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Immunology and Infection

Optimierte Protokolle für doi: 10.3791/50620 Published: March 23, 2014

Summary

Mycobacterium leprae, der Erreger der Lepra, wächst nicht in vitro. Wir beschreiben eine einfach zu Protokoll folgen, um eine Suspension herzustellen Bazillen, die Wartung von großen Mengen von M. gewährleisten leprae für eine Vielzahl von Anwendungen. Protokolle für die Vermehrung von Maus Fußballen Impfung, die Bewertung der Rentabilität, Einfrieren und Auftauen bazilläre Lager im Detail beschrieben werden.

Abstract

Lepra, die durch Mycobacterium leprae verursacht wird, ist eine wichtige Infektionskrankheit, die immer noch endemisch ist in vielen Ländern der Welt, darunter Brasilien. Es gibt derzeit keine bekannten Verfahren zum Züchten von M. leprae in vitro und präsentiert ein großes Hindernis in der Studie des Erregers im Labor. Daher ist die Erhaltung und das Wachstum von M. leprae-Stämme werden vorzugsweise in Nacktmaus (NU-Foxn1 nu) durchgeführt. Die Laborbedingungen unter Verwendung von Mäusen sind leicht zugänglich, einfach durchzuführen und ermöglicht die Standardisierung und Entwicklung von Protokollen zur Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Reinigung von Bazillen von Nacktmaus Fußballen unter Verwendung von Trypsin, die eine Suspension mit minimalem Zelltrümmer und mit hoher Lebensfähigkeit der Bakterien-Index ergibt, wie durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Eine Änderung der Standardmethode für bazilläre Zählen von Ziehl-NeelsenFärbung und Lichtmikroskopie wird auch demonstriert. Zusätzlich beschreiben wir ein Protokoll zum Einfrieren und Auftauen bacillary Bestände als alternatives Protokoll für die Wartung und Lagerung von M. leprae-Stämme.

Introduction

Lepra, eine Krankheit, die durch Mycobacterium leprae verursacht wird, ist ein wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit in vielen Ländern auf der ganzen Welt 1,2. Obwohl es als eine Infektionskrankheit, die sowohl Haut-und peripheren Nerven wirkt bekannt, gibt es noch einige Lücken im Wissen über die Mechanismen in der komplexen Immunpathogenese der Erkrankung beteiligt sind.

Unter den herausfordernden Eigenschaften von M. leprae, der seine Studie behindern seiner Unfähigkeit, in künstlichen Nährmedien und seine relativ lange Verdopplungszeit (ca. 14 Tage) 3,4 wachsen. Die meisten experimentellen Verfahren, die M. benutzen leprae sind mit Bazillen von Hautläsionen der Lepra-Patienten oder von experimentellen Tiermodellen, wie Gürteltiere und verschiedene Stämme von Mäusen 5,6 gereinigt eingestellt.

Seit vielen Jahren haben die Forscher auf die Reinigung von M. hing leprae von Hautläsionen der multibacillary LEPRosy Patienten für den Einsatz in experimentellen Verfahren. Mehrere Laborbedingungen für die in vitro-Kultivierung oder Wartung von lebenden M. leprae sind versucht worden, aber bis heute haben Tiermodellen erwiesen sich als am besten geeignet für Forschungszwecke. In den 1960er und 1970er Jahren begannen die Forscher mit Mäusen und Gürteltiere zur Erfassung und Bewertung von M. leprae Lebensfähigkeit Überwachen bakteriellen Wachstums in Reaktion auf Anti-M. leprae Drogen und das Wachstum und die Pflege von mycobakteriellen Stämmen 2,4.

