Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Optimerede protokoller til doi: 10.3791/50620 Published: March 23, 2014

Summary

Mycobacterium leprae, det agens af spedalskhed, ikke vokser in vitro. Vi beskriver en nem at følge protokollen til at forberede en bacillær suspension til at sikre opretholdelsen af store mængder M. leprae for en lang række applikationer. Protokoller til formering af mus footpad podning, evaluering af levedygtighed, nedfrysning og optøning bacillær bestand er beskrevet i detaljer.

Abstract

Spedalskhed, forårsaget af Mycobacterium leprae, er en vigtig smitsom sygdom, der stadig er endemisk i mange lande rundt om i verden, herunder Brasilien. Der er i øjeblikket ingen kendte metoder til at dyrke M. leprae in vitro, der udgør en betydelig hindring i studiet af dette patogen i laboratoriet. Derfor er vedligeholdelse og vækst af M. leprae-stammer udføres fortrinsvis i athymiske nøgne mus (NU-Foxn1 nu). De laboratoriebetingelser for anvendelse af mus er let tilgængelige, let at udføre og tillader standardisering og udvikling af protokoller for at opnå reproducerbare resultater. I denne rapport beskriver vi en enkel protokol til oprensning af baciller fra nøgne mus footpads hjælp trypsin, hvilket giver en suspension med minimal celle debris og med høj bakteriel levedygtighed indeks, som bestemt ved fluorescerende mikroskopi. En ændring til standardmetoden for bacillær tælling ved Ziehl-Neelsenfarvning og lysmikroskopi er også vist. Derudover beskriver vi en protokol for nedfrysning og optøning bacillær lagre som en alternativ protokol til vedligeholdelse og opbevaring af M. leprae-stammer.

Introduction

Spedalskhed, en sygdom forårsaget af Mycobacterium leprae, er et vigtigt offentligt sundhedsproblem i mange lande rundt om i verden 1,2. Trods bliver kendt som en smitsom sygdom, der påvirker både hud og perifere nerver er der stadig flere huller i viden om de involverede mekanismer i den komplekse immunopathogenesis af sygdommen.

Blandt de udfordrende karakteristika M. leprae der hindrer dens undersøgelse er dens manglende evne til at vokse i kunstig kultur medier og dens relativt lang fordobling tid (ca. 14 dage) 3,4. De fleste eksperimentelle procedurer, der anvender M. leprae er sat op med baciller oprenset fra hudlæsioner af spedalskhed patienter eller fra eksperimentelle dyremodeller, såsom bæltedyr og flere stammer af mus 5,6.

I mange år har forskere afhang oprensning af M. leprae fra hudlæsioner af multibacillary LeprOsy patienter til anvendelse i eksperimentelle procedurer. Adskillige laboratoriebetingelser for in vitro-dyrkning eller vedligeholdelse af levende M. leprae er blevet forsøgt, men til dato har dyremodeller vist sig at være mest egnet til forskningsformål. I 1960'erne og 1970'erne, forskere begyndte at bruge mus og bæltedyr til påvisning og vurdering af M. leprae levedygtighed, overvågning bakterievækst i respons på anti-M. leprae stoffer og i vækst og vedligeholdelse af mycobakterielle stammer 2,4.

De dyremodeller har nogle begrænsninger, især i bæltedyr og ikke-menneskelige primater, herunder etiske bekymringer, udgifter til vedligeholdelse, særlig nødvendige infrastruktur til vedligeholdelse dyr og dårlig reproducerbarhed af de resultater og de endelige udbytter. I øjeblikket mus er den foretrukne model dyr for spedalskhed forskning. De laboratoriebetingelser for anvendelse af mus er let tilgængelige, let at udføre og tillader standardiserede protokoller M. leprae-stammer, for selv med lave levedygtige bacillary belastninger, respons på T-celle deficiente immunrespons fører til overstrømmende granuloma og god bacillary multiplikation. Således har denne dyremodel vundet bredt accepteret inden for spedalskhed forskningsverdenen.

