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Immunology and Infection

のための最適化されたプロトコル doi: 10.3791/50620 Published: March 23, 2014

Summary

マイコバクテリウム·レプラ、ハンセン病の原因因子は、 インビトロで成長しない。我々は、M.大量の維持を確実にするために結核菌懸濁液を調製するためのプロトコルを以下に簡単に説明し様々なアプリケーションのためらい 。桿菌株を凍結融解マウス足蹠接種による伝播のためのプロトコル、生存性の評価は、詳細に記載されている。

Abstract

らい菌によって引き起こされるハンセン病はブラジルなど、世界中の多くの国でまだ流行している重要な感染症である。 M.を成長させるための既知の方法は現在ありませんらい菌のin vitro実験室でこの病原体の研究で大きな障害と提示する。そのため、Mの維持および増殖らい菌の菌株は、好ましくは、無胸腺ヌードマウス(NU-FOXN1ν)で行われる。マウスを用いた実験室条件は、実施が容易で容易に入手可能であり、再現性のある結果を達成するためのプロトコルの標準化および開発を可能にする。蛍光顕微鏡によって決定された本報告書では、最小限の細胞破片と、高細菌の生存率を有する懸濁液が得トリプシンを使用して、ヌードマウスのフットパッドから菌を精製するための単純なプロトコルを記述します。チールネルゼンによる桿菌カウントするための標準的な方法への修正染色し、光学顕微鏡にも実証されている。さらに、我々はMのメンテナンスや保管のための代替プロトコルとして凍結融解桿菌株のためのプロトコルを記述らい菌の菌株。

Introduction

ハンセン病は、 らい菌によって引き起こされる疾患は世界の1,2の多くの国で重要な公衆衛生問題である。皮膚や末梢神経の両方に影響を与え、感染症として知られているにもかかわらず、疾患の複雑な免疫病原性に関与する機構についての知識のいくつかのギャップが残っています。

Mの挑戦的な特性のうちその調査を妨げるらい菌は、人工培養培地で増殖することができないことと、比較的長い倍加時間(約14日) の3,4である。 M.を使用するほとんどの実験手順らい菌は、ハンセン病患者の皮膚病変から、あるいはそのようなアルマジロやマウス5,6のいくつかの株のような実験動物モデルから精製菌を使用して設定されています。

何年もの間、研究者はMの精製に依存していますらい菌多細菌性LEPRの皮膚病変から実験手順で使用するためのOSY患者。ライブMインビトロ培養やメンテナンスのためのいくつかの実験室の条件らい菌が試みられているが、今日まで、動物モデルは、研究目的のために最も適していることが判明した。 1960年代と1970年代に、研究者はMの検出と評価のために、マウスやアルマジロを使い始め抗Mに対応して、細菌の増殖をモニタリングらい菌の生存率、 らい菌薬、およびマイコバクテリア株の2,4の成長と維持に。

動物モデルは、倫理的な問題、メンテナンスのコスト、動物の維持のために必要な特別なインフラ、結果の再現性が悪いと最終利回りを含め、特にアルマジロとヒト以外の霊長類では、いくつかの制限があります。現在、マウスはハンセン病研究のための好ましいモデル動物である。マウスを用いた実験室条件は、実施が容易で、容易に入手可能であり、標準化されたプロトコルを可能、M.の維持に使用されている低くても実行可能な細菌性負荷で、T細胞欠損免疫応答があふれんばかりの肉芽腫形成と良好な細菌性の乗算につながるためらい菌菌株 。このように、この動物モデルは、ハンセン病研究コミュニティ内で広く受け入れを得ています。

今回の報告では、我々はヌードマウスのフットパッドからの菌の酵素を精製するための単純なプロトコルを記述し、Mの準備のために意図最小限の細胞破片と、高細菌の生存率とのらい菌サスペンション。生存率は急速に実験室で行うことができ、蛍光顕微鏡法によって決定される。また、コールドチールネルゼン染色および光学顕微鏡により桿菌カウントするための標準的な方法への変更を示しています。さらに、我々はMのメンテナンスや保管のための代替プロトコルを提示細菌性STの凍結融解を可能らい菌の菌株、ocks。

