Overview
Purificación del plásmido es una técnica utilizada para aislar y purificar ADN de plásmido de ADN genómico, las proteínas, los ribosomas y la pared celular bacteriana. Un plásmido es un pequeño, circular, doble cadena de ADN que se utiliza como transportador de moléculas de ADN específicas. Cuando se introduce en un organismo anfitrión a través de la transformación, un plásmido se replicarán, creando numerosas copias del fragmento de DNA en estudio.
En este video, se describe un procedimiento generalizado paso a paso de cómo realizar la purificación del plásmido. Purificación del plásmido incluye tres pasos básicos: crecimiento del cultivo bacteriano, cosecha y lisis de las bacterias y purificación del plásmido ADN. El video contiene una explicación donde puede encontrarse el plásmido en cada paso del protocolo y cuantitativamente y cualitativamente analizar ADN de plásmido con un espectrofotómetro o gel de electroforesis. Existen diferentes tipos de plásmido purificación los métodos disponibles, que están orientados a la producción deseada, número de copias del plásmido y volumen de cultivo bacteriano.
Procedure
Los plásmidos son moléculas de ADN extra cromosómicas, circular y en biología molecular que actúan como portadores o vectores, para un ADN específico del fragmento. Las bacterias se utilizan para replicar plásmidos, por lo que el ADN de interés es producido en masa. El proceso por el cual los investigadores obtención plásmidos de bacterias se denomina purificación del plásmido, que se explica en este video.
Obviamente, implica la purificación del plásmido purificación de plásmidos, pero ¿qué significa eso exactamente? Para purificar plásmidos, deben ser aislados desde el cromosoma bacteriano, las proteínas, la membrana bacteriana y los ribosomas bacterianos.
Aunque muchos kits diferentes existen para la purificación de plásmidos, el principio básico detrás de purificación del plásmido sigue siendo el mismo para todos. En primer lugar, la Colonia bacteriana seleccionada se cultiva en un medios de cultivo adecuados que contiene los antibióticos correctos. Gracias a un gen de resistencia a los antibióticos, codificado por el plásmido, solamente las bacterias que contienen el plásmido crecerán en este medio. Las bacterias son cosechadas y lisis bajo un pH alto. El pH es neutralizado, se agrega sal y luego la mezcla se hace girar hacia abajo para quitar escombros y ADN genómico.
Lisado de células neutralizados se agrega en una columna de sílice. DNA plasmídico se cree que se adhieren a la columna por medio de un mecanismo llamado intercambio de anión, donde el ADN, un anión fuerte, se une a la columna carga negativa por medio de un puente de sal de catión. Otro material de lisado, como las proteínas, se lavan a través de la columna con tampones sal alta. Por último, plásmido purificado se libera de la columna cuando se agrega un tampón salino bajo interrumpir el puente de sal.
Para este procedimiento, se deben usar una bata de laboratorio, guantes desechables y gafas de protección.
Las culturas bacterianas, que se transforman con el ADN de plásmido deseado, deben cultivarse durante la noche en medios de cultivo con antibiótico apropiado en una 37 º C agitando la incubadora.
Al día siguiente, la cultura de las bacterias es peleteada por centrifugación y el sobrenadante se elimina. Se resuspendió el sedimento restante en tampón de lisis.
Una vez suspendidas, las bacterias pueden transferirse a un tubo más pequeño donde se añade tampón de lisis. Tampón de lisis tiene un pH alto y contiene detergentes, tales como dodecil sulfato de sodio, que rompen las membranas bacterianas, así lisis de la bacteria. La solución girará con la adición del buffer de lisis y después de mezclar la solución se vuelve más claro. La mezcla no debe agitarse debido a la posibilidad de distorsionar o romper el ADN genómico, aparte, que luego podría contaminar la purificación de DNA plasmídico.
Luego, se añade tampón de neutralización para neutralizar las condiciones alcalinas y bajar el pH. Con suave mezcla de ADN genómico así como cualquier proteínas atadas precipita, mientras plásmido que ADN permanece en solución. Una vez más evitar Vortex, así como sus plásmidos están libres de contaminación de ADN genómica.
Luego se centrifuga la mezcla y el precipitado de ADN/proteínas genomic es peleteado. El sobrenadante contiene el DNA del plasmid como proteínas solubles.
Este sobrenadante se coloca sobre la columna por decantación, un nombre de fantasia para verter apagado o pipeteando. Los pellets pueden ser desechados.
Siguiente, alto sal tampón de lavado pasa a través de la columna mientras que el ADN permanece ligado a la sílice. Repetir pasos con tampón salino alto elimina enzimas, RNA, proteínas, colorantes y las impurezas de bajo peso molecular que se lava. El flujo a través de los pasos de lavado deben ser desechado. Después de que el paso de lavado final Asegúrese de que el filtro esté completamente seco sin cualquier buffer restante. El DNA de plásmido se encuentra todavía en el filtro.
El ADN plásmido es eluted con agua estéril o con un tampón de elución. El ADN está disponible para su uso inmediato en una amplia gama de aplicaciones.
Hay un número de maneras para verificar la pureza de plásmidos después de la purificación. Un espectrómetro puede ser usado para comparar absorbancia a diferentes longitudes de onda para determinar la concentración de ADN plásmido. Un análisis de gel de agarosa del plásmido purificado puede determinar si el plásmido es el tamaño correcto y no hay contaminantes. Este paso asegura que no hay ninguna contaminación de DNA genómica y el plásmido no se modificó en las bacterias.
El procedimiento de purificación del plásmido puede ser modificado para acomodar tamaños de diferentes plásmidos, número de copias, volumen de la cultura y puede incluir diferentes equipos para los pasos vinculantes, lavado y elución. Rendimiento pasa a ser una de las distinciones más importantes entre las preparaciones de plásmidos y se dividen a menudo en el minipreparation, o miniprep el midiprep, un maxiprep y megaprep según el rendimiento deseado.
En términos de aplicaciones posteriores, un procedimiento que comúnmente sigue la purificación del plásmido es la transfección, que consiste en la introducción de ADN plásmido en las células eucariotas. A menudo el objetivo de un experimento de transfección es visualizar la estructura de las células y tejidos con proteínas de reportero, tales como etiquetado de las neuronas en las imágenes que ves aquí.
A veces múltiples plásmidos purificados por varias preparaciones de purificación pueden introducirse en la misma bacteria, reproduciendo así un camino biosintético del todo a través de la producción de una serie de enzimas codificadas por la plásmidos. El resultado final es la producción de un compuesto complejo, como el antibiótico que ver aquí, por la célula.
Plásmidos purificados pueden ser reintroducidos en las bacterias, en orden de generar grandes cantidades de la proteína codificada por el plásmido. Aquí puede ver las células bacterianas se homogeneizó y lisis antes de una técnica llamada purificación de afinidad puede realizarse para aislar la proteína diana. Proteico purificado se cristaliza y luego identifica su estructura.
Sólo ha visto la introducción de Zeus a la purificación del plásmido. En este video hablamos de los principios básicos detrás de este método, la descripción paso a paso y un puñado de aplicaciones de su preparación de plásmido. ¡Como siempre, gracias por ver!
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