I denne rapport beskriver vi en enkel protokol til enzymatisk rensning af baciller fra nøgne mus trædepuder, der er beregnet til fremstilling af en M. leprae suspension med minimal cellerester og med høj bakteriel levedygtighed indeks. Levedygtigheden bestemmes ved fluorescensmikroskopi, som hurtigt kan udføres i laboratoriet. Vi demonstrerer også en ændring til standardmetoden for bacillær optælling af kulde Ziehl-Neelsen farvning og lysmikroskopi. Derudover præsenterer vi et alternativ protokol til vedligeholdelse og opbevaring af M. leprae-stammer, så nedfrysning og optøning af bacillary stocks.

Protocol

1.. Fremstilling af Mycobacterium leprae Suspension

  1. Før euthanizing den athymisk nøgne mus (NU-Foxn1 NU), forberede trypsinopløsning og kultur medier (Protokol af reagenser - Protokol nr. 1, 2 og 3). Aflive den nøgne mus 4-5 måneder efter podning med M. leprae ifølge AVMA retningslinjer for aflivning af dyr: 2013 Udgave 10 (forsøg og brug af billeder af dyr blev godkendt og gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Care Udvalg Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). Inde i en biologisk sikkerhed kabinet anvendes til håndtering af dyr, rense hele mus med 70% ethanol alkohol.
  2. Hold den bageste pote hjælp hæmostatiske pincet distalt for tarsal joint. Skær pote off med en saks under pincet og fordybe pote i 2% jod i 20 min. Derefter gentages proceduren for den anden bageste pote.
  3. Overfør poterne til enren biologiske sikkerhed fryser for det videre arbejde. Tag poter ud af de 2% jod, tørre dem med steril gaze og derefter indsamle de to footpads bruger nummer 22 eller 23 skalpelblad fjerne alle bløde væv (dermis, epidermis, sener og nerver) tæt til benet. Fjern mellemfodsknogler knogler og 1. og 5. phalanges. Anbring materialet i en steril petriskål og fjerne epidermis, ved at skrabe det af med skalpelbladets. Skær væv i små stykker med en saks og overføre dem til en rundbundet rør. Vægt vævet, og der tilsættes 1 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Hold røret på is for at undgå opvarmning af prøven.
  4. Tilføj yderligere 1 ml HBSS og homogenisere prøven ved hjælp af en vævshomogenisator.
    1. Første homogenisering cyklus: 3 pulser af 15 sekunder ved hastighed 4 (14.450 rpm).
    2. Supernatanten overføres til et sterilt 50 ml konisk rør, der passerer gennem en celle si for at fjerne resterende snavs. Lad opløsningen at passere gravity.
    3. Tilføj yderligere 2 ml HBSS og gentag homogenisering cyklus (afsnit 1.4.1), og passere prøverne gennem cellefilter igen.
    4. Skyl filteret ved at tilføje HBSS at rumfanget bringes op på 9 ml. Kassér cellefilter.
  5. Optø en alikvot af 0,5% trypsin-opløsning. Tilsæt 1 ml trypsin til 9 ml cellesuspension for at opnå en slutkoncentration på 0,05% trypsin. Kassér resterende optøet trypsin. Inkuber i 60 minutter i et 37 ° C vandbad. Efter inkubation bringe lydstyrken op til 40 ml ved tilsætning af sterilt saltvand for at fortynde trypsin.
  6. Centrifuger ved 1.700 x g i 30 min ved 4 ° C.
  7. Supernatanten ved forsigtigt at invertere røret. Resuspender pellet ved at banke på glasset, og derefter tilsættes 1 ml sterilt saltvand. Suspensionen overføres til en ny konisk rør måle det endelige volumen af ​​suspensionen (for at beregne udbyttet / gram væv).
  8. Homogeniseres bacillary suspension under anvendelse af en 1 ml insulinsprøjte med en 26 G kanyle, mens overførsel af suspensionen til et nyt rør.
  9. Udfør mikrobiologisk kontrol af suspensionen ved at placere to dråber (50 ul) af det i hvert medium: 7H9 og Lowenstein-Jensen-medium og inkuberes ved 37 ° C i 30 dage, til påvisning af kontaminerende mycobakterier. Tilsvarende pode en Brain Heart Infusion (BHI)-medium og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C til påvisning af kontaminerende aerobe bakterier.
  10. Afmål suspensionen i rør til farvning: 35 ul til Cold Ziehl-Neelsen farvning (protokol nr. 2), og 200 pi for levedygtighed bestemmelse (Protokol 3).
  11. Efter Ziehl-Neelsen farvning (ZN) beregne antallet af syrefaste baciller / ml (AFB / ml). For nøgne mus podning, forberede en 1 x 10 8 AFB / ml suspension, sørg for at have nok volumen til at pode 30 gl / trædepuden / dyr (Protokol 5), og holde suspensionen koldt indtil podning. Til frysning, forberede en 1 x 10 7 AFB / ml suspension (Protokol 4).