Protocol

1。 らい菌の懸濁液の調製

  1. 無胸腺ヌードマウス(NU-FOXN1 NU)を安楽死させる前に、トリプシン溶液と培養液の準備(試薬のプロトコル-プロトコル1、2、および3)。 Mとヌードマウス4〜5ヶ月の接種後に安楽死させる動物の安楽死のためのAVMAガイドラインに従ってらい :2013年版10(動物の像の実験および使用はFaculdadeデ·歯痛·デ·バウル(USP)の動物実験委員会のガイドラインに沿って承認され、実施された)。 70%エタノールアルコールで全体マウスをクリーニング、動物を処理するために使用される生物学的安全キャビネットの内側。
  2. 足根関節遠位止血鉗子を使って後足を開催しています。鉗子下のハサミで足を切断し、20分間、2%のヨウ素に足を浸す。その後、他の後足の手順を繰り返します。
  3. に足を転送今後の作業の生物学的安全キャビネットの清掃。 2%のヨウ素から足を取り、滅菌ガーゼでそれらを乾燥した後、骨の近くにすべての軟部組織(真皮、表皮、腱、および神経)を除去、数22または23メスの刃を使用して2フットパッドを集める。中足骨の骨と第一と第五指骨を取り除く。無菌ペトリ皿に材料を置き、メスの刃でそれを掻き落として、表皮を取り除いてください。ハサミで組織を小片にカットし、丸底チューブに転送。重量組織およびハンクス平衡塩溶液(HBSS)の1ミリリットルを加える。サンプルの暖避けるためにチューブを氷上に保管してください。
  4. HBSSの別の1ミリリットルを追加し、組織ホモジナイザーを使用してサンプルを均質化する。
    1. 最初の均質化サイクル:スピード4(14450 rpm)で15秒の3パルス。
    2. 残りの破片を除去するためにセルストレーナーを通過させること、無菌50mlコニカルチューブに上清を移します。ソリューションはGRAで通過できるようにVITY。
    3. HBSSの追加の2ミリリットルを追加し、均質化サイクル(1.4.1項)を繰り返し、再び細胞濾過器のサンプルを渡します。
    4. 9ミリリットルにボリュームを持ってHBSSを追加することにより、ストレーナを洗浄します。セルストレーナーを捨てる。
  5. 0.5%トリプシン溶液のアリコートを解凍する。最終濃度0.05%トリプシンを得るために細胞懸濁液を9mlに1mlのトリプシンを加える。残りの解凍したトリプシンを捨てる。 37℃の水浴中で60分間インキュベートする。インキュベーション後、トリプシンを希釈するために滅菌生理食塩水を添加することにより、40ミリリットルにボリュームを起動します。
  6. 4℃で30分間1700×gで遠心分離
  7. 慎重にチューブを反転させて上澄みを捨てる。チューブをタップしてペレットを再懸濁した後、滅菌生理食塩水1ミリリットルを加える。 (組織の収量/グラムを計算する)懸濁液の最終体積を測定する新しいコニカルチューブにサスペンションを転送します。
  8. 1メートルを使用して細菌性サスペンションを均質化26 G針でLインスリン注射器を新しいチューブにサスペンションを転送中。
  9. 各媒体に2滴(50 UL)を配置することにより、サスペンションの微生物制御を実行します。7H9とローウェンスタイン·ジェンセン媒体及びマイコバクテリアの汚染を検出するため、30日間、37℃でインキュベートする。同様に、ブレインハートインフュージョン(BHI)培地に接種し、好気性細菌を汚染の検出のために、37℃で24時間インキュベートする。
  10. 染色のためにチューブにサスペンションを小分け:冷チールネルゼン染色に35μL(プロトコル2)、及び生存率の決定(プロトコル3)のための200μLを。
  11. チールネルゼン染色(Zn)をした後、抗酸菌個/ ml(AFB / ml)の数を計算します。ヌードマウスの接種のために、1×10 8 AFB / mlの懸濁液を調製、30μL/フット/動物(プロトコル5)を接種するために十分な容量を持っており、接種までサスペンションの寒さを保つようにしてください。凍結のため、1×10 7 AFB / mlのSUSを用意年金(プロトコル4)。