Die Tiermodelle haben einige Einschränkungen, vor allem in Gürteltiere und nicht-menschlichen Primaten, einschließlich des ethischen Bedenken, Kosten für Wartung, besondere Infrastruktur für die Tierwartungsaufwand und schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und Abschluss Erträge. Derzeit sind Mäuse die bevorzugte Tiermodell für Lepra-Forschung. Die Laborbedingungen unter Verwendung von Mäusen sind leicht zugänglich, leicht durchzuführen, und für einen standardisierten Protokollen M. verwendet leprae-Stämme, weil auch bei geringen Lasten lebensfähigen Bazillen führt die T-Zell-Immunantwort auf mangelhaft üppigen Granulome und gute bazilläre Multiplikation. So hat dieses Tiermodell breite Akzeptanz in der Lepra-Forschung gewonnen.

In dem vorliegenden Bericht ein einfaches Protokoll zur enzymatischen Reinigung von Bazillen von Nacktmaus Fußballen beschreiben wir, für die Zubereitung eines M. bestimmt leprae Suspension mit minimaler Zelltrümmer und mit hohen Keimfähigkeit Index. Die Tragfähigkeit wird durch Fluoreszenz-Mikroskopie, die sich schnell im Labor durchgeführt werden können, bestimmt. Wir haben auch eine Modifikation der Standard-Methode für bazilläre Zählung durch Kalt Ziehl-Neelsen-Färbung und Lichtmikroskopie zu demonstrieren. Zusätzlich stellen wir ein alternatives Protokoll für die Wartung und Lagerung von M. leprae-Stämme, so dass Einfrieren und Auftauen von bazilläre stocks.

Protocol

1. Herstellung von Mycobacterium leprae Hänge

  1. Vor euthanizing die athymischer Maus (NU-Foxn1 nu), bereiten Sie die Trypsin-Lösung und Kulturmedien (Protokoll der Reagenzien - Protokolle 1, 2 und 3). Euthanize die Nacktmäuse 4-5 Monate nach der Inokulation mit M. leprae nach den AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren: 2013 Ausgabe 10 (die Experimente und Verwendung von Bildern von Tieren genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege-Ausschuss der Faculdade de Odontologia de Bauru, USP durchgeführt). In einem biologischen Sicherheitsschrank für den Umgang mit Tieren, reinigen Sie die gesamte Maus mit 70% Ethanol Alkohol verwendet.
  2. Halten Sie die hintere Pfote mit Arterienklemmen distal zum Sprunggelenk. Schneiden Sie die Pfote mit einer Schere unter der Zange und tauchen die Pfote in 2% Jod für 20 min. Dann wiederholen Sie den Vorgang für die andere Hinterpfote.
  3. Übertragen Sie die Pfoten einsauber biologischen Sicherheitsschrank für die weitere Arbeit. Nehmen Pfoten aus dem 2% Jod, trocknen Sie sie mit steriler Gaze und dann sammeln Sie die beiden Straßenräuber mit der Nummer 22 oder 23 Skalpellklinge, die Beseitigung aller Weichgewebe (Dermis, Epidermis, Sehnen und Nerven) in der Nähe bis auf die Knochen. Entfernen Sie die Mittelfußknochen Knochen und die 1. und 5. Fingerglieder. Legen Sie das Material in einer sterilen Petrischale und entfernen Sie die Epidermis, durch Abkratzen mit dem Skalpell. Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke mit Schere und übertragen Sie sie auf einem Rundrohr. Gewicht der Gewebe-und 1 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Halten Sie das Röhrchen auf Eis zu vermeiden Aufwärmen der Probe.
  4. Einen weiteren hinzufügen 1 ml HBSS und homogenisieren die Probe mit einem Gewebe-Homogenisator.
    1. Erste Homogenisierung Zyklus: 3 Impulse von 15 Sekunden bei Stufe 4 (14.450 rpm).
    2. Den Überstand in einen sterilen 50 ml konischen Röhrchen, indem es durch ein Sieb, um die Zelltrümmer zu beseitigen übrigen. Lassen Sie die Lösung durch gra gebenvität.
    3. Fügen Sie eine zusätzliche 2 ml HBSS, und wiederholen Sie den Zyklus der Homogenisierung (Abschnitt 1.4.1), und übergeben Sie die Proben durch die Zelle Sieb wieder.
    4. Spülen Sie das Sieb durch Zugabe von HBSS, um die Lautstärke zu 9 ml zu bringen. Entsorgen Sie die Zelle Sieb.
  5. Tauwetter ein Aliquot von 0,5% Trypsin-Lösung. 1 ml Trypsin auf die 9 ml der Zellsuspension in einer Endkonzentration von 0,05% Trypsin erhalten. Entsorgen verbleibenden aufgetaut Trypsin. Inkubation für 60 min in einem 37 ° C Wasserbad. Nach der Inkubation bringe das Volumen auf 40 ml durch Zugabe von steriler Kochsalzlösung, um das Trypsin zu verdünnen.
  6. Zentrifugieren bei 1700 × g für 30 min bei 4 ° C.
  7. Verwerfen des Überstandes durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens. Das Pellet durch Tippen auf das Rohr und dann 1 ml steriler Kochsalzlösung. Die Suspension in einem neuen konischen Röhre Messung des Endvolumens der Suspension (die Ausbeute / Gramm Gewebe zu berechnen).
  8. Homogenisieren bazilläre Suspension mit einer 1 ml Insulin-Spritze mit einer 26 G-Nadel während der Übertragung der Suspension in ein neues Röhrchen.
  9. Führen mikrobiologische Kontrolle der Suspension, indem 2 Tropfen (50 ul) des in jedem Medium: 7H9 und Löwenstein-Jensen Medium, und Inkubation bei 37 ° C für 30 Tage, zum Nachweis von Mycobakterien kontaminiert. Ebenso inokulieren eine Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Medium beimpft und 24 Stunden bei 37 ° C, für den Nachweis von kontaminierenden aeroben Bakterien.
  10. Aliquot der Suspension in Rohre für die Färbung: 35 ul Cold Ziehl-Neelsen-Färbung (Protokoll 2) und 200 ul für die Lebensfähigkeit (Protokoll 3).
  11. Nach Ziehl-Neelsen-Färbung (ZN), die Berechnung der Anzahl der säurefesten Bazillen / ml (AFB / ml). Für Nacktmäusen Impfung, bereiten eine 1 x 10 8 AFB / ml Suspension; stellen Sie sicher, genügend Volumen, um 30 ul / Fußballen / Tier (Protokoll 5) impfen zu haben, und halten Sie die Suspension kalt, bis der Impfung. Zum Einfrieren, bereiten eine 1 x 10 7 AFB / ml susRente (Protokoll Nr. 4).

