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Chemistry

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50623
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

Summary

Aislamiento y caracterización del dominio lípido A del lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram-negativas proporciona información sobre los mecanismos de la superficie celular a base de resistencia a los antibióticos, la supervivencia bacteriana y la forma física, y cómo químicamente diversa lípido A las especies moleculares modulan diferencialmente acogida la respuesta inmune innata.

Abstract

El lipopolisacárido (LPS) es la principal molécula de la superficie celular de las bacterias gram-negativas, depositado sobre la cara externa de la bicapa de la membrana externa. LPS se pueden subdividir en tres dominios: el O-polisacárido distal, un oligosacárido de núcleo, y el lípido A de dominio que consiste en un lípido una especie molecular y residuos de ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (KDO). El dominio lípido A es el único componente esencial para la supervivencia celular bacteriana. Después de su síntesis, el lípido A se modifica químicamente en respuesta a las tensiones ambientales tales como el pH o la temperatura, para promover la resistencia a compuestos antibióticos, y para evitar el reconocimiento por los mediadores de la respuesta inmune innata de acogida. El siguiente protocolo se detalla el aislamiento escala pequeña y gran del lípido A de bacterias gram-negativas. Material aislado después se caracteriza químicamente por cromatografía en capa fina (TLC) o la espectrometría de masa (MS). Además de láser asistida por matriz de desorción / ionización de tiempo de fluz (MALDI-TOF) de MS, también describe los protocolos MS en tándem para el análisis de los lípidos una especie molecular usando ionización por electrospray (ESI) acoplado a disociación inducida por colisión (CID) y recién empleados fotodisociación ultravioleta métodos (UVPD). Nuestros protocolos MS permiten la determinación inequívoca de la estructura química, de suma importancia para la caracterización de moléculas de lípido A que contienen las modificaciones químicas únicas o nuevas. También describimos el marcaje con radionúclidos, y el posterior aislamiento, del lípido A de las células bacterianas para el análisis por TLC. Relativa a los protocolos basados ​​en MS, la TLC proporciona un método de caracterización más económica y rápida, pero no se puede utilizar para asignar de forma inequívoca lípido A las estructuras químicas sin el uso de normas de estructura química conocida. En las últimas dos décadas el aislamiento y caracterización de lípido A ha dado lugar a numerosos descubrimientos interesantes que han mejorado nuestra comprensión de la fisiología de las bacterias gram-negativas, los mecanismos de resistencia a los antibióticoscia, la respuesta inmune innata humana, y han proporcionado a muchos nuevos objetivos en el desarrollo de compuestos antibacterianos.

Introduction

El lipopolisacárido (LPS) es la principal molécula de la superficie exterior de casi todos los organismos gram-negativas y consiste en tres dominios moleculares: un polisacárido distal antígeno O-, un oligosacárido de núcleo, y el lípido de membrana-asociada Un dominio depositado sobre la cara externa de la 1,2 bicapa de la membrana externa. El lípido A de dominio se compone de 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (KDO) y un lípido residuos de una especie molecular, en donde el lípido A puede ser definida como la porción soluble en cloroformo de LPS después de la hidrólisis suave de ácido-1, 2. El lípido estándar Una molécula puede definirse químicamente como una columna vertebral diglucosamine que es hexa-acilada y bis-fosforilado; consistente con las principales especies de lípido A observadas en el organismo modelo Escherichia coli (E. coli) 1,2. Nueve genes expresados ​​constitutivamente, conservados a lo largo de las bacterias gram-negativas, son responsables de la producción del lípido A de dominio (Figura 1) 1,2. La mayoría de las bacterias tienen un conjunto adicional de los genes, que varían en el grado de conservación filogenética, que participan en la modificación química adicional del lípido A 3. Desfosforilación, eliminación de cadenas de acilo, y la adición de restos químicos tales como amino azúcares (por ejemplo aminoarabinosa) y / o fosfoetanolamina son las actividades más comúnmente observados (Figura 1). Muchas de las enzimas responsables de lípidos Una modificación son activados directamente por señales ambientales, como cationes bivalentes, o su expresión está regulada por dos sistemas de respuesta del regulador de los componentes 3.

Reconocimiento de especies de lípidos A por el sistema inmune innato de acogida está mediada por el receptor Toll-like factor de diferenciación 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Fuerzas hidrófobas entre MD2 y el lípido A cadenas de acilo, así como entre TLR4 y los "grupos 1 y 4 de fosfato de lípido A promover la fuerte asociación de labioIdentificación A con TLR4/MD2 4,5. Las modificaciones que alteran el estado de acilación o la carga negativa del lípido A de lípidos basada impacto de TLR4/MD2 Un reconocimiento y estimulación aguas abajo de la respuesta inmune innata activadores de NF-kappa B y mediadores de la inflamación tales como TNF y IL-1-β 6,7. Modificaciones que enmascaran la carga negativa del lípido A también impiden péptidos antimicrobianos catiónicos bactericidas de la unión a bacterias Gram-negativas superficies celulares 3,8. Muchas modificaciones lípido A son la hipótesis de aumentar la aptitud bacteriana bajo condiciones ambientales específicas, como en el interior del huésped humano o en un nicho ecológico. Por esta razón muchas enzimas de modificación son objetivos atractivos para el desarrollo racional de compuestos antimicrobianos. La diversidad química de las estructuras de lípido A, con respecto al organismo y / o el medio ambiente, y las implicaciones biológicas de estas diversas estructuras hacer la caracterización estructural de lípido A un esfuerzo importante en Testudie de bacterias gram-negativas.

Aislamiento de moléculas de lípidos A de bacterias enteras implica la extracción de LPS de la superficie celular bacteriana, un paso hidrolítica para liberar el lípido A, seguido de un procedimiento de purificación final 9-11. El procedimiento de extracción más frecuentemente citada LPS es el procedimiento de extracción de agua caliente-fenol, primero introducido por Westphal y Jann 10. Después de toda la extracción de LPS se somete a hidrólisis leve de ácido, que separa químicamente Kdo de la 6'-hidroxilo del azúcar glucosamina distal del lípido A (Figura 1). Existen numerosas trampas para el procedimiento de agua caliente-fenol incluyendo el uso de un reactivo de alta peligrosidad, la necesidad de degradar ácidos co-extraídos nucleicos y proteínas, y varios días se requieren para completar el protocolo 10.