2。冷たいチールネルゼン染色

  1. 染色を開始する前に、血清/フェノール溶液及びZN染色溶液を調製する(試薬のプロトコル - プロトコル4および5)。免疫組織化学ペンを使用して3つのスライドガラス上に3つの円(内径10ミリメートル)を描く。 (1)正常または希釈されていない、(2)1時10分、および(3)1:100番号2鉛筆(注:一部の黒鉛がZN染色後にフェードイン)を使用して:スライドを識別します。
  2. すなわち 、その後1:10 5μLを取り、生理食塩水45μLを加え、希釈していないサスペンションの5μLと生理食塩水の45μLを加え、1:10〜1:100の段階希釈に細菌性懸濁液(ステップ1.10)を希釈します。
  3. 血清/フェノール溶液5μLと円あたりの細菌性懸濁液10μlを追加します。均質化および使い捨てループのハンドルの円の領域の周りに均等に分散。サスペンションは水平にテーブルの上に乾燥するのを待ちます。
  4. 日後にrying、ブンゼンバーナー(約20秒計)11の青い炎の上をスライドを3回通過することにより、スミアを修正。
  5. 染色のために、20分間、チール·ネルゼン濾過のcarbofuchsine(約5ml)で、スライドの表面全体を覆​​う。
  6. 水(遅い流れ)を実行中にスライドを洗浄します。
  7. 約20秒間、10%の酸アルコール溶液でスライドをカバーしています。
  8. 流水で再びスライドを洗浄します。
  9. 5分間メチレンブルー溶液でスライドをカバーしています。
  10. 流水でスライドを洗浄し、室温で乾燥させます。
  11. 100X油浸対物レンズを使用して20フィールド/サークル(合計60フィールド/スライド)を数える。次のように抗酸菌個/ ml(AFB / ml)を計算は、ハンセン病のための12の実験技術の記載に従って、行われます。
    AFB /フィールド= 60で割った3つの円(60フィールド)で見つかった菌数の合計。
    AFB /ミリリットル= AFB /フィールドX定数円の(面積×100)は、対物レンズ開口の面積で割って、希釈された懸濁液をカウントする場合、希釈係数(10または100)によってAFB / mlの数を乗算する。

3。生存率の決定

  1. 開始する前に、オートクレーブ処理Mを準備するらい菌懸濁液(試薬のプロトコル-プロトコル7)。 Mの定性的測定のための適切なキットを(試薬や機器の表を参照)を使用懸濁液中のらい菌の生存率。以下のように希釈溶液(すべての手続きは薄暗い光の下で実行する必要があります)。(生理食塩水に倍溶液B 20を希釈、生理食塩水に10倍に1μlのストックを(1μLのストックを加えた9μlの生理食塩水)溶液Aを希釈プラス19μlの生理食塩水)。
  2. 試験対象の細菌性懸濁液(ステップ1.10)の200μlに希釈した溶液Aの3.6μLおよび希釈溶液Bの6を添加する。以前にオートクレーブ処理M.らい菌懸濁液を、日常として使用される生存能力染色についてegativeコントロール。
  3. 暗所で室温で15分間懸濁物をインキュベートする。
  4. 4℃で5分間10600×gでチューブを遠心分離
  5. 上清を捨て、10%グリセロールの15μlにペレットを再懸濁します。きれいなスライドガラスの表面に8μLを適用し、小型のカバーガラスでそれをカバーしています。 (分子プローブの勧告を参照)、適切なフィルターを含む、蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析します。ヨウ化物(PI)染色をプロピジウムする染色SYTO 9(サイ)を比較することによって、結果を評価する。
    注意:SY染色は両方死んで、生きた細菌の100%を貫通し、PI染色は、損傷した膜を有する細菌のみを貫通している。オートクレーブ滅菌懸濁液(陰性対照)は、細胞破片の存在に起因する細菌の塊を形成することができる。生/死評価のために使用の半定量的スケールは、0〜2 +に変化し、0は、細胞の30%未満PI染色に対して陽性であることを示し、1 +は、30の間を意味する -細胞の50%がPI染色に陽性であり、2 +は、細胞の50%以上がPI染色に陽性であることを意味する。 0のスコアが使用するために最も適切であると考えている。