2. Kalte Ziehl-Neelsen-Färbung

  1. Vor Beginn der Färbung, bereiten Sie das Serum / Phenol-Lösung und die ZN-Färbung Lösungen (Protokoll der Reagenzien - Protokolle 4 und 5). Zeichnen Sie drei Kreise (Innendurchmesser 10 mm) auf drei Glasobjektträger mit einem Immunhistochemie Stift. Identifizieren Sie die Folien: (1) normal oder unverdünnt, (2) 1:10, und (3) 1:100 mit einer Nummer 2 Bleistift (Anmerkung: einige Graphit blendet sich nach ZN-Färbung).
  2. Verdünnen Sie die Bazillen-Suspension (Schritt 1.10) um 1:10 und 1:100 Verdünnungen, dh mit 5 ul der unverdünnten Suspension und 45 ul von Kochsalzlösung, dann nehmen Sie 5 ul 1:10 und fügen Sie 45 ul der Kochsalzlösung.
  3. Mit 5 ul Serum / Phenollösung und 10 ul Suspension pro bacillary Kreis. Homogenisieren und gleichmäßig verteilt rund um den Bereich des Kreises mit dem Griff eines Einweg-Schleife. Warten Sie, bis die Suspension auf eine ebene Tisch trocknen.
  4. Nach dBuch, fixieren Sie die Abstrich, indem die Folie 3 mal über die blaue Flamme eines Bunsenbrenners (ca. 20 sec insgesamt) 11.
  5. Zur Färbung, bedecken die gesamte Oberfläche der Folie mit filtriert Ziehl-Neelsen carbofuchsine (etwa 5 ml) für 20 min.
  6. Spülen Sie die Folie in fließendem Wasser (langsam Fluss).
  7. Decken Sie die Folie mit einem 10%-Alkohollösung für etwa 20 Sekunden.
  8. Waschen Sie die Folie in fließendem Wasser.
  9. Decken Sie die Folie mit einer Methylenblau-Lösung für 5 min.
  10. Spülen Sie die Folie in fließendem Wasser und lassen Sie es trocken bei Raumtemperatur.
  11. Graf 20 Felder / Kreis (insgesamt 60 Felder / Dia) mit einem 100X-Ölimmersionsobjektiv. Die Berechnung der Säure Bazillen / ml (AFB / ml) wird wie folgt nach der Beschreibung in der Labortechnik für Lepra 12 getan,:
    AFB / field = Gesamtzahl der Bazillen in den drei Kreisen (60 Felder), geteilt durch 60 gefunden.
    AFB / ml = AFB / Feld x Konstante (Fläche des Kreisesx 100 dividiert durch Fläche der Objektivlinsenöffnung), und wenn das Zählen einer verdünnten Suspension, multiplizieren die Anzahl der AFB / ml mit dem Verdünnungsfaktor (10 oder 100).