2. Kolde Ziehl-Neelsen Farvning

  1. Før du starter farvning forberede serum / phenolopløsning og ZN farvningsopløsninger (protokol af reagenser - protokol 4 og 5). Tegn tre cirkler (indvendig diameter 10 mm) på tre objektglas ved hjælp af en immunhistokemisk pen. Identificer de dias: (1) normale eller ufortyndet, (2) 01:10, og (3) 1:100 ved hjælp af en nummer 2 blyant (Bemærk: nogle grafit svinder ud efter ZN farvning).
  2. Den bacillær suspension (Trin 1.10) fortyndes til 1:10 og 1:100 seriefortyndinger, dvs tilsættes 5 ul ufortyndet suspension og 45 pi af saltvand, derefter tage 5 ul 1:10 og tilsæt 45 pi af saltvand.
  3. Tilsæt 5 ul af serum / phenolopløsning og 10 pi bacillær suspension pr cirkel. Homogeniseres og fordeles jævnt rundt om det område af cirklen med håndtaget på en engangs løkke. Vent til suspension til tørre på en nivelleret bord.
  4. Efter dregnskabsmæssige, løse smøre ved at vælte slide 3 gange over det blå flamme af en bunsenbrænder (omkring 20 sek i alt) 11.
  5. For farvning, dækker hele overfladen af ​​objektglasset med filtreret Ziehl-Neelsen carbofuchsine (ca. 5 ml) i 20 min.
  6. Skyl objektglasset i rindende vand (langsom flow).
  7. Dæk objektglasset med en 10% syre alkohol løsning til omkring 20 sek.
  8. Vask dias igen i rindende vand.
  9. Dæk objektglasset med en opløsning af methylenblåt i 5 min.
  10. Skyl slæden i rindende vand og lad det tørre ved stuetemperatur.
  11. Tæl 20 felter / cirkel (total 60 felter / slide) med en 100X oliebestandighedsobjektet. Beregningen af syrefaste baciller / ml (AFB / ml) gøres som følger, i henhold til beskrivelsen i laboratoriemetoder til spedalskhed 12:
    AFB / felt = samlet antal baciller, der findes i de 3 cirkler (60 felter) divideret med 60 år.
    AFB / ml = AFB / field x konstant (cirklens arealx 100 divideret med areal af objektivets blænde), og hvis en fortyndet suspension tælle, gange antallet af AFB / ml med fortyndingsfaktoren (10 eller 100).

3. Levedygtighed Bestemmelse

  1. Før du starter, skal du forberede autoklaverede M. leprae suspension (Protokol af reagenser - Protokol 7). Brug den relevante kit (se tabellen af reagenser og udstyr) til kvalitativ bestemmelse af M. leprae levedygtighed i suspensionen. Fortynd løsninger som følger (alle procedurer bør udføres under dæmpet lys): fortynd løsning A med en faktor 10 i saltvand (1 pi lager plus 9 pi saltvand), fortyndes løsning B 20 med en faktor på i saltvand (1 pi lager plus 19 pi saltvand).
  2. Tilføj 3,6 pi fortyndede opløsning A og 6 pi fortyndet opløsning B til 200 ul af bacillær suspension, der skal testes (trin 1.10). Et tidligere autoklaveret M. leprae suspension anvendes rutinemæssigt som etegativ kontrol for levedygtighed farvning.
  3. Inkuber suspensioner i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
  4. Centrifuger røret ved 10.600 x g i 5 min ved 4 ° C.
  5. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 15 pi af 10% glycerol. Påfør 8 pi til overfladen af ​​et rent objektglas og dække det med et lille dæksel slip. Analyser dias ved hjælp af et fluorescerende mikroskop, der indeholder de passende filtre (se Molecular Probes henstillinger). Vurdere resultaterne ved at sammenligne syto 9 (Sy) farvning at propidiumjodid (PI) farvning.
    Bemærk: Sy pletten trænger 100% af både døde og levende bakterier, og PI pletten trænger kun bakterier med beskadigede membraner. Den autoklaverede suspension (negativ kontrol) kan danne klumper af bakterier på grund af tilstedeværelsen af ​​celleaffald. Den semikvantitativ skala, der anvendes for levende / død evaluering varierer fra 0 til 2 +; 0 indikerer, at mindre end 30% af cellerne er positive for PI plet, 1 + betyder at mellem 30 -50% af cellerne er positive for PI-plet, 2 + betyder mere end 50% af cellerne er positive for PI-pletten. En score på 0 betragtes mest hensigtsmæssige til brug.