4。凍結/融解M.らい菌サスペンション

  1. 開始する前に、凍結培地( - プロトコル6試薬のプロトコル)を準備します。凍結のため、以下の手順を実行します。
    1. 凍結培地の1ミリリットルと一緒に、滅菌クライオバイアルに加え、1×10 7 AFB /を含む懸濁液150μlのを追加します。
    2. 冷凍コンテナにクライオバイアルを置き、24時間、-80℃で容器を保管してください。
    3. 収納ボックスに凍結バイアルを転送し、-80℃で保管し
  2. 解凍のために、以下の手順を実行します。
    1. -80℃から凍結した懸濁液でクライオバイアルを取り外し、サスペンションを解凍開始する37℃の水浴に入れてください。
    2. 無菌の20ミリリットルを含むチューブにサスペンションを注ぐ生理食塩水。解凍が完了するまで、静かにサスペンションを混ぜる。
    3. 4℃で、1,700×gで、30分間、懸濁液を遠心分離する
    4. 上澄み液を捨て、所望の容量に到達するために十分な滅菌生理食塩水を追加します。シリンジ(ステップ1.8)を通過させることにより、サスペンションを均質化する。
    5. ZN染色、生存能力の決定および接種のために、プロトコル2、3と5に従ってください。

5。マウス接種

  1. 二人は1が接種物を管理するため、マウスと別のを抑制するために、この手順のために必要とされる。接種される動物は、倫理指針および規制に従って処理してくださいとすべての手順は、制度的動物管理使用委員会によって承認されなければならない。足を上に向けて首筋によってヌードマウスを拘束。
  2. 26 Gの針に通してサスペンションを均質化する。接種物を1ミリリットルの注射器、吸引十分な細菌性懸濁液でTE 2フットパッド(30μL/フットパッド)。
  3. 、後足を保持注射前に70%エタノールアルコールでフットパッドをきれいにし、針のベベルと針を皮内に導入し、近位からの肉趾の先端側に、最大指摘した。懸濁液30μLを注入。足蹠注射は、麻酔したマウスで行ってもよい。
  4. 接種物の逆流を防ぐために皮膚から針を引き抜く前に5秒待ってください。マウスは、ソフトな寝具接種後に収容されるべきであり、歩行や自傷の兆候を監視する必要があります。

Representative Results

プロトコルの成功の3つの方法で評価することができる。まず、接種物の品質の評価は、細胞破片の量と最終懸濁液中の生菌の結果の割合(プロトコル3を参照)によって決定されます。 図1及び図2に示すように、最終的な細菌性懸濁液は、非常に少ない細胞破片と高い生存率を(0 +スコア)を含有し、最も桿菌はSYTO 9緑色蛍光染色で染色していることに注意し(染色は、両方とも死んだ、生きた細菌の100%を貫通図1)と赤色PI蛍光染色(染色は、損傷を受けた膜を有する細菌のみを貫通し、 図2)を用いて染色し、わずか数桿菌。

図1
図1。のSYTO 9染色 らい菌サスペンション 。緑色蛍光は生きていると死んMの存在を示していますらい 。 400X。

図2
図2。 M.のPI染色らいサスペンション。死者Mの少数を示す赤色の蛍光らい 。 400X。

第二に、高い生存率接種材料は4〜5ヶ月後の動物の足蹠での菌の増殖に対する影響を与える映像(プロトコル1)に示すように、明らかな肉眼的病変の開発を、接種後。プロトコルの成功を評価するための第三の方法は、(プロトコル4を参照)。異なる期間のために凍結されていた菌を接種したマウスの足蹠にAFBの生存および増殖を評価することである。

「CellSpacingの= "0"> 実験(動物) 0日目AFB / mlの凍結された数生存能力スコア/日0 凍結期間(日数) 凍結後に接種された空軍基地の数凍結後の生存能力スコア 7カ月後に回収されたAFB / mlの数 1(1) 1.0×10 7 0 + 60 1.7×10 5 1 + 2.3×10 8 1(2) 1.0×10 7 0 + 60 1.7×10 5 1 + 3.8×10 7 1(3) 1.0×10 7 0 + 60 1.7×10 5 1 + 8.5×10 7 1(4) 1.0×10 7 0 + 60 1.7×10 5 <TD> 1 + 4.6×10 7 2(1) 1.0×10 7 0 + 15 4.2×10 5 1 + 1.7×10 7 2(2) 1.0×10 7 0 + 15 4.2×10 5 1 + 4.8×10 6 2(3) 1.0×10 7 0 + 15 4.2×10 5 1 + 8.6×10 6 3(1) 1.0×10 7 0 + 15 1.7×10 5 1 + 1.2×10 7 3(2) 1.0×10 7 0 + 15 1.7×10 5 1 + 1.8×10 7 3(3) 1.0×10 7 15 1.7×10 5 1 + 1.8×10 7 3(4) 1.0×10 7 0 + 15 1.7×10 5 1 + 2.6×10 7 3(5) 1.0×10 7 0 + 15 1.7×10 5 1 + 3.7×10 6