Nuestro laboratorio ha desarrollado aún más la extracción y aislamiento de lípido A como el desarrollado por primera vez por Caroff y Raetz 12,13. En comparación con los procedimientos de agua caliente-fenol, el método presentado aquí es más rápida y eficiente, y se adapta a una amplia gama de volúmenes de cultivo de 5 ml a múltiples litros. Por otra parte, a diferencia de las extracciones de agua caliente de fenol, nuestro método no selecciona para rugosas o lisas-tipos de LPS, proporcionando una óptima recuperación de las especies de lípidos A. En nuestro protocolo, lisis química de las células bacterianas enteras se lleva a cabo utilizando una mezcla de cloroformo, metanol y agua, donde LPS pueden ser un sedimento por centrifugación. Una combinación de hidrólisis ácida suave y extracciones con disolvente (Bligh-Dyer) se utilizan para liberar lípido A de polisacárido unido covalentemente. El método de Bligh y Dyer se aplicó primero a la extracción de especies de lípidos a partir de una variedad de animales y tejidos vegetales 14, modificado aquí para separar polisacárido hidrolizado de lípido A. En esta etapa de separación final, cloroformo lípidos solubles particionan selectivamente en la parte baja orgánica fase. Para purificar más lípido A, fase inversa ocromatografía de columna de intercambio aniónico se puede utilizar 12.

Después del aislamiento de la especie A de lípidos a partir de células enteras, un número de métodos de análisis se puede utilizar para caracterizar la estructura química del material aislado tales como RMN, TLC, y el análisis basado en MS. RMN permite no destructivo elucidación estructural y proporciona detalles estructurales relacionados con enlaces glucosídicos, la asignación inequívoca de posiciones de la cadena de acilo, y la asignación de sitios de unión para los lípidos modificaciones A como aminoarabinosa o fosfoetanolamina 15-17. El análisis de RMN de lípido A no se discute dentro de nuestro protocolo, pero se ha descrito adecuadamente en otras partes 15,16. Para un rápido análisis TLC basan métodos se utilizan con frecuencia, pero no proporcionan información directa sobre la estructura química fina. Protocolos basados ​​MS son el método más frecuentemente utilizado para caracterizar las estructuras lipídicas A 18,19. Matriz asociada desorción láser de ionización (MALDI)-MS se utiliza a menudo para estudiar inicialmente las especies intactas lípido. Iones de una sola carga se generan a partir del analito preparado de acuerdo con nuestros procedimientos de extracción. Como se requiere un análisis estructural más bien, los métodos basados ​​en MS / MS prueban más informativo que MALDI-MS. Junto a ionización por electrospray (ESI) de lípidos simple o múltiple cobrará un iones precursores son aún más fragmentado por disociación inducida por colisión (CID) o fotodisociación ultravioleta (UVPD), para generar iones producto estructuralmente informativos 18,20,21. Productos para bajar de Neutrales de lípido A iones precursores también se generan con frecuencia durante ESI-MS proporciona una capa adicional de información estructural.

Espectrometría de masas en tándem (MS / MS) ha demostrado ser un método indispensable y versátil para la elucidación de las estructuras de lípido A. Durante MS / MS, los iones se activan para producir un patrón de fragmentación de diagnóstico que se puede utilizar para elucidar la estructura del ión precursor. El que más se available método MS / MS es CID. Este método produce fragmentos de iones a través de colisiones de la ión precursor seleccionado con un gas inerte de destino, lo que resulta en la deposición de energía que conduce a la disociación. CID ha demostrado ser una herramienta importante en la asignación de la estructura del lípido A para una amplia gama de especies bacterianas 22-33.

Aunque CID es el método más universalmente aplicado MS / MS, se genera un conjunto limitado de iones de productos. 193 nm UVPD es una alternativa y un método de MS / MS complementaria. Este método utiliza un láser para irradiar iones, y la absorción de fotones resulta en la activación de los iones y posterior disociación. Esta energía superior técnica de MS / MS produce una gama más diversa de iones producto que CID y por lo tanto proporciona patrones de fragmentación más informativos. En particular, UVPD proporciona información sobre los cambios sutiles en las especies de lípidos A con base en divisiones en glicosídico, amina, acilo y CC bonos ligados 18,21,34.

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Protocol

Todas las soluciones deben prepararse con agua ultrapura y metanol grado HPLC y cloroformo. Soluciones de preparados que contengan disolventes orgánicos tales como metanol, cloroformo o piridina y ácidos o bases concentradas deben ser preparados y utilizados bajo una campana para vapores químicos. Todas las soluciones se pueden almacenar a temperatura ambiente. Los solventes deben ser medidos en un cilindro de vidrio graduado y se almacenan en botellas de disolvente de vidrio con PTFE forrado casquillos. Para el almacenamiento a largo plazo que contiene disolventes de cloroformo-deben almacenarse en botellas de vidrio de color ámbar polarizados para evitar la producción de fosgeno, un cloruro de ácido altamente reactivo. Tubos de centrífuga de PTFE y frascos rotavapor se deben enjuagar con metanol y cloroformo antes de su uso. Siga los reglamentos federales, estatales y / o eliminación de residuos institucionales necesarias cuando se deshaga de disolventes y / o de residuos radiactivos.