4.. Frysning / optøning M. leprae Suspension

  1. Før du starter, skal du forberede frysning medium (Protokol af reagenser - Protokol 6). For frysning bruge nedenstående trin:
    1. Tilføj 150 pi af suspensionen indeholder 1 x 10 7 AFB / ml til en steril cryovialet sammen med 1 ml frysemedium.
    2. Placer cryovial i en indefrysning beholder og opbevares i beholderen ved -80 ° C i 24 timer.
    3. Overfør den frosne hætteglas til en opbevaringsboks og opbevar det ved -80 ° C.
  2. For optøning bruge de trin, der er beskrevet nedenfor:
    1. Fjern cryovial med den frosne suspension fra -80 ° C og placere den i et 37 ° C vandbad for at begynde at tø suspensionen.
    2. Hæld suspensionen i et rør indeholdende 20 ml steriltsaltvand. Bland suspensionen forsigtigt, indtil optøning er færdig.
    3. Centrifugér suspensionen i 30 min ved 1.700 x g ved 4 ° C.
    4. Supernatanten fjernes, og tilføje nok sterilt saltvand for at nå den ønskede lydstyrke. Homogeniseres suspensionen ved at lede den gennem en sprøjte (trin 1.8).
    5. For ZN farvning, levedygtighed beslutsomhed og podning, følg protokol 2, 3 og 5.

5.. Mus Podning

  1. To mennesker er nødvendige for denne procedure, at man begrænse musen og en anden til at administrere inokulum. Dyret skal podes skal håndteres i henhold til etiske retningslinjer og regler, og alle procedurer skal godkendes af den institutionelle Dyrepleje og brug udvalg. Begrænse den nøgne mus ved nakkeskindet med poterne opad.
  2. Homogeniseres suspensionen ved passage gennem en 26 G nål. Med en 1 ml sprøjte, aspirat nok bacillær suspension til inoculate to fodplader (30 ul / trædepuden).
  3. Hold bagpote rengøre trædepude med 70% ethanol alkohol forud for injektion og indføre nålen intradermalt med facet af nålen peger opad fra den proximale til den distale side af trædepuden. Der indsprøjtes 30 ul af suspensionen. Trædepuden injektioner kan udføres i bedøvede mus.
  4. Vent 5 sekunder før nålen trækkes ud af huden for at undgå reflux af inoculum. Mus bør anbringes på blødt underlag indlæg podning, og bør overvåges ambulation og tegn på selv-lemlæstelse.

Representative Results

Succesen af ​​protokollen kan vurderes på tre måder. Først evaluering af kvaliteten af ​​inoculum bestemmes af mængden af ​​cellerester, og den resulterende andel af levedygtige baciller i den endelige suspension (se protokol nr. 3). Som vist i figur 1 og 2, det endelige bacillær suspension indeholdt meget lidt cellerester og høj levedygtighed (score 0 +), bemærk, at de fleste baciller farvet med syto 9 grønt fluorescerende plet (plet trænger 100% af både døde og levende bakterier, figur 1), og kun få baciller farvet med den røde PI fluorescerende plet (plet trænger kun bakterier med beskadigede membraner, figur 2).

Figur 1
Figur 1. Syto 9 farvning af M. leprae suspension. Grøn fluorescens viser tilstedeværelsen af levende og døde M. leprae. 400X.