3. Lebensfähigkeit

  1. Bevor Sie beginnen, bereiten die autoklaviert M. leprae Suspension (Protokoll der Reagenzien - Protokoll 7). Verwenden Sie das entsprechende Kit (siehe Tabelle der Reagenzien und Geräte) zur qualitativen Bestimmung von M. leprae Fähigkeit in der Suspension. Verdünnen Sie die Lösungen wie folgt (alle Verfahren sollten unter Schwachlicht durchgeführt werden): verdünnte Lösung A mit einem Faktor von 10 in der Kochsalzlösung (1 ul Bestand plus 9 ul Kochsalzlösung), verdünnte Lösung B 20 mit einem Faktor von in Kochsalzlösung (1 ul Lager zzgl. 19 ul Kochsalzlösung).
  2. Add 3,6 ul der verdünnten Lösung A und 6 ul der verdünnten Lösung B und 200 ul der Suspension der Bazillen zu prüfen (Schritt 1.10). Ein zuvor autoklaviert M. leprae Suspension wird routinemäßig als eine verwendetegative Steuer für die Lebensfähigkeit Färbung.
  3. Suspensionen die Proben für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  4. Das Röhrchen bei 10.600 × g für 5 min bei 4 ° C.
  5. Überstand verwerfen und das Pellet in 15 ul 10% Glycerin. Bewerben 8 ul auf die Oberfläche einer sauberen Glasobjektträger und bedecken Sie es mit einem kleinen Deckglas. Analysieren Sie die Folie mit einem Fluoreszenz-Mikroskop, die entsprechenden Filter enthält (siehe Molecular Probes Empfehlungen). Bewerten Sie die Ergebnisse durch einen Vergleich Syto 9 (Sy) Färbung an Iodid (PI)-Färbung Propidium.
    Hinweis: Sy Fleck eindringt 100% der beiden tot und lebendig Bakterien und PI-Färbung dringt nur Bakterien mit beschädigten Membranen. Die autoklavierte Suspension (Negativkontrolle) können Klumpen von Bakterien durch die Anwesenheit von Zelltrümmern zu bilden. Die semiquantitativen Skala für Live / Dead-Auswertung verwendet wird, variiert von 0 bis 2 +, 0 bedeutet, dass weniger als 30% der Zellen positiv für PI-Färbung sind; 1 + Mittel zwischen 30 -50% der Zellen positiv für PI-Färbung; 2 + bedeutet, dass mehr als 50% der Zellen positiv für PI-Färbung sind. Ein Wert von 0 wird als für die meisten ausreichend.

