ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

Summary

我々の研究室では、7日齢のゼブラフィッシュの幼虫で、いくつかの異なる挙動の検出に有用な新規なハイスループット自動化されたイメージングシステムを開発しました。幼虫は、環境毒素又は薬剤に曝露された後にシステムが動作の微妙な変化を検出するために用いることができる。

Abstract

私たちは、マルチレーンプレートに7日齢ゼブラフィッシュの幼虫の行動を分析するための新規ハイスループットイメージングシステムを作成しました。このシステムは、PowerPointプレゼンテーションを経由して幼虫に表示される自発的な行動や嫌悪刺激に対する応答を測定します。記録された画像を自動的にカラーチャンネルを分割ImageJのマクロで分析され、バックグラウンドを減算し、車線内の個々の幼虫の配置を特定するためにしきい値を適用する。我々はその後、泳ぐ速度、車線の端または側面のための好み、休息行動、接触走性、幼虫の間の距離、および回避行動を定量化するためのExcelシートに座標をインポートすることができます。行動の微妙な変化を簡単に環境毒物や医薬品への曝露後の行動分析のための、それが有用なもの、我々のシステムを使用して検出される。

Introduction

ゼブラフィッシュは、遺伝、発達や行動科学^1-4のための普及したモデルになってきています。彼らは、2〜3日後に受精（DPF）で彼らのchorionsから孵化4-5 DPFで完全に機能する臓器を開発し、7 DPF ^5,6によって行動を多数展示。ゼブラフィッシュの幼虫は、理想的にはサイズが小さいため^7,8のハイスループット解析に適しています。ソフトウェアは、幼虫と成虫ゼブラフィッシュ^9-14における行動の自動分析のために市販されている。しかしながら、このソフトウェアは高価であり、マルチウェルプレート中のゼブラフィッシュの幼虫の複雑な挙動を測定するための限られた選択肢を有することができる。

我々はセットアップが安価であり、7 DPFのゼブラフィッシュの幼虫^15,16で異なる行動の数を定量化できる新規なハイスループットイメージングシステムを作成しました。システムは、数に胚の暴露後、私たちは迅速かつ効率的に微妙な行動異常をテストすることができます医薬品や環境毒物^16-18。

システムは、キャビネットの上部にある家は、デジタルカメラの木製キャビネットを使用して構築されました。カメラは、ラップトップは^15を上向きに画面が置かれるキャビネットの下部に下向き。タイムラプス撮影が車線内の幼虫の配置をキャプチャするために使用される。幼虫はノートパソコンの画面の上部に配置された4つのマルチウェルまたはマルチレーンプレートに中に収容することができる。私たちは、幼虫が遠ざかって（回避）とエッジ（接触走性^）15,17に向かって泳いで応答するに嫌悪刺激としてPowerPointプレゼンテーションを使用しています。画像は、自動化されたマクロは、カラーチャンネルを分割バックグラウンドを引き算し、個々の幼虫を識別するためのしきい値を適用するために使用されるImageJのにインポートされる。座標は、各画像の各幼虫のために記載されています、我々は回避とthigmotaを定量化するために使用してExcelファイルに挿入することができます軸ロボットP行動、魚の距離に魚、泳ぐ速度、残り¹⁶の量。

Protocol

1。ゼブラフィッシュ胚の収集と幼虫を育てる

1. "偽の"草（緑糸から作られた）（ 図1）を有するガラスパイレックス皿を夜明けにタンク内に挿入され、ゼブラフィッシュ胚を収集するために、2時間にしておく必要があります。胚を含むガラス皿は、ハンドヘルドストレーナ上に注ぎ、脱イオン水で洗浄されるべきである。胚はその後、卵の水で栽培されるべきである。卵水は脱イオン水やカビ防止剤として使用されているメチレンブルー、0.25 mg / Lででインスタントオーシャンの60 mg / Lで含まれています。
2. 個々の実験の仮説に応じて、胚を直ちに又は毒物または医薬品を使用して、開発の特定の段階で処理することができる。毒物および医薬品は、通常、DMSOに溶解させた（1,000 Xの濃度で）、さらに、卵、水媒体中で直接希釈されるべきである。
3. 医薬品や毒物による胚および幼虫の治療中行動解析7におけるDPF（卵水溶液が真菌/細菌の増殖を回避するために、一日おきに、少なくとも変更する必要があるまで、sが、幼虫及び胚を50 1ml当たり約50〜60幼虫の密度で深いペトリ皿内に収容することができる死者胚から）。