Figur 2
Figur 2. PI farvning af M. leprae suspension. rød fluorescens viser det lille antal døde M. leprae. 400X.

For det andet vil et inokulum med høj levedygtighed indflydelse på den mangedobling af baciller i footpads af dyr efter 4-5 måneder efter inokulering med udvikling af indlysende makroskopisk læsion, som vist i videoen (Protokol 1). Den tredje måde at vurdere resultatet af protokollen er ved at evaluere overleve og formere AFB i mus trædepuder podet med bakterier, der havde været nedfrosset i forskellige perioder (se protokol nr. 4).

"Cellspacing =" 0 "> Eksperiment (dyr) Antal AFB / ml frossen på dag 0 Levedygtighed score / dag 0 Frysning periode (dage) Antallet af AFB inokuleret efter frysning Levedygtighed score efter frysning Antal AFB / ml inddrives efter 7 måneders 1 (1) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 2,3 x 10 8 1 (2) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 3,8 x 10 7 1 (3) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 8,5 x 10 7 1 (4) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 <td> 1 + 4,6 x 10 7 2 (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 1,7 x 10 7 2 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 4,8 x 10 6 2 (3) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 8,6 x 10 6 3 (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,2 x 10 7 3 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (3) 1,0 x 10 7 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (4) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 2,6 x 10 7 3 (5) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 3,7 x 10 6

Tabel 1. Resultater af M. leprae multiplikation ved hjælp af indlæg frysning suspensioner.

Tabel 1 viser resultaterne af M. leprae vækst ved hjælp af suspensioner efter frysning. Levedygtighed score af de suspensioner efter optøning var 1 +. Protokol Indefrysningen blev udført i tre uafhængige eksperimenter for at teste forskellige frysning perioder. I begge forsøg med inokula nedfrosset i 15 eller 60 dage, resultatet var ens, s.ropagation efter frysning gav 10-1,000 gange stigning i antallet af AFB tilbagesøges fra hver trædepude efter 7 måneders podning (tabel 1). Derfor indefrysning af M. leprae suspensioner i 7H9 medium suppleret med OADC (oliesyre-albumin-dextrose-katalase) resulterede i opretholdelsen af levedygtigheden.

Tre podestoffer blev anvendt til at evaluere M. leprae multiplikation efter to forskellige fryse perioder (15 og 60 dage). Efter 7 måneder blev baciller inddrives fra trædepuder af podede mus og tælles efter Ziehl-Neelsen farvning. Semikvantitativ levedygtighed skala: 0 betyder fraværende op til 30% af PI farvede celler, 1 + betyder at mellem 30-50% af PI farvede celler, 2 + betyder over 50% af PI farvede celler. AFB: syrefaste baciller.

Discussion

En detaljeret beskrivelse af en godt illustreret, succesfuld protokol til opformering af M. leprae er stærkt behov. Vores undersøgelse viser, at protokollen podestof fremstilling ved filtrering og trypsinfordøjelse tillader inokula, der skal opnås med meget lidt celleaffald og med høj levedygtighed baciller (score 0 +). Natriumhydroxid er blevet anvendt til at opdele vævet til oprensning af baciller 6. Undersøgelser udført i vores laboratorium under anvendelse af natriumhydroxid til oprensning af M. leprae resulterede i dannelse af klumper af baciller, hæmmer homogenisering af suspensionen for levedygtighed bestemmelse og dyrs podning (data ikke vist).

Potentielle problemer med præparatet inokulum ved filtrering og trypsinfordøjelse omfatter store mængde celleaffald og forurening af inokulum med bakterie-eller svampe-midler. I tilfælde af store mængder cellulært debrer observeres efter rensning, enten trypsin ikke længere er aktiv, eller der er en stor mængde af biologisk materiale. Enzymatiske aktivitet af trypsin stamopløsning skal vurderes. Hvis der er mistanke om overdreven mængde indledende biologisk materiale, skal materialet opdeles i portioner, og protokollen bør udføres i separate sæt. For at undgå forurening af inoculum med bakterie-eller svampe agenter, skal der drages omsorg for at behandle materialet under aseptiske forhold. Hvis der opdages svampe-og / eller bakteriel forurening suspensionen bør kasseres.