4. Einfrieren / Auftauen M. leprae Hänge

  1. Bevor Sie beginnen, bereiten die Gefriermedium (Protokoll der Reagenzien - Protokoll 6). Zum Einfrieren, verwenden Sie die nachfolgend beschriebenen Schritte:
    1. Jeweils 150 ul der Suspension, die 1 x 10 7 AFB / ml in ein steriles Kryoröhrchen mit 1 ml Gefriermedium.
    2. Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einen Gefrierbehälter und den Behälter bei -80 ° C für 24 Stunden.
    3. Übertragen Sie die gefrorene Fläschchen auf ein Speicherfeld und speichern Sie es bei -80 ° C
  2. Zum Auftauen, verwenden Sie die nachfolgend beschriebenen Schritte:
    1. Entfernen Sie die Kryoröhrchen mit dem gefrorenen Suspension von -80 ° C und legen Sie sie in einem 37 ° C warmen Wasserbad zu starten Auftauen der Suspension.
    2. Gießen der Suspension in ein Röhrchen mit 20 ml sterilemKochsalzlösung. Mischen Sie die Suspension vorsichtig, bis Auftauen abgeschlossen ist.
    3. Zentrifugieren der Suspension für 30 min bei 1.700 × g bei 4 ° C.
    4. Überstand verwerfen und fügen Sie genug steriler Kochsalzlösung, um die gewünschte Lautstärke zu erreichen. Homogenisieren der Suspension durch Durchleiten durch eine Spritze (Schritt 1.8).
    5. Für ZN-Färbung, die Lebensfähigkeit und Impfung folgen Protokolle 2, 3 und 5.

5. Maus-Impfung

  1. Zwei Personen sind für dieses Verfahren benötigt werden, um die Maus und ein weiteres zurückhalten, um den Impfstoff zu verabreichen. Das Tier geimpft werden sollte, nach ethischen Richtlinien und Vorschriften behandelt und alle Verfahren müssen von der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss genehmigt werden. Rain die Nacktmaus durch das Genick des Halses mit den Pfoten nach oben ein.
  2. Homogenisieren der Suspension, indem es durch eine 26 G-Nadel. Mit einer 1 ml Spritze absaugen genug bazilläre Suspension Inokulate zwei Straßenräuber (30 ul / Fußballen).
  3. Halten Sie die hintere Pfote, reinigen Sie die Pfotenballen mit 70% Ethanol Alkohol vor der Injektion und mit dem Kegel der Nadel einzuführen, die Nadel nach oben zeigt intradermal, vom proximalen zum distalen Seite der Fußballen. Injizieren 30 ul der Suspension. Die Fußballen Injektionen können bei narkotisierten Mäusen durchgeführt werden.
  4. Warten Sie 5 Sekunden vor Zurückziehen der Nadel aus der Haut bis zum Rückfluss des Inokulums zu vermeiden. Mäuse sollten auf weichen Betten nach der Inokulation untergebracht werden, und Gehfähigkeit und Anzeichen von Selbstverstümmelung sollten überwacht werden.

Representative Results

Der Erfolg des Protokolls kann auf drei Arten bewertet werden. Zuerst wird Bewertung der Qualität des Inokulums durch die Menge der Zelltrümmer und die resultierende Prozentsatz der lebensfähigen Bazillen in der endgültigen Suspension (siehe Protokoll Nr. 3) bestimmt. Wie in den 1 und 2 gezeigt, der letzte bazilläre Suspension enthalten sehr wenig Zelltrümmer und hohe Rentabilität (Score 0 +), beachten Sie, dass die meisten Bazillen mit dem Syto 9 grün fluoreszierenden Fleck (Fleck eindringt 100% der beiden tot und lebendig Bakterien befleckt, Figur 1) und ist nur wenige Bazillen mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff PI (Fleck dringt nur Bakterien mit beschädigten Membranen, Fig. 2) gefärbt.

Figur 1
Fig. 1 ist. Syto 9 Anfärbung M. leprae Federung. Grüne Fluoreszenz zeigt die Anwesenheit von lebendig und tot M. leprae. 400X.

Figur 2
2. PI-Färbung von M. leprae Federung. Rote Fluoreszenz, die die kleine Zahl der Toten M. leprae. 400X.

Zweitens wird ein Inokulum mit hoher Rentabilität auf die Vermehrung der Bazillen in die Fußballen der Tiere nach 4-5 Monaten nach der Impfung beeinflussen, mit der Entwicklung von der Hand makroskopische Läsion, wie in dem Video (Protokoll 1). Der dritte Weg, um den Erfolg des Protokolls zu beurteilen ist durch die Auswertung der Überlebensrate und die Vermehrung von AFB in Maus-Straßenräuber mit Bazillen, die für verschiedene Zeiträume eingefroren worden war, angeimpft (siehe Protokoll Nr. 4).

"Cellspacing =" 0 "> Experiment (Tier) Anzahl der AFB / ml eingefroren am Tag 0 Die Lebensfähigkeit Punktzahl / Tag 0 Einfrieren Zeit (Tage) Anzahl der AFB nach dem Einfrieren geimpft Die Lebensfähigkeit Punktzahl nach dem Einfrieren Anzahl der AFB / ml nach 7 Monaten wieder 1 (1) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 2,3 x 10 8 1 (2) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 3,8 x 10 7 1 (3) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 8,5 x 10 7 1 (4) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 <td> 1 + 4,6 x 10 7 2 (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 1,7 x 10 7 2 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 4,8 x 10 6 2 (3) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 8,6 x 10 6 3 (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,2 x 10 7 3 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (3) 1,0 x 10 7 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (4) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 2,6 x 10 7 3 (5) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 3,7 x 10 6

Tabelle 1. Ergebnisse von M. leprae Multiplikation mit Post Einfrieren Suspensionen.

Tabelle 1 zeigt Ergebnisse der M. leprae Wachstum mit Suspensionen nach dem Einfrieren. Die Lebensfähigkeit Punktzahl der Suspensionen nach dem Auftauen war 1 +. Das Gefrierprotokoll wurde in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt, um die unterschiedliche Gefrierzeiten testen. In beiden Experimenten mit Inokula für 15 oder 60 Tage eingefroren, das Ergebnis war ähnlich, S.ropagation nach Einfrieren ergab 10-1000 Zeiten erhöhen die Zahl der AFB erholte sich von jedem Fußballen nach 7 Monaten der Inokulation (Tabelle 1). Daher das Einfrieren von M. leprae Suspensionen in 7H9-Medium mit OADC (Ölsäure-Albumin-Dextrose-Katalase) ergänzt führte Wartung der Lebensfähigkeit.

Drei Inokula wurden verwendet, um M. zu bewerten leprae Multiplikation nach zwei verschiedenen Gefrierzeiten (15 und 60 Tage). Nach 7 Monaten wurden Bazillen aus Fußballen von Mäusen geimpft erholt und nach Ziehl-Neelsen-Färbung gezählt. Semiquantitative Lebensfähigkeit Skala: 0 bedeutet bis zu 30% der PI-gefärbten Zellen fehlt; 1 + Mittel zwischen 30-50% der PI-gefärbten Zellen, 2 + bedeutet, über 50% der PI-gefärbten Zellen. AFB: säurefesten Stäbchen.

Discussion

Eine detaillierte Beschreibung eines gut veranschaulicht, erfolgreiche Protokoll für die Vermehrung von M. leprae wird dringend benötigt. Unsere Studie zeigt, dass das Protokoll von Inokulumzubereitung durch Filtration und Trypsin Verdauung kann der Inokula mit sehr kleinen Zelltrümmer und mit hoher Rentabilität von Bazillen erhalten (Score 0 +) werden. Natriumhydroxid wurde verwendet, um das Gewebe für die Reinigung von Bazillen 6 disaggregieren. Studien in unserem Labor mit Natronlauge zur Reinigung von M. durchgeführt leprae führte zur Bildung von Klumpen von Bazillen, behindern die Homogenisierung der Suspension für die Lebensfähigkeit und Tierimpfung (Daten nicht gezeigt).

Potenzielle Probleme mit der Inokulumzubereitung durch Filtration und Trypsin Verdauung angetroffen umfassen große Menge Zelltrümmer und Verunreinigungen des Inokulums mit bakteriellen oder Pilzmittel. Bei großen Mengen von Zell DEBRist, werden nach der Reinigung beobachtet, entweder Trypsin nicht mehr aktiv ist, oder es ist eine übermäßige Menge an biologischem Material. Die enzymatische Aktivität der Trypsin-Stammlösung ausgewertet werden. Wenn übermäßige Menge der ursprünglichen biologischen Material vermutet wird, sollte das Material aliquotiert werden und das Protokoll sollte in getrennten Ansätzen durchgeführt werden. Um eine Kontamination des Inokulums mit bakteriellen oder Pilzmittel zu vermeiden, muss darauf geachtet werden, das Material unter sterilen Bedingungen verarbeitet werden. Wenn Pilz-und / oder bakteriellen Kontamination festgestellt werden, sollten die Suspension verworfen werden.

Eine Begrenzung der Protokoll die Subjektivität der Lebensfähigkeit Auswertung unter Verwendung der beschriebenen halbquantitativen Methode. Die Lebensfähigkeit semi-quantitativ bewertet ist praktischer, wenn auch weniger präzise als die quantitative Methode 6 veröffentlicht. Die Lebensfähigkeit Bewertung von 0 + und 1 + zufriedenstellend sind für die Instandhaltung der Ausbreitung und das Einfrieren vonM. leprae. Lahiri et al. haben bereits gezeigt, dass Nacktmäusen mit 80-90% lebensfähig Impfstoff geimpft, führen zu Straßenräuber geeignet für die Ernte (hohe Lebensfähigkeit Bazillen) bei 4-5 Monaten der Impfung. Daher ist eine frühe Infektion (ca. 4 Monate) die beste Erntezeit. Für die Ernte von gefrorenen Inokula wurden die Mäuse in der vorliegenden Protokoll geimpften für längere Zeit (7 Monate) auf Wachstumskurven garantieren gehalten. Ein kritischer Schritt, um eine ausreichende Tragfähigkeit zu gewährleisten, ist die Verwendung von frischen Bazillen Suspensionen, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme von biologischem Material von dem Host und Verarbeitung. Außerdem Qualität der Reagenzien, frisch zubereitete verdünnten Trypsin und Lebensfähigkeit Färbelösungen, sind notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten.

Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist, daß die endgültige M. leprae Federung ist nicht frei von Wirts-DNA-, RNA-, Protein-, etc. Daher müssen andere Reinigungsschritte hinzugefügt werden to erhalten eine M. leprae Suspension frei von Wirtszellkomponenten.

Verfahren zum Aufrechterhalten einer lebensfähigen Bazillen durch Einfrieren gesamten Gewebeproben von M. leprae Läsionen berichtet worden 9. Allerdings ist die Studie von Portaels et al. zeigten einen signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit, die zwischen 65-97% nach dem Einfrieren und Auftauen von M. leprae infiziert Gewebeproben von Gürteltier 9 erhalten. Unser Protokoll gezeigt, dass die in M. beobachtet Lebensfähigkeit Index leprae Suspensionen nach Einfrieren und Auftauen fallen im Vergleich zu den Aliquots, die nicht fixiert (Tabelle 1) war. In der Tat, das Einfrieren des M. leprae Suspension in gefrierenden Medien ergab Lebensfähigkeit von 50-70%, mit Lebensfähigkeit Score 1 +, während die Lebensfähigkeit Punktzahl 0 + wurde in der nicht gefrorenen Suspension erhalten. Dennoch ist die Vermehrung von M. leprae war nach 7 Monaten nach der Inokulation von Nacktmäusen befriedigend ( M. leprae Suspension in Gefriermedium anstelle der infizierten Gewebeproben, ist effizienter. Ein entscheidender Schritt unseres Protokolls ist die langsame Einfrieren der AFB in einem Gefrierbehälter notwendig, die Bazillen lebensfähig zu halten, wie von Colston Hilson und 8 demonstriert. Zukünftige Experimente werden durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Bazillen nach längeren Perioden Einfrieren zu beurteilen.