2。行動分析のための金型を準備する

1. 特にX 7.6センチメートル×5㎜社内でカスタム構築された11.7センチメートルを測定プラスチック金型を開発しました。金型はサーモサイエンティフィックから単一のウェルプラスチックプレートに注ぎ、アガロースを用いて車線を作成するために必要とされる。シングルウェルプレート対策12.4センチメートルX 8.1センチメートル×1.2センチメートル。
2. 金型の側面を60°の角度を付けている5つのレーンが含まれています。金型内のレーンは底幅が14ミリメートルであるのに対し、最も広い上部に18ミリメートルのベースの高3.5ミリメートルです。金型内のレーン（ 図2）の間に4ミリメートルのギャップがあります。
3. レーンを準備するには脱イオン内の溶融アガロース（0.8％アガロースを50mlを注ぐシングルウェルプレートに60 mg / Lでインスタントオーシャン）とDの水。金型は、任意の気泡形成を排除する液体アガロースの上に非常にゆっくり配置し、アガロース（約45分かかります）まで冷却したときに除去することができる。
4. 行動実験が実行される前に、アガロースレーンは1日よりも以前に行われてはならない（アガロースが出て乾燥を避けるため）レーンは、最大およそ36時間のために料理に蓋室温で保存することができます。アガロースレーンは、1つの実験のために使用されるべきであり、その後廃棄されるべきである。

3。画像キャプチャ

1. 最大20幼虫には、プレートの各レーンに配置することができます。典型的には、レーンごとに5幼虫を泳ぐ速度の最も正確な追跡を容易にするために、実験ごとに必要とされる幼虫の数を減らすために使用される。レーンは卵水でや実験に応じて、医薬品や毒物なしで充填することができる。しかし、レーンはFであってはならない彼らはイメージングキャビネット内に配置されるまで、すべての方法をilled、これはオーバーフローを防ぐことができます。それらはアガロース金型に入れ、ノートパソコンの画面の上部に配置された後の一貫性を保つために、幼虫は、10分の馴化期間を有するべきである。効率的にペトリ皿からアガロースレーンに幼虫を移動すると、幼虫のストレスを軽減するのに役立ちます。幼虫が浅いタンクやペトリ皿に収納されているとき、これは最も簡単です。
2. イメージングキャビネットは、時間経過の写真撮影やノートパソコンに使わキヤノン製デジタルカメラが含まれています。カメラは、キャビネットの上部に配置され、15.6インチスクリーンのラップトップは、画面（ 図3）上に向けて配置する必要がありますキャビネットの下部に向かって目的とすべきである。 4枚のプレートを直接ノートパソコンの画面の上部に手で位置決めされるべきである。それが（Lの縁に影を排除するためにレーンの上部とレベルであるように、この時点でレーンは卵の水や化学処理をオフに突破することができます画像でanes）。
3. PowerPointプレゼンテーションは、幼虫のために嫌悪刺激として使用されます。過去動く赤のボールで6または12マルチウェルプレート^15,17,18で幼虫ゼブラフィッシュが示された。現在PowerPointはプレートの上半分（ 図4）に移動する赤いバーの15分続いて15分間のために空白の背景から始まります。過熱幼虫を排除するためには、28の上方行かない画面温度がノートパソコンを購入するために最善℃ですアガロースレーン内の液体の蒸発を避けるために、最大の撮像時間を1時間未満に保たれるべきである。
4. デジタルカメラは、実験ごとに300枚の合計ごとに6秒撮影、タイムラプス撮影にプログラムする必要があります。しかし、周波数および長さは、実験および行動の定量化に応じて調整することができる。過去の拡張イメージングの時代に各画像間の長い間隔を使用して使用した。カマー動画速度（毎秒30フレーム）で画像化のためのより低い解像度に設定することができる。低い解像度では、単一のマルチウェルプレートに録音を制限している間、ビデオ録画は、イメージング急速な水泳イベント¹⁵に適しています。