表1。 Mの結果ポスト凍結懸濁液を使用したらい乗算

表1は、M.の結果を示す凍結後の懸濁液を使用したらい菌の増殖。解凍後の懸濁液の生存スコアは1 +であった。凍結プロトコールは、異なる凍結期間を試験するために、3つの独立した実験で行った。 15または60日間、凍結接種物との両方の実験では、結果は、P類似していた凍結後ropagationは10〜1,000回接種( 表1)の7ヶ月後に、各フットパッドから回収AFB数の増加が得られた。そのため、Mの凍結OADC(オレイン酸-アルブミン-デキストロース-カタラーゼ)を補足した7H9培地中のらい菌懸濁液は、生存能力の維持をもたらした。

三つの接種材料は、Mを評価するために使用された二つの異なる凍結期間(15〜60日)後にらい菌の乗算。 7ヶ月後に、菌を接種したマウスの足から回収し、チール·ネルゼン染色後に計数。半定量的生存率スケール:0、PI染色された細胞の30%に存在しない、最大の手段と、1 +は、PI染色された細胞の30〜50%の間を意味し、2 +は、PI染色された細胞の50%を超えることを意味します。 AFB:抗酸菌。

Discussion

Mの増殖のためのよく示され、成功したプロトコルの詳細な説明らい菌は大いに必要とされている。我々の研究は、ろ過およびトリプシン消化による接種の準備のプロトコルは接種材料は、(+スコア0)非常に少ない細胞片とし、菌の高い生存率を得ることができることを実証している。水酸化ナトリウムは、桿菌6の精製の ​​ための組織を分解するために使用されている。 M.の精製の ​​ために水酸化ナトリウムを用いて我々の研究室で行われた研究らい菌は生存判定および動物接種(データは示していない)のための懸濁液の均質化を妨げ、菌の塊の形成をもたらした。

ろ過およびトリプシン消化により接種の準備が直面する潜在的な問題は、細菌や真菌剤との接種物の細胞片と汚染を大量に含まれています。携帯DEBRの場合大量に精製後に観察されない、いずれかのトリプシンはもはやアクティブであるか、生物学的物質の過剰な量があるとされている。トリプシン原液の酵素活性を評価する必要があります。初期の生物学的材料の過剰が疑われる場合、材料は、アリコートに分割されるべきであり、プロトコルは、別々のバッチで実施されるべきである。細菌や真菌剤との接種物の汚染を避けるために、注意が無菌条件下で材料を処理するのに注意する必要があります。真菌および/または細菌汚染が検出された場合、懸濁液は廃棄されるべきである。

我々のプロトコルの制限が記載された半定量的な方法を使用して生存能力評価の主観性である。生存率は公表定量法6より精度が、より実用的で半定量的に評価した。 0 +と1 +の実行可能性のスコアが伝播し、凍結の維持のために満足のいくものであるらい菌。ラヒリ 。すでに百分の80から90までの実行可能な接種材料を接種したヌードマウスは、接種の4〜5ヶ月で(高い生存菌)を採取するのに適したフットパッドにつながることが示されている。したがって、(4ヶ月前後)感染初期には最高の収穫期である。凍結接種の収穫のために、本プロトコルにおけるマウスは成長曲線を保証するために、より長い期間(6ヶ月)、接種維持した。適切な実行可能性を確保するための重要なステップは、ホストからの生物学的物質の収集および処理した後、好ましくは、24時間以内に、新鮮な菌懸濁液を使用することである。また、試薬の品質、新たに調製した希釈トリプシンおよび生存能力染色ソリューションは、再現性のある結果を保証するために必要です。

このプロトコルの他の制限は、最終M.らい菌懸濁液は、宿主DNA、RNA、タンパク質の自由ではない。したがって、他の精製工程はtは添加されなければならないO Mを得るらい菌サスペンション宿主細胞成分を含まない。