1. Gran Escala lípido A de extracción (50 ml a 1,5 L)

  1. Prepare una mezcla de una sola fase Bligh-Dyer: cloroforma-metanol-1X tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4; 1:2:0.8 v / v). Combinar 200 ml de cloroformo, 400 ml de metanol y 160 ml de PBS en 1 L de botella de disolvente. Botella Tapar y mezclar por inversión (> 30x). Afloje la tapa periódicamente durante la mezcla para ventilar y almacenar sellada.
  2. Preparar una de dos fases de Bligh-Dyer mezcla de cloroformo-pre-equilibrada: metanol: agua (2:2:1.8 v / v). Combinar 400 ml de cloroformo, 400 ml de metanol y 180 ml de agua en 1 L de botella de disolvente. Tapa de la botella y mezcle por inversión, por lo que asegúrese de soltar la tapa periódicamente durante la mezcla para ventilar. Deje que equilibre O / N y tienda sellada.
  3. Preparar el tampón de hidrólisis ácida suave (acetato de sodio 50 mM, pH 4,5; 1% de dodecil sulfato de sodio (SDS)). Para 500 ml de tampón de hidrólisis ácida suave, pesan 2,05 g de acetato sódico y transferir a un vaso de precipitados de 500 ml. Añadir agua hasta un volumen de ~ 350 ml y agitar, a continuación, añadir 50 ml de SDS al 10%. Mezclar y ajustar el pH a 4,5, la transferencia a un cilindro graduado, y agregue agua hasta 500 ml.
  4. Prepararcloroformo: metanol (4:1, v / v): Medir 100 ml de cloroformo y transferir al disolvente botella. Medir 25 ml de metanol y se mezcla con cloroformo. Guarde en frascos de vidrio ámbar.
  5. Inocular 5 ml de medio de caldo de Luria (u otros) a partir de una sola colonia bacteriana. Grow O / N a 37 ° C, o por lo requiera ° C para el crecimiento. Un diagrama del procedimiento de extracción se muestra en la Figura 2.
  6. El día siguiente, medir la OD 600 y utilizar el 5 ml de cultivo O / N para inocular 200 ml de cultivo a un OD 600 a partir de 0,05. Se cultivan las células hasta una DO 600 de 0,8 a 1,0 se alcanza.
  7. Células de la cosecha a través de centrifugación a 10.000 xg durante 10 min. Gira más larga puede ser necesaria para las cepas que Pellet mal. Vierta el líquido sobrenadante con los medios de comunicación.
  8. Lavar sedimento celular con 50 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Repetir la centrifugación para sedimentar las células. Retirar el sobrenadante y sedimento celular se almacena a -20 ° C, o continúe con el paso 1.9.
  9. Resuspender las células en 40 mlde 1x PBS y se dividen entre dos tubos de centrífuga de 250 ml de PTFE (lo que supondría 20 ml de suspensión de células / tubo). Añadir 25 ml de cloroformo y 50 ml de metanol a cada tubo, para una sola fase de Bligh-Dyer (cloroformo: metanol: agua; 1:2:0.8 v / v) (Figura 2). Mezclar por inversión y se incuba a temperatura ambiente durante> 20 minutos para asegurar la lisis celular completa.
  10. Centrifugar la mezcla a 2000 xg durante 20 min. LPS se sedimentar junto con las proteínas y ácidos nucleicos (Figura 2), sin embargo, fosfolípidos, lípidos isoprenilo, y pequeños péptidos hidrófobos, permanecerán en el sobrenadante. Eliminar el sobrenadante.
  11. Lavar el pellet LPS con la mezcla de ~ 100 ml monofásico Bligh-Dyer. Centrifugar a 2000 xg durante 20 min. Desechar el sobrenadante. Cuando el aislamiento de lípido A de E. coli o Salmonella, sólo se requiere un lavado, sin embargo, pueden ser necesarias medidas adicionales de lavado para reducir la contaminación de fosfolípidos al aislar lípido A de algunos organismos.
  12. Añadir 27 ml de millasbuffer de hidrólisis ácida ld (acetato de sodio 50 mM, pH 4,5; 1% SDS, véase el paso 1.3) a LPS de pellets, y mezclar con la pipeta hacia arriba y abajo hasta que sólo las partículas pequeñas permanecen. Someter a ultrasonidos para volver a suspender homogéneamente LPS pellet en solución con ultrasonidos punta de la sonda en un ciclo de trabajo constante durante 20 segundos en la salida del 50%. Repita sonicación de 2x de la muestra (20 seg / ráfaga, ~ 5 seg entre ráfagas).
  13. Hervir las muestras en un baño de agua durante 30 minutos. Precaución: asegúrese de que las tapas son muy ajustados, pero no totalmente sellado. Algunos organismos, tales como Vibrio cholerae (V. cholerae) requieren tiempos de incubación más largos (1 hr) para aumentar el rendimiento global de lípidos A. Retirar botellas de baño de agua y permitir que la muestra se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder.
  14. Para extraer los lípidos después de la hidrólisis, convertir la solución de SDS en una de dos fases de Bligh-Dyer (Figura 2) mezcla mediante la adición de 30 ml de cloroformo y 30 ml de metanol, para una mezcla de cloroformo: metanol: agua (2:2:1.8, V / v). Mezclar por inversión y se centrifuga la muestra durante 10 min a 2,000 x g. Se extrae la fase inferior en un tubo de centrífuga de PTFE limpia utilizando una pipeta de vidrio.
  15. Realizar una segunda extracción mediante la adición de 30 ml de fase inferior de una mezcla de dos fases de Bligh-Dyer pre-equilibrada (paso 1.2), a la fase superior de la etapa 1.14. Mezclar y centrifugar a 2000 xg durante 10 min. Se extrae la fase inferior, y la piscina con la fase inferior se extrajo en el paso 1.14.
  16. Se lavan las fases inferiores agrupados (60 ml en total) mediante la adición de 114 ml de pre-equilibrio de dos fases Bligh-Dyer fase superior (paso 1.2) para crear una mezcla de dos fases Bligh-Dyer (cloroformo: metanol: agua; 02:02: 1,8, v / v). Mezclar. Se centrifuga a 2000 × g durante 10 min.
  17. Eliminar la fase inferior a un vidrio limpio rotatorio matraz de evaporación y la muestra seca usando evaporación rotatoria (Figura 2).
  18. Añadir 5 ml de cloroformo: metanol (4:1, v / v) en el matraz rotatorio, y baño de someter a ultrasonidos (> 30 seg) para ayudar en la suspensión de lípido de los lados del matraz. Utilice una pipeta de transferencia de vidrio para transferir los lípidos a una limpiatubo de vidrio (13 x 100 mm o más grande) cubierto con PTFE forrado tapones de rosca fenólicos. Muestra seca bajo una corriente de nitrógeno usando un secador de nitrógeno.
  19. Resuspender lípido seco en 1 ml de cloroformo: metanol (4:1, v / v). Traslado al pequeño frasco de muestra de vidrio (12 x 32 mm) con una base cónica para más resuspensión cuantitativa utilizando pequeños volúmenes (véase la Tabla de Equipos / Reactivos). Secar con un secador de nitrógeno.
  20. Muestra seca se puede almacenar a -20 ° C hasta su posterior TLC (Protocolo 2) o MS análisis (Protocolo 3, 4, o 5). (Nota: La cantidad de material aislado y utilizado en posteriores protocolos se sugiere con base en lo que es suficiente para la mayoría de los organismos de la misma muestra de lípidos se puede utilizar en los Protocolos 2-5, tomando nota de material removido% Ver discusión para más detalles...).