4。画像解析

1. 画像はImageJので開くと特に社内で書かれたマクロで使用されるべきである。マクロが自動的に赤い色を除去することができるカラーチャンネルを分割し、バックグラウンドを減算し、しきい値を適用し、粒子分析により幼虫を識別する。 5レーン幼虫分析の最新マクロはZebrafish_macro25kです。画像の数、減算する色、イメージのしきい値などを設定するために、マクロのプロンプトを使用し
2. すべての画像は、ImageJのマクロを介して実行された後に、結果ファイルが表示され、Xが含まれ、yは画像番号とレーン番号と一緒に画像ごとに個別の幼虫の座標。 結果ファイルは、Excel形式で保存した後、空白の背景対移動バーの背景とよく数に基づいてソートされるべきである。 Excelテンプレートが自動的にウェルに幼虫の配置を決定する方程式に組み込まれ、幼虫の間の距離、移動速度、および残りの量を有する使用されるべきである。最新のExcelテンプレートは、リクエストに応じて入手可能ですCretonラボで作成25ibです。さまざまな治療群を示すグラフは、治療群とコントロールとの比較のためにt検定と一緒にExcelシートに組み込まれなければならない。さらなる統計的分析はSPSSを用いて行うことができる。

Representative Results

我々の以前のアッセイにおいて、野生型の幼虫はよく（回避行動）でダウンして泳いで、よく（接触走性行動^）15の端に向かって移動するボールに対応する、跳ねるボール嫌悪刺激を未処理のされている使用して。後ほど、このアッセイにおいて接触走性行動がゼブラフィッシュ幼生¹⁷で不安関連行動の尺度であることを確認した。空白の背景と比較した場合、幼虫の動きに大きな違いは、ボールとエッジのための好みからありました。これらの動作は、また移動赤いバーを使用して、私たちの新しいアッセイで確認され、さらに堅牢な¹⁶アールた。さらに、我々は今、泳ぐ速度、残り、井戸の終わりまたは側面を優先し、魚との距離（ 図5）を含む、単一のアッセイにおいて、行動の多くを試すことができます。卵の水で育った制御の幼虫が増加好みが皿に、レーンの端にダウンして見せる上げ装置は、それらが嫌悪刺激（赤いバーを移動）が掲載されています。幼虫1μgの/ mlのDMSO、一般に1,000 Xのストック溶液として種々の医薬品および毒性物質を溶解するために使用される溶媒を含む卵の水に成長させる場合にも同様の結果が得られる。

代表的な結果は、卵、水とDMSO（コントロールなど）と、一般的に非有機食品で見つかった有機リン系殺虫剤の様々な濃度で処理した幼虫で、図5に示されている。示された結果は一つの実験からのサンプリングです。しかし、繰り返されるとき、結果は泳ぐ速度と接触走性行動は、人間の食糧消費¹⁸のレベルを模倣する有機リン系殺虫剤の低濃度、によって変更されることを示している。

図1。コレクショントレイ。ガラスパイレックス皿は、電子を収集するために使用されている成魚の水槽からmbryos。パイレックス皿から蓋を切断し、プラスチックグリッドと緑の糸がプラスチックでグリッド上に縫い付けていたと挿入した。これは、自然環境を模倣で大人ゼブラフィッシュの繁殖雰囲気を演出しています。

図2。プラスチック金型とアガロースレーン。 A）金型は、左に表示されています。 0.8％アガロースを1ウェルプレートに注ぎ、金型はゆっくり挿入し、アガロースが冷却されたときに削除されますB）右側のプレートは、プラスチック成形によりアガロースで作成されたレーンを示しています。

図3。イメージングキャビネット。イメージングキャビネットのspeciallあったyは我々の研究室で構築し、高スループットの行動分析に使用。 15メガピクセルデジタルカメラ、ノートパソコンの画面上に配置マルチ·プレートで幼虫のタイムラプス画像を収集するために下向きにキャビネットの頂部に取り付けた。プレートとスクリーンとの間に収集された画像におけるモアレを防止するために使用されるプラスチック製のディフューザがある。

図4。空白の背景およびPowerPoint嫌悪刺激。これはゼブラフィッシュ幼生における行動の変化を喚起するために使用され、現在のパワーポイントです。それは）空白の背景およびB）移動赤いバーの間に堅牢な動作の違いを提供しています。

図5。ハイスループットアッセイで定量行動。我々はX、幼虫のy座標に使用するExcelシート内の私達の行動のアッセイから定量化される行動の例。白いバーは空白の背景にさらされると赤のバーはPowerPointで赤移動バーにさらさ幼虫からのデータを表示幼虫からのデータを表示。グラフは）B、レーンの端にある幼虫の割合、C）レーンの端に幼虫の割合、D）との間に距離を車線内に幼虫の）パーセンテージダウン行動の分析から得られる測定値を示す魚（mm）の、E）は、幼虫の幼虫の速度（mm /分）、F）パーセンテージ残りを泳ぐ。図示のグラフでは、データはtreatmであるDMSOコントロールおよび0.001〜0.1μM（一般的に人間の食事で見つかったレベル）に至るまで、いくつかの農薬濃度の幼虫のENTは大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

我々は継続的に我々の小説の行動アッセイを改善しているが、それは常にゼブラフィッシュ幼生¹⁵で回避と接触走性行動の検出に有用であった。多くの試験はそのような使用刺激の色として、アッセイの結果を最適化するために行われてきた、レーンあたりの幼虫、行動アッセイの長さの理想的な数。以前、我々は、マルチウェルプレート（6または12ウェルを有する^{）15,17,18を}使用し^ていました。しかし、最近我々は我々は、単一のアッセイ^16（ 図5）における行動の措置の多くを収集できるようにする幼虫のための大きい水泳スペースを作成するための新しいレーン型を作成しました。その他の変更は、PowerPoint示す（アッセイの改変動きや長さ）と（我々はまた、より狭い車線のための金型を持っている）を使用レー​​ンの大きさのバリエーションが含まれています。

現在、このハイスループット自動化されたシステムは、zebrにおける行動の大規模な範囲を測定する独自の機能です。例えば、速度、回避、他の幼虫に近接し、マルチレーンプレート中の接触走性と同時にafish幼虫。結果を迅速に得ることができ、幼虫多数の撮影時に分析することができる。システムは、セットアップが構築する、安価で迅速かつ簡単なの両方です。このシステムの制約は、3次元運動がゼブラフィッシュ幼虫で評価することができないことである。大人のゼブラフィッシュを追跡する自動化システムは,3-D能力を有し、水柱^10,19内で上下に移動などの動作の広い範囲を識別することができる。別の制限は、我々の撮像システムは、現在のビデオ速度でのハイスループット分析のために最適化されていないことである。低い解像度¹⁵にカメラを設定するときに、ビデオ速度撮像が可能であるが、これは単一のプレートに分析を制限する。

新しく作成された "レーン"メソッドを使用して、アッセイのいくつかの部分は、正確な方法で実行する必要があった。 Tにおける幼虫を配置するとき彼レーン、それはプレートがノートパソコンの画面の上に配置されるまで、液体のレベルが非常に浅いあることを確認することが重要です。レーンが液体のいっぱいである場合、幼虫は、プレートの外周にエスケープします。また、アガロースに金型を挿入する際に、注意が非常にゆっくりと金を下げるように注意する必要があります。金型が早すぎる挿入されている場合、気泡がアガロース中に形成され、追加の幼虫のようにイメージJマクロによって識別される。これは、アガロースレーンも少ない泡を持っている場合、それは新しいものを作るのがベストであることをお勧めします。

今後は、このようなゼブラフィッシュ幼生での学習など、他の複雑な挙動を分析し、学習を早期開発における毒性物質や医薬品への曝露によって影響を受ける可能性がある方法を調べるために私たちの行動のアッセイを最適化したいと思います。我々は現在の行動の結果は脳領域であるかを決定する容易のできる学習行動を分析するのに有用であり得るアッセイに取り組んでいます開発中に特定毒物または医薬品の影響を受ける。自動化されたアッセイは、ゼブラフィッシュの幼虫²⁰と、これらのアッセイでの学習挙動を測定するために開発されているマルチレーンプレートで堅牢な回避反応を用いてハイスループットスクリーニングのために修正可能であってもよい。

我々は、この行動アッセイは、医薬品や毒物が多数発生への影響を試験するための今後の研究に用いることができることを提案する。このような研究は、特定のリスク要因に豊富な情報を提供し、妊娠中の女性と子供のためのよりよい健康と安全のガイドラインを設定に寄与する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Instant Ocean	That Pet Place	198262
Agarose	Fisher	BP1356-100
Methylene Blue	That Pet Place	214325
Equipment
One well plates	Fisher	12-565-493
Digital camera	Canon	EOS Rebel T1i
Imaging Cabinets	WoodCraft Towers
Laptops	Acer Aspire	Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.
Camera Lens	Canon	EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens
Plastic diffuser	Pendaflex	52345
Software
PowerPoint 2010	Microsoft
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/
Excel 2010	Microsoft
Statistical software	SPSS 20