En begrænsning af vores protokol er subjektivitet levedygtighed evalueringen ved hjælp af den beskrevne semi-kvantitativ metode. Levedygtighed vurderet semikvantitativt er mere praktisk, selv om mindre præcis end den offentliggjorte kvantitative metode 6. Levedygtighed score på 0 + og 1 + er tilfredsstillende for vedligeholdelse af formering og nedfrysning afM. leprae. Lahiri et al. har allerede vist, at nøgne mus podet med 80-90% levedygtige inokulum resultere i trædepuder egnede til høst (høj levedygtighed baciller) ved 4-5 måneders inokulering. Derfor er tidlig infektion (omkring 4 måneder) er det bedste høsttidspunktet. Til høst af frossen inokulum blev musene i denne protokol opretholdes podet i længere perioder (7 måneder) og garanterer vækstkurver. Et kritisk trin for at sikre passende levedygtighed anvendelse af friske bacilli suspensioner, fortrinsvis inden for 24 timer efter indsamling af biologisk materiale fra værten og forarbejdning. Desuden kvaliteten af ​​de reagenser, frisk tilberedte fortyndet trypsin og levedygtighed farvningsopløsninger, er nødvendige for at sikre reproducerbare resultater.

En anden begrænsning af denne protokol er, at den endelige M. leprae suspension er ikke fri for værts-DNA, RNA, protein osv. Derfor skal andre rensningstrin tilføjes to opnå en M. leprae suspension fri for værtscellekomponenter.

En metode til at opretholde levedygtige baciller ved frysning hele vævsprøver M. leprae læsioner er blevet rapporteret 9. Men undersøgelsen af Portaels et al. viste signifikant tab af levedygtighed, der spænder mellem 65-97% efter nedfrysning og optøning af M. leprae inficerede vævsprøver opnået fra bæltedyr 9. Vores protokol viste, at levedygtighed indekset observeret i M. leprae suspensioner efter nedfrysning og optøning faldt i forhold til den alikvot, der ikke havde været frosset (tabel 1). Faktisk frysning M. leprae suspension i indefrysning medier gav levedygtighed spænder fra 50-70%, med levedygtighed score 1 +, mens levedygtigheden score 0 + blev opnået i ufrossent suspension. Ikke desto mindre, formering af M. leprae var tilfredsstillende efter 7 måneder efter podning af nøgne mus ( M. leprae suspension i fryse medier, i stedet for inficerede vævsprøver, er mere effektiv. Et kritisk trin i vores protokol er langsom frysning af AFB i et fryserum beholder, som er nødvendig for at opretholde levedygtige baciller, som påvist ved Colston og Hilson 8. Vil blive gennemført fremtidige eksperimenter for at vurdere levedygtigheden af ​​baciller efter længere frysning perioder.

Sammenfattende fordi M. leprae ikke vokser in vitro, vores protokol giver mulighed for en hurtig og nem alternativ til vedligeholdelse af levedygtige inokulum, og den vellykkede frysetrinnet muliggør opretholdelse af stammer uden løbende passage i dyr, således at etableringen af en bank af definerede stammer.

Dette afsnit indeholder instruktioner til forberedelse reagenser til at udføre denne protokol.

1.. Trypsin

Trypsin 0,5 g
Destilleret vand op til 100 ml

Filtersteriliser. Opbevar ved -20 ° C.

2. 7H9

7H9 bouillon basen 4,7 g
40% glycerol stock 5 ml
Destilleret vand op til 900 ml

Bland base med vand og derefter tilføje glycerol under omrøring. Autoklave ved 121 ° C i 20 minutter for at sterilisere. Opbevares ved 4 ° C.

3. Hjerne-hjerte-infusion (BHI)

BHI 37 g
Destilleret vand op til 1.000 ml

Autoklave ved 121 ° C i 15 minutter for at sterilisere. Opbevares ved 4 ° C.

4.. Phenol serum

4.1) 5% phenol

Phenol 5 ml
Destilleret vand op til 100 ml

4.2) Serum phenol

kalvefosterserum 2 ml
5% phenol 98 ml

Opbevares ved 4 ° C.