2. Visualización de lípido A Especies por medio de cromatografía en capa fina

  1. Preparar el sistema de fase móvil de TLC disolvente (cloroformo: piridina: ácido fórmico al 88%: agua; 50:50:16:5 v / v). Combine 200 ml de cloroformo, 200 ml de piridina, 64 ml de ácido fórmico al 88%, y 20 de agua ml en una botella de disolvente 1 L. Botella Cap, mezclar por inversión varias veces, y ventilación.
  2. Utilice un depósito de TLC que se acomoda a 20 x 20 cm placas. Línea tanque TLC con papel de cromatografía ~ 40 cm.
  3. Para el tanque TLC añadir 200 ml de cloroformo: piridina: 88% de ácido fórmico: agua (50:50:16:5, v / v). Permita que el tanque de pre-equilibre durante> 3 horas, a menudo se prefiere O / N y más conveniente.
  4. Retire las muestras de lípidos secos del congelador (paso 1,20) y dejar calentar a TA.
  5. Con una maquinilla de afeitar eliminar la sílice desde el borde superior de una placa de gel de sílice 60 TLC. Con un lápiz opaco, dibujar una línea paralela a la parte inferior de la placa, de 2 cm de la parte inferior. Esta línea es el origen para detectar muestras. Marcos incrementa a lo largo de esta línea de referencia para detectar muestras de 1 cm de distancia.
  6. Disolver lípido seco de la etapa 2.4 en 200 l de cloroformo: metanol (4:1, v / v), vórtice y se somete a ultrasonidos (3x, ~ 15 segundos cada uno), los rendimientos de ~ 100 -500 ng / l de lípido A si extraído de E. coli.
  7. Usando una pipeta de vidrio microcapilar, detectar una décima parte del volumen (20 l) sobre la placa de TLC como se marca en el paso 2.5. Permitir muestras se sequen al aire sobre una placa de TLC durante ~ 15 min. (Nota: Las muestras en viales pequeños de vidrio se pueden secar usando un secador de nitrógeno y se almacenaron a -20 ° C para su uso posterior en los protocolos de 3-5 Tomar nota de material eliminado%.).
  8. Coloque la placa de TLC contiene muestras manchadas en el tanque de pre-equilibrio. Una vez frente del disolvente alcance la parte superior de la placa de TLC (~ 2,5-3 horas), retire la placa y secar al aire (> 60 min). Una pistola de aire frío se puede utilizar para asegurar la sequedad completa.
  9. Mientras que la placa se está secando, encienda placa caliente a 250 ° C durante la carbonización.
  10. En una campana para vapores químicos ventilado, prepare 10% de mezcla de ácido sulfúrico-etanol para carbonizar los lípidos se resolvieron en la placa de TLC de sílice (ácido sulfúrico concentrado: etanol al 100%; 01:09 v / v). Medir 10 ml de ácido sulfúrico y se añade lentamente a 90 ml de etanol al 100%. Cuidadomezclar completamente y transferir a un reactivo atomizador cromatográfico vidrio.
  11. En la campana de humos, utilice un vaso cromatográfico atomizador reactivo para rociar la placa de TLC se seca con un 10% de mezcla de ácido sulfúrico-etanol. Rocíe la mezcla de manera uniforme en toda la placa.
  12. Coloque la placa de TLC en la placa caliente a 250 ° C hasta que las muestras de lípidos carbonizados aparecen como puntos negros / marrones (<1 min). No exponga la placa, ya que esto hará que toda la placa a tomar color y hacer que la visualización de las especies de lípidos Un difícil.

3. Caracterización estructural del lípido A través de MALDI-TOF espectrometría de masas

  1. Desde el paso 1.20, (o paso 2.7) eliminar los lípidos Una muestra del congelador y dejar calentar a TA. Resuspender lípido seco Una muestra en ~ 20 l de cloroformo: metanol (4:1, v / v) y agitar para obtener una ~ 1-5 mg / l de lípidos Una solución si se extrae a partir de E. coli. (Nota: un 10% menos concentrado si el material utilizado en el paso 2.7).
  2. Preparar componentes de la matriz ATT. Saturada 6-aza-2-tiotimina en el 50% de acetonitrilo: añadir 500 l de agua y 500 l de acetonitrilo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y luego añadir> 10 mg 6-aza-2-tiotimina para que el acetonitrilo 50% es saturada super. Saturada solución de citrato de amonio tribásico: Agregar> 1 mg a 500 l de agua, precipitar debería ser evidente. Soluciones Vortex y centrifugar antes de su uso; sólo se utiliza sobrenadante saturado.
  3. Preparar la mezcla de matriz de TCA: citrato de amonio saturado tribásico-tiotimina 6-aza-2 en 50% de acetonitrilo, saturado (20:01, v / v). Mezclar componentes de la matriz junto al añadir 20 l de solución de TCA a 1 l saturados de solución de citrato amónico tribásico en 500 l tubo de microcentrífuga, vortex para mezclar y centrifugar antes de aplicar a la placa de MALDI.
  4. Preparar la placa MALDI añadiendo mezcla calibrante 0,5 l a la placa de MALDI en un lugar cerca de donde se depositarán las muestras, para proporcionar la determinación más exacta relación masa / carga.
  5. Deposita 0,5 lde la matriz de ATT en placa MALDI en cada lugar donde se depositará el lípido A de la muestra.
  6. Depósito de 0,5 l de muestra (2,5% de la muestra total) en el punto de la matriz de ATT, para mezclar en la placa, y adquirir los espectros por muestra de exploración para señales óptimas de iones (Figura 3). Nota: Los importes de la MS de la señal más óptima puede variar con el organismo y deben ser determinadas empíricamente. Para añadir más material uno puede manchar 0,5 l varias veces permitiendo mezcla visto secar entre una adición de más muestras. Muestra también se puede concentrar (seca y se resuspende en un volumen más pequeño) o se diluye cuando sea necesario. Más material de partida (volumen de iniciar el cultivo de células) también puede ser utilizado (véase el debate).

4. Ionización por electrospray espectrometría de masas y de colisión inducida disociación del lípido A

  1. Preparar una mezcla de cloroformo: mezcla disolvente de metanol (01:01, v / v) mediante la mezcla de un 200 l de stock de metanol de grado HPLC con 200 ml de cloroformo de calidad HPLC en un sol de cristalventilar botella.
  2. Transferir 200 l de la mezcla de cloroformo: metanol como disolvente en el vial con el lípido A (por ejemplo, desde el paso 1.20, 2.7, o secos después del Protocolo 3) y el lípido sonicar una solución durante 5 minutos o hasta que se disuelva todo el material.
  3. Configure el espectrómetro de masas de ionización negativa modo electrospray.
  4. Usando una jeringa de 250 l y una bomba de jeringa, infundir directamente el lípido diluido una muestra a una velocidad de flujo de 2,0-3,5 l / min.
  5. Optimizar y mejorar el lípido A de señal de iones mediante la regulación de la óptica de iones. Un espectro de masas completo ahora se puede recoger de la especie de lípido A (Figura 4).
  6. Aislar y activar el lípido objetivo Un mediante la selección de CID como el método de MS / MS.
  7. Aumentar la tensión de CID (o energía de colisión normalizada, NCE) hasta que el precursor de lípidos Una especie es de aproximadamente 10% de abundancia relativa en comparación con la de iones producto más elevado.
  8. Adquirir y espectros medios hasta que suficiente señal-ruido se consigue para el thiones producto e. El número de exploraciones necesarias depende de la intensidad de la señal del precursor original y puede variar desde 3 hasta 300 exploraciones (Figura 5A).

5. MS / MS en el lípido A por Ultravioleta Fotodisociación

  1. Preparar la muestra y espectrómetro de masas como en los pasos 4.1 a 4.5.
  2. Encienda el láser de la interfaz con el espectrómetro de masas. El espectrómetro de masas fue equipado con un láser de excímero de 193 nm y modificado para permitir la activación UV en la célula HCD del instrumento. Fotodisociación se llevó a cabo de una manera similar a la descrita previamente 35. Utilizamos un colector de vacío modificado con una ventana óptica CaF 2 para transmitir los fotones en la mayor energía C-trampa de disociación celular (HCD). El láser se activa durante la MS / MS por una lógica transistor-transistor (TTL) Señal de espectrómetro de masas a un generador de pulsos / delay.
  3. Configure el software del instrumento para que el láser se disparará el láser excimer cuando eliones entran en la célula HCD. Esto requiere una modesta modificación del software.
  4. Encienda el generador de impulsos de tal manera que el láser es pulsado cada 2 mseg (500 Hz).
  5. Aislar el lípido A ión precursor seleccionando HCD como método de MS / MS y ajustar la energía de colisión de 1% NCE. Esto permite el aislamiento de iones precursores para la disociación ultravioleta dentro de la célula HCD. Aunque se utiliza la célula HCD, el software es modificado para realizar UVPD durante este intervalo.
  6. Activar el lípido aislado Un ion mediante el aumento de la energía del láser y ajustar el número de pulsos de láser. Se realizará un experimento típico UVPD usando diez 6 ml pulsos.
  7. Como en el paso 4.8, adquirir y espectros medios hasta que se logre el ruido de señal-a-suficiente para que los iones producto UVPD. El número de exploraciones necesarias depende de la intensidad de la señal del precursor original y puede variar desde 3 hasta 300 exploraciones (Figura 5B).

6. 32 P-etiquetadode lípido A y aislamiento subsiguiente

  1. Inocular 5 ml de los medios de comunicación (caldo de Luria u otros medios) a partir de una sola colonia. Crecer O / N a 37 ° C oa temperatura requerida.
  2. El día siguiente, medir la OD 600 y utilizar el cultivo O / N para inocular 7 ml de cultivo a un OD 600 a partir de ~ 0,05, crecido en un tubo de cultivo de vidrio desechable de 20 x 150 mm estándar. Añadir 2,5 Ci / ml de inorgánica 32 P. Se cultivan las células hasta una DO 600 de 0,8 a 1,0 se alcanza. Por favor, siga federales, estatales y / o directrices institucionales para el manejo seguro y adecuado de los materiales radiactivos.
  3. Las células de la cosecha en 16 x 125 mm tubos de centrífuga de vidrio con PTFE alineados tapa usando una centrífuga clínica ángulo fijo a 1.500 xg durante 10 min. Extraer el sobrenadante en un recipiente de desechos radiactivos apropiada. Todos los residuos radiactivos (por ejemplo, líquido, vidrio, biohazard) generados en los pasos subsiguientes se debe eliminar de acuerdo con las regulaciones federales, estatales y / o gui institucionaltrices.
  4. Lavar sedimento de células con 5 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Centrifugar durante 10 min a 1500 x g. Desechar el sobrenadante.
  5. Resuspender las células en 5 ml de fase simple mezcla de Bligh-Dyer (Figura 2) que consiste en cloroformo: metanol: agua (1:2:0.8, v / v). Mezclar en vórtex, y se incuba a temperatura ambiente durante> 20 minutos para asegurar la lisis celular completa.
  6. Centrífuga en centrífuga clínica a 1500 xg durante 20 min. Vierta suavemente el sobrenadante, que contiene fosfolípidos y lípidos isoprenilo.
  7. Resuspender el precipitado de LPS en 1,8 ml de 50 mM de acetato sódico, pH 4,5; 1% de tampón de SDS mediante agitación con vórtex. Someter a ultrasonidos la muestra usando un sonicador de baño de hasta sedimento se dispersa uniformemente (~ 30 seg).
  8. Incubar la muestra durante 30 min en baño de agua hirviendo. Asegúrese de que las tapas estén apretadas pero no sellada.
  9. Eliminar de baño de agua y permita que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 5-10 min.
  10. Convertir la solución en una mezcla de dos fases de Bligh-Dyer mediante la adición de 2 ml de cloroformo y 2 ml demetanol, obteniéndose una mezcla de cloroformo: metanol: mezcla acuosa (2:2:1.8 v / v). Mezclar en vórtex, y se centrifuga durante 10 min en centrífuga clínica a 1500 xg para fases separadas.
  11. Se extrae la fase inferior en un tubo de centrífuga de vidrio limpio usando una pipeta de vidrio (primera extracción).
  12. Realizar una segunda extracción en la muestra mediante la adición de 2 ml de pre-equilibrio de dos fases Bligh-Dyer fase inferior (preparado como en el paso 1.2) a la fase superior restante de la etapa 11. Vórtice y se centrifuga 10 min. Eliminar fase inferior y se combinan con la fase inferior de la primera extracción.
  13. Para la fase inferior agrupado (~ 4 ml de volumen total), añadir 7,6 ml de pre-equilibrada fase superior (paso 1,2), obteniéndose una solución de Bligh-Dyer de dos fases (cloroformo: metanol: agua; 2:2:1.8, V / v). Vortex y centrifugar durante 10 min.
  14. Retire la fase inferior a un tubo de vidrio limpio y seque con un secador de nitrógeno. Las muestras secas se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior.

7. Visualición de 32 P-etiquetados lípido A Especies por medio de cromatografía en capa fina

  1. Preparar 32 lipídico P-etiquetados Una muestra, el tanque de TLC, y las placas de TLC como se describe en los pasos 2.1 a 2.8.
  2. Disolver 32 muestra P-etiquetados en 500 l de cloroformo-metanol 04:01 (v / v). Vortex y baño de ultrasonidos para disolver completamente el material lipídico. Añadir 5 l de muestra a vial de centelleo que contiene 5 ml de cóctel de centelleo. Contar en el contador de centelleo y calcular el total de cuentas / min de la muestra.
  3. Cuando la visualización de especies de lípidos radiomarcados, se pueden utilizar 10 x 20 cm o 20 x 20 cm placas de TLC. Para placas de 10x20 cm, las muestras deben ser vistos a lo largo del origen marcado en el paso 2.5 para que la dimensión más larga de la placa esté en posición vertical (es decir, muestras manchadas en origen marcados 2 cm por encima del borde de 10 cm).
  4. Con una pipeta microcapilar, detectar 10.000-20.000 cpm / muestra en la placa y permiten secar las (> 15 min). Las muestras que tenga que concentrarse por secado bajonitrógeno y se volvieron a suspender en un volumen apropiado, para lograr 10.000-20.000 cuentas / min / spot (2 l ó 2 l en un momento de <10 l en total).
  5. Coloque la placa de TLC contiene muestras radiomarcados en el tanque de pre-equilibrio. Una vez frente del disolvente alcance la parte superior de la placa de TLC (~ 3 horas), retire la placa y secar al aire (> 60 min). Precaución: las placas de TLC se ejecutan en presencia de piridina deben secarse a fondo en una campana para vapores químicos, como trazas de piridina pueden dañar las pantallas phosphorimaging. Una pistola de aire frío se puede utilizar para asegurar la sequedad completa.
  6. Envolver la placa en papel plástico y exponer a la pantalla de imágenes de fósforo en una autorradiografía casete O / N. A la mañana siguiente, escanear la pantalla para obtener la imagen (Figura 6). El uso de imágenes de software de análisis de densitometría, este método permite la cuantificación precisa, respecto de las especies de lípidos A.

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Representative Results

Lípido A de E. canónica coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium es un disacárido hexa-acilada de glucosamina con grupos fosfato en las posiciones 1 - y 4 'posiciones. Durante el crecimiento en medios ricos (por ejemplo, caldo de Luria) una porción del lípido A contiene un grupo pirofosfato en la posición 1 produciendo una especie-tris fosforilada 36 (Figura 1). Kdo (-D-manno-octulosonic 3-desoxi ácido), está unido en la 6'-hidroxilo y sirve como un puente para enlazar lípido A a los dominios de carbohidrato restantes (es decir, de oligosacáridos de núcleo y dominios O-antígeno) de LPS. Aunque las bacterias gram-negativas comparten una vía conservada para la biosíntesis del lípido A similar a la de E. coli K-12, hay una gran cantidad de diversidad en las estructuras de lípido A. Esta diversidad surge de la acción de enzimas latentes que modifican la estructura de un lípido, que se activan en respuesta a los estímulos ambientales. Para EJEMPLOSle, en S. enterica los grupos fosfato del lípido A se pueden modificar con la catiónico de azúcar de L-4-aminoarabinosa (Figura 1; azul) o con un resto de fosfoetanolamina (Figura 1; magenta). En Salmonella estas modificaciones están reguladas por sistemas de regulador de la respuesta de dos componentes, añadido en respuesta a bajo [Mg 2 +], pH suave ácida, y la presencia de péptidos antimicrobianos catiónicos. Además en Salmonella, palmitato puede añadirse para formar un lípido A hepta-acilado, que promueve la resistencia a péptidos antimicrobianos catiónicos (Figura 1; verde) 8. Otras modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la eliminación de grupos fosfato y cadenas de acilo, o dioxigenasa adición catalizada de un grupo hidroxilo en la cadena acilo secundaria 3'-ligado observado en un número de organismos 1,3.

Aislamiento de lípidos intactos Una de células enteras por nuestra modificación del método de Caroff y Raetz se describe en el protocolo 1 (Figura 2). Este método de aislamiento se ha utilizado para estimar que existen 10 6 moléculas de lípido A por célula bacteriana de E. coli 37. Siguiendo los protocolos 1 y 3, el MALDI-TOF espectro de masas de iones negativos del lípido A de E. coli K-12 (W3110) produce el ion individualmente desprotonado ([MH] -) a m / z 1,796.20 como las especies observadas mayormente (Figura 3). MALDI-TOF MS se realizó en modo negativo-reflectrón para mejorar la resolución espectral. Alternativamente, la misma muestra de lípidos sometido a modo negativo nano-ESI (Protocolo 4) produce iones de lípido A predominantemente doblemente desprotonadas en m / z 898,1 indicado mediante [M-2H] 2 - (Figura 4). Iones Individualmente desprotonadas lípido A [MH] - am / z 1,796.20 son observables, pero son de menor abundancia relativa a [M-2H] 2 - iones (Figura 4). Especies múltiplemente cargados predominate al usar ESI. La fragmentación por CID (Figura 5A) o 193 nm UVPD (Figura 5B) se realizó en la [MH] - lípido A de iones de m / z 1,796.20. Estas técnicas pueden ser utilizadas para asignar mejor las estructuras químicas, en particular de las especies de lípido A que contienen las combinaciones complejas de modificaciones o modificaciones químicas previamente no caracterizados. Perfiles de fragmentación se muestran con líneas discontinuas que representan sitios de corte y se corresponden con los valores de m / z por debajo de cada estructura prevista (Figura 5). Los valores de m / z y sitios de corte destacan en fuente de color rojo representan los iones de productos únicos asociados con UVPD.

Como se describe en los protocolos de 6 y 7, 32 lípido marcado con P Un aislado de dos E. diferente coli K-12 cepas se analizaron por TLC (Figura 6). W3110 contiene lípidos en su mayoría-y bis tris fosforilada-A (Figura 6;carril de la izquierda), mientras que un patrón TLC más compleja se observa con 32 P-lípido A aislados de E. coli cepa WD101 (Figura 6; carril de la derecha) 38. WD101 produce lípido A muy modificada con aminoarabinosa (L-Ara4N) y fosfoetanolamina (PETN). Dado que tanto 1 - y 4 '- fosfatos están disponibles para la modificación, lípido A de WD101 puede ser descrito como individualmente modificado, que contiene sólo un L-Ara4N o PETN en cualquiera de fosfato, o doblemente modificado donde ambos fosfatos se modifican de una manera combinatoria. Además de la modificación en el 1 - y 4 '- fosfatos, también se observa además palmitato (ver Figura 1) y aumenta el valor de Rf de especies lípido A en este sistema de disolvente (Figura 6). Si se desea, el análisis de densitometría usando un PhosphorImager, se puede utilizar para cuantificable de estimación de cantidades relativas de las especies de lípido A dentro de la misma muestra.


Figura 1. Lípido A Representante estructuras de dominio de E. coli K-12 y S. enterica serovar Typhimurium. Se presentan modificaciones en la estructura de un lípido conservada (a la derecha), como se describe en resultados representativos. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2. Esquema del lípido A aislamiento procedimiento. Esquema representa la lisis química del sedimento celular bacteriano utilizando monofásico mezcla Bligh-Dyer, la centrifugación del lisado para sedimentar LPS, leve-a cid hidrólisis para liberar lípido A de polisacárido unido y purificación final de lípido A con dos fases de extracción de Bligh-Dyer. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3
Figura 3. Análisis MALDI-MS de lípido A aislados de E. coli K-12 (W3110). espectros obtenidos a partir de la media de> 300 disparos. Una sola carga [MH] - lípido A se observa como el ion molecular a m / z 1,796.2, que corresponde a una especie desprotonadas de la estructura que se muestra a la derecha.

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Figura 4. Análisis ESI-MS de lípido A aislados de E. coli K-12 (W3110) Solo [MH] y doblemente cargado-[M-2H] 2 -. especies de lípido A se observan como iones moleculares de m / z 1,796.2 y m / z 898,1, respectivamente.

La figura 5
Figura 5. MS / MS análisis del lípido A aislados de E. coli K-12 (W3110). disociación inducida por colisión (A) o fotodisociación ultravioleta (B) se usa para fragmentar el ión precursor de m / z 1,796.2. Iones UVPD productos específicos se indican en rojo. Un mapa de la fragmentación se proporciona (C), donde el negro líneas discontinuas indican la fragmentación asociada tanto con CID y UVPD y rojo las líneas discontinuas indican spe UVPDfragmentación específica. Los valores listados debajo del mapa fragmentación corresponden a masas exactas de [MH] -. Iones de productos Haga clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 6
Figura 6. Separación basada en TLC de especies de lípidos A aislados de E. coli K-12 32 P-etiquetados lípido A se aisló a partir de W3110 (carril izquierdo) o WD101 (carril derecho) y se separó en un sistema disolvente que contiene el tanque de TLC cloroformo:. piridina: 88% de ácido fórmico: agua (50:50:16 : 5 v / v).

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Discussion

En este protocolo hemos detallado el aislamiento de especies de lípido A partir de células enteras de bacterias, y descrito TLC o métodos analíticos basados ​​en MS para caracterizar químicamente el material aislado. Tandem espectrometría de masas es una estrategia poderosa para la caracterización estructural de novo de compuestos biológicos, y tiene un valor incalculable para la caracterización química de la panoplia de moléculas de lípido A se observan en la naturaleza. CID y UVPD son dos métodos de activación complementarias que crean diferentes tipos de iones de productos que ofrecen las huellas dactilares clave para lípidos moléculas A. Fragmentación MS / MS utilizando tanto CID y UVPD permite la elucidación de las diferencias sutiles de lípido A las estructuras, ofreciendo detalles más finos de la estructura química asignaciones. Los datos de este tipo son necesarios para establecer relaciones precisas estructura correlato / función en la biología de los lípidos una especie molecular. También hemos descrito el procedimiento para 32 especies de lípido A P-radiomarcaje en scultivos bacterianos centro escala, donde el patrón químico de 32 especies-P lípido A se puede visualizar utilizando TLC y autorradiografía.

Hay una serie de características para este protocolo que cualquier usuario debe tener en cuenta. Para preparaciones a gran escala de lípido A (protocolo 1), la proporción de disolvente de partida a cantidad de sedimento bacteriano se puede optimizar para mejorar el rendimiento global. Sin embargo, esta proporción sólo se puede determinar empíricamente. Las cantidades que se describen en este protocolo representa un buen punto de partida para la mayoría de las cepas bacterianas. Volúmenes de cultivo para la extracción de lípidos A y el aislamiento también se puede ajustar dependiendo de la cepa bacteriana que usted está trabajando. Por ejemplo, V. cholerae requiere al menos 200 ml de cultivo con el fin de obtener los espectros de masas de alta calidad, sin embargo, el volumen de cultivo de E. coli se puede escalar hasta 5 ml. Se requiere más material de partida (volúmenes de cultivo más grandes) para algunas especies bacterianas porque los hydrolysse paso que libera lípido A de LPS todo es menos eficiente. Por ejemplo los organismos que contienen una dioxigenasa Kdo funcional o Kdo quinasa muestran una disminución de lípidos produce una después de la hidrólisis ácida leve 39. A menudo, los mutantes con estructuras A de LPS / lípido alterados o de una especie bacteriana en particular son a menudo difíciles para sedimentar durante la cosecha de células. Por estas cepas, la longitud de la centrifugación se puede ampliar para aumentar el rendimiento. También de la nota, después de la lisis celular en una sola fase mezcla Bligh-Dyer y LPS se sedimentaron (véase el paso 1.9), pueden ser necesarias medidas adicionales de lavado para reducir la contaminación de fosfolípidos. Cuando el aislamiento de lípido A de E. coli o Salmonella, sólo se requiere un lavado. Sin embargo, si el aislamiento de lípido A partir de otros organismos (por ejemplo, V. cholerae o por Helicobacter pylori), se requieren etapas de lavado adicionales.

Después de la hidrólisis ácida suave en SDS, el rendimiento de las especies de lípido A con hidrofobicidad reducida (es decir, más phogrupos sphate> 2 o un menor número de cadenas de acilo <5) se pueden mejorar mediante el uso de una extracción de Bligh-Dyer ácida. Para los volúmenes utilizados en la sección Protocolo 1, añadir 225 l de HCl concentrado a la solución de SDS que contiene lípidos hidrolizado A seguido de 30 ml de cloroformo y 30 ml de metanol para una mezcla de dos fases de Bligh-Dyer de cloroformo: metanol: HCl 0,1 M (2:2:1.8, v / v). Para los volúmenes utilizados en la sección Protocolo 6 añaden 15 l de HCl concentrado a la solución de SDS que contiene lípidos hidrolizado A seguido de 2 ml de cloroformo y 2 ml de metanol produciendo una mezcla de cloroformo: metanol: 0,1 M HCl (2:2:1.8, V / v). Después de una extracción de Bligh-Dyer ácida, piridina se puede añadir a las fases inferiores combinadas para neutralizar el ácido (1 gota de piridina / 2 ml de volumen final de la muestra). Este paso adicional se debe realizar antes de secar la muestra, en una campana de humos química. Tener cuidado de no utilizar el exceso de piridina, que puede conducir a la eliminación de ácidos grasos unidos a éster. Además, si el samp lípidosLe es difícil de secar bajo nitrógeno, añadir unos pocos mililitros de cloroformo: metanol (4:1, v / v) al matraz y continuar para secar la muestra hasta su finalización.

La heterogeneidad química compleja de las especies A lípidos observados en algunos organismos (por ejemplo, V. cholerae, Yersinia pseudotuberculosis) a veces puede hacer que el análisis basado en MS-TLC o difícil. La cromatografía en columna se puede emplear aguas arriba de estas técnicas analíticas pre-fraccionarse especies aisladas lípido A en mezclas más simples. Intercambio de aniones con dietilaminoetil (DEAE)-celulosa es más comúnmente utilizado 40. Como pauta general lípido A modificado en cualquiera de las posiciones de fosfato, con grupos no ácidos como aminoarabinosa o fosfoetanolamina, eluye antes de especies no modificadas lípido A 40. Lípidos fosforilados-tris de manera similar un eluye bien después de las especies no modificadas bifosforilado 36,40. Cromatografía de fase inversa se puede utilizar para fraccionar lípido A especies de diversos grados de hidrofobicidad 41. La cromatografía de columna también es útil en la eliminación de SDS residual después de la hidrólisis ácida suave y subsiguiente lípidos Bligh-Dyer A etapas de extracción. Los altos niveles de SDS residuales pueden contribuir a la supresión de la señal en los espectros obtenidos por nuestros protocolos sensibles ESI-MS.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por becas AI064184 y AI76322 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y por Grant 61789-MA-MUR de la Oficina de Investigación del Ejército de MST investigación también fue apoyada por Welch Beca de la Fundación F1155 y NIH subvención R01GM103655 a JSB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

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References

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Henderson, J. C., O'Brien, J. P.,… More

Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

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