Zusammenfassend, weil M. leprae nicht in vitro wachsen, ermöglicht unser Protokoll für eine schnelle und einfache Alternative für die Wartung von lebensfähigen Impfstoff, und die erfolgreiche Gefrierschritt ermöglicht die Wartung von Stämmen ohne kontinuierliche Durchgang bei Tieren, so dass die Gründung einer Bank von definierten Stämmen.

Dieser Abschnitt enthält Anweisungen für die Vorbereitung Reagenzien dieses Protokoll durchzuführen.

1. Trypsin

Trypsin 0,5 g
Destilliertes Wasser auf 100 ml

Filter zu sterilisieren. Lagerung bei -20 ° C.

2. 7H9

7H9-Bouillon-Basis 4,7 g
40% Glycerin Lager 5 ml
Destilliertes Wasser bis zu 900 ml

Mischen Sie den Boden mit Wasser, dann fügen Sie die Glycerin unter Rühren. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min sterilisiert. Lagern bei 4 ° C

3. Hirn-Herz-Infusion (BHI)

BHI 37 g
Destilliertes Wasser bis zu 1000 ml

Autoklaven bei 121 ° C für 15 min sterilisiert. Lagern bei 4 ° C

4. Phenol Serum

4.1) 5% Phenol

Phenol 5 ml
Destilliertes Wasser auf 100 ml

4.2) Serum Phenol

fötales Rinderserum 2 ml
5% Phenol 98 ml

Lagern bei 4 ° C

5. Lösungen für kalte Ziehl-Neelsen-Stain

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin 1 g
Phenol Kristallen auf 60 ° C geschmolzen 5 ml
Reinem Äthylalkohol 10 ml
Destilliertes Wasser auf 100 ml

Filter vor jedem Gebrauch.

5.2) Methylenblau Basis

Methylenblau 3 g
95% Ethylalkohol bis zu 200 ml

5.3) Alkohol-Säure

70% Alkohol 990 ml
aus Chlor 10 ml

6. Medium zum Einfrieren:

OADC 10 ml
Glycerol 20 ml
7H9 Medium auf 100 ml

Autoklav Glycerin vor dem Gebrauch und sterilisieren OADC durch Filtration.

7. Autoklaviert M. leprae Suspension

Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. Lagerung bei -20 ° C.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro und Claudia Carvalho Uhr für die technische Hilfe. Wir danken Pranab K. Das für die Unterstützung der Errichtung des Tieranlage. Wir danken Lais RR Costa für die Überarbeitung des Manuskripts. Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus Fundação Paulista contra Hanseníase Fundação de Amparo und à Pesquisa unterstützt tun Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BacLight Bacterial Viability Kit Invitrogen; Molecular Probes L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9269
Cryo 1 °C Freezing Container Nalgene 5100001
Lowenstein-Jensen medium LB Laborclin 901122
Saline TEK Nova Inc S5812
Pen Dako S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base TPP 91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon BD Falcon 352340
Trypsin Sigma T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base Sigma-Aldrich M0178 Fluka
Glycerol Gibco BRL 15514011
Brain heart infusion (BHI) Oxoid LTDA CM1135
Fuchsin Merck Millipore 1159370025
Phenol  Invitrogen 15509037
Ethyl alcohol Merck Millipore EX02764
Cloridric acid Merck 1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) Becton Dickinson 211886
Fetal bovine serum Gibco; LifeTechnologies 26140079

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Optimierte Protokolle für<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Dehnungs Management: Gefrorene Lizenz Erhaltung und Wartung in Nacktmaus
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Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).More

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).

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