers wird die Lösung trüb, nach dem Mischen wird sie klar. Das Gemisch sollte nicht mit dem Vortexmischer gemischt werden, da die genomische DNA zerbrechen könnte und dann eine Verunreinigung in der Plasmidpräparation darstellen kann.
Dann gibt man den Neutralsierungspuffer hinzu, um die alkalinenen Bedingungen zu neutralisieren und den pH-Wert zu senken. Durch sanftes Mischen präzipitiert die genomische DNA und die daran gebundenen Proteine. Die Plasmid-DNA bleibt allerdings in Lösung. Man sollte Mischen mit dem Vortexmischer immer noch vermeiden, so dass die Plasmide frei von genomischer DNA bleiben.
Das Gemisch wird dann zentrifugiert, wobei sich die präzipitierte genomische DNA und Proteine als Pellet ansammelt. Der Überstand besteht aus löslichen Proteinen und der Plasmid-DNA.
Der Überstand wird dann durch dekantieren (also einfachem Schütten oder Pipettieren) auf eine Säule aufgetragen. Das Pellet kann entsorgt werden.
Danach lässt man den Waschpuffer mit hoher Salzkonzentration durch die Säule laufen – die DNA bleibt dabei an die Silica-Säule gebunden. Wiederholtes Waschen mit Puffern mit hoher Salzkonzentration entfernt Endonukleasen, RNA, Proteine, Farbstoffe und Unreinheiten mit niedriger Molekularmasse. Bei den Waschschritten wird der Durchfluss verworfen. Nach dem letzten Waschschritt stellt man sicher, dass der Filter komplett trocken und kein Puffer mehr vorhanden ist. Die Plasmid-DNA befindet sich immer noch in dem Filter.
Die Plasmid-DNA wird dann mit sterilem Wasser oder Eluierpuffer eluiert. Die DNA kann danach für vielfältige Anwendungen weiterverwendet werden.
Es gibt verschiedene Methoden, wie man die Reinheit der Plasmidpräparation messen kann. Ein Spektrophotometer kann benutzt werden um die Absorbanz bei verschiedenen Wellenlängen zu bestimmen, wodurch die Reinheit der Plasmid-DNA berechnet werden kann. Mit einer Analyse des aufgereinigten Plasmids mit einem Agarose-Gel kann bestimmt werden, ob das Plasmid die richtige Größe hat und das keine Verunreinigungen vorhanden sind. Bei diesem Schritt kann man auch sicherstellen, dass keine Kontamination mit genomischer DNA vorliegt und dass das Plasmid nicht durch die Bakterien verändert wurde.
Die Plasmidpräparation ist ein Verfahren, das je nach Plasmidgröße, Replikationsursprung und Kulturvolumen variiert werden kann. Es kann verschiedene Bestandteile für das Binden, Waschen und Eluieren enthalten. Die Ausbeute ist das wichtigste Unterscheidungsmerkmal der verschiedenen Verfahren, die oft in Miniprep, Midiprep und Maxi- oder Megaprep, abhängig von der gewünschten Ausbeute, unterteilt werden.
Eine Anwendung die häufig auf eine Plasmidpräparation folgt ist die Transfektion, also die Einfügung der Plasmid DNA in eukaryotische Zellen. Transfektionen werden häufig mit dem Ziel gemacht die Strukturen von Zellen und Geweben mit Reporterproteinen abzubilden, wie zum Beispiel mit diesem Plasmid was Neuronen in diesen Bildern einfärbt.
Manchmal können Plasmids, die durch mehrere Aufreinigungsschritte isoliert worden sind, in die gleichen Bakterien eingefügt werden und durch die Produktion der kodierten Enzyme ganze biosynthetische Pfade reproduzieren. Das Endresultat ist die Herstellung eines komplexen Stoffes, wie zum Beispiel eines Antibiotikums, wie hier zu sehen ist.
Aufgereinigte Plasmide können auch in Bakterien eingefügt werden, um große Mengen eines Proteins zu produzieren, das durch das Plasmid kodiert wird. Hier sieht man wie Bakterien homogenisiert und lysiert werden, bevor Zielproteine durch ein Verfahren das man Affinitätsaufreinigung nennt, isoliert werden. Die purifizierten Proteine können dann kristallisiert werden, um ihre Struktur zu bestimmen.
Das war die Einführung in die Plasmidpräparation von JoVE. In diesem Video haben wir die grundlegenden Prinzipien, die hinter diese Methode stehen behandelt. Wir haben außerdem eine Schritt-für-Schritt Anleitung gegeben und einige nützliche Anwendungen diskutiert. Wie immer – danke für eure Aufmerksamkeit.
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