M.の全組織標本を凍結することによって、生存菌を維持するための方法らい菌病変9報告されいる。しかし、Portaels の研究。凍結Mの解凍後65から97までパーセントの間の範囲の生存率を実証し大幅な損失、 らい菌はアルマジロ9から得られた組織標本を感染させた。我々のプロトコルは、生存能力指数はMに見られていることを実証( 表1)に凍結されていなかった分量と比較した場合、凍結融解後のらい菌懸濁液は、ドロップされた。実際、Mを凍結生存能力スコア0 +は凍結していないサスペンションにしている間生存率は、1 +のスコアを持つメディアを凍結におけるらい菌の懸濁液を50〜70%の範囲の生存率をもたらした。それにもかかわらず、Mの乗算らい菌は (ヌードマウスの7ヶ月後の接種後良好であったMを凍結代わりに、感染した組織標本の凍結培地中らい菌懸濁液を、より効率的である。我々のプロトコルの重要なステップは、コルストンとヒルソン8によって示されるように、実行可能な菌を維持するために必要な冷凍コンテナ、中AFBの緩慢凍結である。将来の実験は、より長い期間の後に凍結菌の生存率を評価するために実施されるであろう。

要約すると、M.理由らい菌はin vitroで成長しない、我々のプロトコルは、実行可能な接種物の維持管理のための迅速かつ容易な代替を可能にし、成功した冷凍工程は、このように定義された株の銀行の設立を可能にする、動物での連続継代することなく、株の維持を可能にする。

このセクションでは、このプロトコルを実行するための試薬を調製するための手順を説明します。

1。トリプシン

トリプシン 0.5グラム
蒸留水 100ミリリットルまで

殺菌フィルター。 -20℃で保存

2。 7H9

7H9ブロスベース 4.7グラム
40%のグリセロールストック 5ミリリットル
蒸留水 900ミリリットルまで

撹拌しながら、グリセリンを追加した後、水でベースを混ぜる。滅菌する20分間121℃でオートクレーブ。 4℃で保存する

3。ブレインハートインフュージョン(BHI)

BHI 37グラム
蒸留水最大千ミリリットル

滅菌する15分間121℃でオートクレーブ。 4℃で保存する

4。フェノール血清

4.1)、5%フェノール

フェノール 5ミリリットル
蒸留水 100ミリリットルまで

4.2)は、血清フェノール

ウシ胎仔血清 2ミリリットル
5%フェノール 98ミリリットル

4℃で保存する

5。冷たいチールネルゼンステインのためのソリューション

5.1)CarboFuchsin

フクシン 1グラム
フェノール結晶を60℃に融合 5ミリリットル
純粋なエチルアルコール 10ミリリットル
蒸留水 100ミリリットルまで

各使用前にフィルタ。

5.2)メチレンブルーベース

メチレンブルー 3グラム
95%エチルアルコール 200ミリリットルまで

5.3)アルコール酸

70%アルコール 990ミリリットル
chloridric酸 10ミリリットル

6。凍結用培地:

OADC 10ミリリットル
グリセロール 20ミリリットル
7H9培地 100ミリリットルまで

使用前にオートクレーブグリセロール、濾過によりOADCを殺菌。

7。オートクレーブ処理M.らい菌サスペンション

20分間121℃でオートクレーブ。 -20℃で保存

Disclosures

利害の対立が宣言されていません。

Acknowledgments

我々は技術支援のためのベアトリス·GCサルトーリ、LázaraM.トリノ、アナエリサフサロとクラウディア午後カルバリョに感謝します。私たちは、動物施設の設立を支援するためのプラナーブムK.ダスに感謝します。私たちは、原稿を改訂するためにLAIS RRコスタに感謝します。この研究は、デ·アンパロàPesquisaはトルカ·デ·サンパウロ(FAPESP 2009/06122-5)を行いFundaçãoパウリスタコントラHanseníaseとFundaçãoからの補助金によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BacLight Bacterial Viability Kit Invitrogen; Molecular Probes L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9269
Cryo 1 °C Freezing Container Nalgene 5100001
Lowenstein-Jensen medium LB Laborclin 901122
Saline TEK Nova Inc S5812
Pen Dako S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base TPP 91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon BD Falcon 352340
Trypsin Sigma T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base Sigma-Aldrich M0178 Fluka
Glycerol Gibco BRL 15514011
Brain heart infusion (BHI) Oxoid LTDA CM1135
Fuchsin Merck Millipore 1159370025
Phenol  Invitrogen 15509037
Ethyl alcohol Merck Millipore EX02764
Cloridric acid Merck 1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) Becton Dickinson 211886
Fetal bovine serum Gibco; LifeTechnologies 26140079

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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のための最適化されたプロトコル<em&gt;らい菌</em&gt;ひずみ管理:無胸腺ヌードマウスにおける凍結ストック保全とメンテナンス
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Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).More

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).

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