5.. Løsninger til kold Ziehl-Neelsen Stain

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin 1 g
Phenol krystaller fusioneret til 60 ° C 5 ml
Ren ethylalkohol 10 ml
Destilleret vand op til 100 ml

Filter før hver brug.

5.2) methylenblåt Base

Methylenblåt 3 g
95% ethylalkohol op til 200 ml

5.3) Alkohol syre

70% alkohol 990 ml
chloridric syre 10 ml

6.. Medium til frysning:

OADC 10 ml
Glycerol 20 ml
7H9 medium op til 100 ml

Autoklave glycerol før brug og sterilisere OADC ved filtrering.

7.. Autoklaveret M. leprae suspension

Autoklave ved 121 ° C i 20 min. Opbevar ved -20 ° C.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro og Claudia PM Carvalho til teknisk bistand. Vi takker Pranab K. Das for at støtte etableringen af ​​dyret facilitet. Vi takker Lais RR Costa for revision af manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Fundação Paulista contra Hanseníase og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BacLight Bacterial Viability Kit Invitrogen; Molecular Probes L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9269
Cryo 1 °C Freezing Container Nalgene 5100001
Lowenstein-Jensen medium LB Laborclin 901122
Saline TEK Nova Inc S5812
Pen Dako S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base TPP 91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon BD Falcon 352340
Trypsin Sigma T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base Sigma-Aldrich M0178 Fluka
Glycerol Gibco BRL 15514011
Brain heart infusion (BHI) Oxoid LTDA CM1135
Fuchsin Merck Millipore 1159370025
Phenol  Invitrogen 15509037
Ethyl alcohol Merck Millipore EX02764
Cloridric acid Merck 1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) Becton Dickinson 211886
Fetal bovine serum Gibco; LifeTechnologies 26140079

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saúde, M. inistérioda, Brasil, Secretaria de Vigilância em Saúde: situação epidemiológica da hanseníase no Brasil. Informe epidemiológico 2008. Forthcoming.
  2. Scollard, D. M., Adams, L. B., Gillis, T. P., Krahenbuhl, J. L., Truman, R. W., Williams, D. L. The continuing challenges of leprosy. Clin. Microbiol. Rev. 19, (2), 338-381 (2006).
  3. Rosa, P. S., Belone, A. deF., Lauris, J. R., Soares, C. T. Fine-needle aspiration may replace skin biopsy for the collection of material for experimental infection of mice with Mycobacterium leprae and Lacazia loboi. Int. J. Infect. Dis. 14, 49-53 (2010).
  4. Truman, R. W., Krahenbuhl, J. L. V. iableM. leprae as a research reagent. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 69, (1), 1-12 (2001).
  5. Levy, L., Ji, B. The mouse foot-pad technique for cultivation of Mycobacterium leprae. Lepr. Rev. 77, (1), 5-24 (2006).
  6. Lahiri, R., Randhawa, B., Krahenbuhl, J. Application of a viability-staining method for Mycobacterium leprae derived from the athymic (nu/nu) mouse foot pad. J. Med. Microbiol. 54, (3), 235-242 (2005).
  7. Katoch, V. M. The contemporary relevance of the mouse foot pad model for cultivating. 80, (2), 2-120 (2009).
  8. Colston, M. J., Hilson, G. R. The effect of freezing and storage in liquid nitrogen on the viability and growth of Mycobacterium leprae. J. Med. Microbiol. 12, (1), 1-137 (1979).
  9. Portaels, F., Fissette, K., De Ridder, K., Macedo, P. M., De Muynck, A., Silva, M. T. Effects of freezing and thawing on the viability and the ultrastructure of in vivo grown mycobacteria. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 56, (4), 580-587 (1988).
  10. American Veterinary Medical Association. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. Edition. Schaumburg, Illinois, USA, https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf. 1-102 (2013).
  11. Saúde, M. inistérioda, Brasil, Guia de procedimentos técnicos - Baciloscopia em hanseníase, Série A: Normas e manuais técnicos. (2010).
  12. Health Organization, W. orld, Geneva, Laboratory techniques for leprosy Forthcoming.
Optimerede protokoller til<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Strain Management: Frosne Stock bevarelse og vedligeholdelse i Atymiske Nude Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).More

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter