Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50623
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

Summary

Gram-negatif bakterilerin lipopolisakarit (LPS) lipid A alanı izolasyonu ve karakterize edilmesi, hücre yüzeyi antibiyotik direnç mekanizmaları göre, bakterinin yaşamda kalması ve spor ve nasıl kimyasal olarak çeşitli lipit A moleküler türün farklı olarak ana doğal immün yanıtları modüle fikir verir.

Abstract

Lipopolisakarid (LPS) dış zar iki tabakalı dış yaprakçıkta biriken gram-negatif bakterilerin en büyük hücre yüzey molekülüdür. LPS üç sahaya bölünebilir: distal O-polisakarit, çekirdek oligosakkarit ve lipid, bir lipit içeren bir etki moleküler türleri ve 3-deoksi-D-manno-okt-2-ulosonic asit kalıntıları (Kdo). Lipid A etki bakteriyel hücre hayatta kalması için gerekli olan tek bileşendir. Sentezi takiben lipid A kimyasal olarak antibiyotik bileşiklere karşı direncini arttırma ve ana doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin aracılar tarafından tanınması kaçınmak için, bu tür pH ve sıcaklık gibi çevresel strese cevap olarak modifiye edilir. Aşağıdaki protokol, gram-negatif bakterilerin lipid A'nın küçük ve büyük ölçekli izolasyon detayı. İzole edilen malzeme, daha sonra, kimyasal, ince tabaka kromatografisi (TLC) veya kütle spektrometrisi (MS) ile karakterize edilir. Buna ek olarak, F lazer desorpsiyon / iyonizasyon süresi matris destekliışığı (MALDI-TOF) MS, aynı zamanda Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) bağlanmış elektrosprey iyonizasyon (ESI) ve yeni kullanılan ultraviyole Fotodissosiasyon (UVPD) yöntemleri kullanılarak lipid A moleküler türler analiz etmek için tandem MS protokolleri açıklanmıştır. Bizim MS protokolleri benzersiz veya yeni kimyasal modifikasyon içeren lipid A molekülleri karakterizasyonu için çok önemlidir, kimyasal yapının, şüphe götürmez belirlenmesi için izin verir. Ayrıca, TLC ile analiz için bakteriyel hücrelerden lipid A'nın radyoizotopik etiketleme, ve daha sonra izolasyon, tarif etmektedir. MS tabanlı protokol ile karşılaştırıldığında, TLC bir daha ekonomik ve hızlı bir karakterizasyonu yöntem sağlar, ancak açık bir şekilde bilinen bir kimyasal yapıya standartlarının kullanımı olmayan bir kimyasal yapıları lipid atamak için kullanılamaz. Son yirmi yılda lipid A izolasyonu ve karakterizasyonu gram-negatif bakteriler, antibiyotik direnci mekanizmalarının fizyolojisinin anlayışımızı geliştirdik ki çok heyecan verici keşiflere yol açmıştırmesafe, insan doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ve antibakteriyel bileşiklerin geliştirilmesinde bir çok yeni hedefler sağlamıştır.

Introduction

Lipopolisakarid (LPS) neredeyse tüm gram-negatif bakterilerin en büyük dış yüzey molekülü olan ve üç molekül etki oluşmaktadır: merkezden uzak bir O-antijen polisakarit, çekirdek oligosakkarit ve zara bağlı lipid dış yaprakçıkta biriken bir etki dış zar iki tabakalı 1,2. Lipid A alanı, lipid A yumuşak asit hidrolizi 1 üzerine LPS'nin kloroform çözünür bölümü olarak tanımlanabilir 3-deoksi-D-manno-okt-2-ulosonic (Kdo) artıkları ve bir lipit A moleküler türün oluşmaktadır 2. Model organizma Escherichia coli (E. coli), 1,2 gözlenen büyük lipid A türleri ile tutarlıdır; standart lipid A molekül kimyasal heksa-asilatlanmış ve bis-fosforile edilmiş olan bir omurga diglucosamine olarak tanımlanabilir. Gram-negatif bakteriler boyunca muhafaza edilmiş dokuz kurucu olarak ifade edilen genler, lipid üretiminde bir alanı (Şekil 1), 1,2 sorumludur. Bir çok bakteri lipid A 3 daha başka kimyasal modifikasyonu katılma filogenetik koruma derecesi değişebilir genlerin ek dizi vardır. Defosforilasyon, asil zincirleri çıkarılması ve amino şekerler (örneğin amino-arabinoz) ve / veya fosfoetanolamin gibi kimyasal kısımların ve buna ek olarak en sık gözlemlenen etkinlikleri ve (Şekil 1) bulunmaktadır. Lipid A modifikasyonu sorumlu enzimlerin çoğu doğrudan bu iki değerli katyonları gibi tabiata ait sinyallerle aktive edilir, ya da sentezleme, iki bileşenli tepki düzenleyici sistemler 3 düzenlenir.

Host doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından lipid A türlerin tanınması Toll-benzeri reseptör 4/myeloid farklılaşma faktörü 2 (TLR4/MD2) co-reseptör 4 aracılık eder. MD2 ve lipid A asil zincirleri, aynı zamanda, TLR4 ve lipid A 1 ve 4 ', fosfat grupları dudağın güçlü bir ilişki teşvik arasında var olan hidrofobik kuvvetlerTLR4/MD2, 4,5 ile kimliği bir. Asilasyon durum ya da lipid A negatif yük etki TLR4/MD2 göre lipid değiştirmek modifikasyonlar A tanıma ve doğal bağışıklık yanıtının uyarılması alt NF-KB ve örneğin TNFa ve IL1-β, 6,7 enflamasyon medyatörleri harekete geçiriciler kullanılmaktadır. Lipid A'nın negatif şarjının maskelenmesini modifikasyonları da hücre yüzeyleri 3,8 gram-negatif bakteri bağlanmasını katyonik antimikrobiyal peptitler engeller. Birçok lipid A modifikasyon örneğin, insan ev sahibi içinde veya ekolojik bir niş gibi özel çevre koşulları altında, bakteri sağlığını arttırmak için öne sürülmüştür. Bu nedenle birçok modifikasyon enzimleri antimikrobiyal bileşiklerin rasyonel gelişme çekici hedeflerdir. Lipid A yapılarının kimyasal çeşitliliği, organizma ve / veya çevreye ve bu çeşitli yapıların biyolojik etkileri ile ilgili olarak lipid A'nın yapısal karakterizasyonu t önemli bir çaba yapmakO gram-negatif bakterilerin çalışma.

Bütün bakterilerden lipid A molekülleri izolasyonu nihai saflaştırma prosedürü 9-11 ardından bakteriyel hücre yüzeyinden LPS'nin çıkarma, lipit A serbest bırakmak için bir hidrolitik aşamasını içerir. En sık atıf LPS ekstraksiyon prosedürü ilk Westphal ve Jann 10 tarafından tanıtılan, sıcak-fenol su çıkarma işlemdir. Bütün kimyasal olarak ekstre LPS lipid A'nın uzak glukozamin şeker (Şekil 1) 6'-hidroksil KDO ayıran hafif asit hidrolize tabi sonra. Çok sayıda tuzaklar yüksek bir tehlike reaktifin kullanılması da dahil olmak üzere, sıcak-fenol su prosedürü için mevcut ko-ekstre edilmiş nükleik asitler ve proteinler, ve birkaç gün indirgeme için ihtiyaç protokolü 10 tamamlamak için gereklidir.

İlk Caroff ve Raetz 12,13 tarafından geliştirilen Bizim laboratuvar ayrıca lipid A'nın çıkarma ve izole geliştirdi. Sıcak-fenol su işlemleri ile karşılaştırıldığında, burada sunulan yöntem daha hızlı ve daha verimli ve 5 ml birden litre kültür hacimleri geniş bir aralıkta. Ayrıca, sıcak fenol su ekstresini aksine, bizim yöntem lipit A türlerin optimal iyileşme sağlayan, LPS kaba veya pürüzsüz türleri için seçmez. Protokolde, bütün bir bakteri hücrelerinin kimyasal liziz LPS, santrifüjle topaklar haline edilebilir bir kloroform, metanol ve sudan oluşan bir karışımı kullanılarak gerçekleştirilir. Hafif asit hidrolize ve solvent ekstraksiyon (Bligh-Dyer) içinde bir arada kovalent bağlı polisakarit lipit A serbest bırakmak için kullanılır. Bligh ve Dyer bir yöntem ilk olarak 14, dokular, hayvan ve bitki çeşitli lipid türlerin çıkarılması için uygulanan bu son adımda ayırma lipid A'dan hidrolize polisakarit ayırmak için burada modifiye edilmiş, kloroform çözünür lipidler seçici bir alt organik bir şekilde bölünmezler aşaması. Bundan başka, lipid A saflaştırılması için ters fazlı ya daAnyonik değiştirme kolon kromatografisi 12 kullanılabilir.

Tüm hücrelerden lipid A türlerinin izole edildikten sonra, analitik bir dizi yöntem bu NMR ve TLC ve MS-esaslı analizi gibi izole edilmiş malzemenin kimyasal yapısını karakterize etmek için kullanılabilir. NMR tahribatsız yapısal açıklama için izin verir, ve glikosidik bağlantıları, asil zinciri pozisyonların kesin atama ve amino-arabinozun veya fosfoetanolamin 15-17 gibi lipit A değişiklikler için ek siteler ödevle ilgili yapısal ayrıntı sağlar. Lipid A'nın NMR analizi eden protokol içinde ele değildir, fakat başka 15,16 yeterince tarif edilmiştir. Hızlı analiz için TLC yöntemler sıkça kullanılır dayalı, ama ince kimyasal yapısına ilişkin doğrudan bilgi sağlamak için başarısız. MS temel protokoller lipid A yapıları 18,19 karakterize etmek için en çok kullanılan bir yöntemdir. Matrix ilişkili lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI)-MS genellikle başlangıçta sağlam lipit A türlerini araştırmak için kullanılır. Tek yüklü iyonların daha analit eden ekstraksiyon prosedürlere göre hazırlanmıştır oluşturulur. Daha ince yapısal analiz gerekli olduğu gibi, MS / MS tabanlı yöntemler MALDI-MS'den daha bilgilendirici kanıtlamak. Yapısal bilgi ürün iyonları 18,20,21 oluşturmak için, (ESI) bir ön-madde iyonları Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) ya da mor ötesi Fotodissosiasyon (UVPD) ile daha da parçalanmış olan, tek başına veya çok yüklü lipid iyonizasyon elektrosprey Akuple. Bir ön-madde iyonları lipid Nötr kaybı ürünler ayrıca sık sık yapısal bilgileri ve ek bir tabaka sağlayan ESI-MS sırasında oluşturulur.

Tandem kütle spektrometrisi (MS / MS) lipid A yapıların açıklanması için vazgeçilmez ve çok yönlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. MS / MS sırasında, ön-madde iyonları iyon yapısını aydınlatmak için kullanılabilecek bir tanı parçalanma desen vermek üzere aktive olur. En yaygın olarak available MS / MS metodu olup CID. Bu yöntem, ayrışma yol açar enerji birikimi ile sonuçlanır, bir atıl gaz ile, hedef seçilen haberci iyon çarpışmaları yolu ile parçası iyonlar üretir. CID bakteri türlerinin 22-33 geniş bir yelpazesi için bir lipid yapının atama önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır.

CID en evrensel olarak uygulanan MS / MS metodu da, bu ürün, iyonların sınırlı dizisi oluşturur. 193 nm UVPD alternatif ve tamamlayıcı bir MS / MS yöntemi. Bu yöntem iyon ışın tedavisi için bir lazer kullanmaktadır ve fotonların emme iyonları ve sonraki ayrışma enerjilendirilmesi ile sonuçlanır. Bu yüksek enerji, MS / MS tekniği CID daha ürün iyonların daha çeşitli bir dizi üretir ve böylece daha bilgilendirici parçalanma desen sağlar. Özellikle, UVPD glukan, amin, asil ve CC bağlantılı tahviller 18,21,34 de bölünmelere dayalı lipid A türlerde ince değişiklikler hakkında bilgi verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bütün çözeltiler, aşırı saf su ve HPLC dereceli metanol ve kloroform ile hazırlanmalıdır. , Metanol, kloroform, veya piridin ve konsantre asitler ya da bazlar gibi organik çözücüleri de ihtiva hazırlanan çözeltiler hazırlanmış ve kimyasal bir davlumbaz altında kullanılmalıdır. Bütün çözeltiler, oda sıcaklığında saklanabilir. Solventler kapaklar kaplı cam dereceli bir silindir ölçülür ve PTFE ile cam solvent şişelerde muhafaza edilmelidir. Uzun süreli saklama için kloroform içeren çözücüler fosgenin üretimi, yüksek ölçüde reaktif bir asit klorür önlemek için renkli amber cam şişeler içinde saklanmalıdır. PTFE santrifüj tüpleri ve döner buharlaştırıcı balona kullanımdan önce metanol ve kloroform ile durulanmalıdır. Çözücüler ve / veya radyoaktif atıkların atılmasının gerektiğinde federal, eyalet ve / veya kurumsal atık bertaraf düzenlemelere uyun.

1.. Büyük Ölçekli Lipid A özütleme (50 mi 1.5 L)

  1. Bir tek fazlı Bligh-Dyer karışımı hazırlayın: kloroForm-metanol-1X fosfat tuzlu su (PBS), pH 7.4 tampon, 1:2:0.8 v / v). Kloroform ve 200 mi, 1 L şişe içinde solvent PBS 400 ml metanol ve 160 ml birleştirin. Cap şişe ve çevirerek karıştırın (> 30x). Havalandırma ve mühürlü saklamak için karıştırma sırasında periyodik kapağını gevşetin.
  2. Bir ön-dengelenmiş olarak, iki fazlı karışım, Bligh-Dyer-kloroform hazırlayın: metanol: su (2:2:1.8 v / v). Kloroform 400 ml, 400 ml metanol ve 1 L çözücü şişede 180 ml su birleştirin. Cap şişe ve çevirerek karıştırın, havalandırma karıştırma sırasında periyodik kapağını gevşetmek için emin olun. O / N ve mağaza mühürlü muvazene edelim.
  3. Zayıf asit hidrolizi tamponu hazırlayın (50 mM sodyum asetat, pH 4.5, 1% sodyum dodesil sülfat (SDS)). Zayıf asit hidrolizi tamponu 500 ml için, sodyum asetat, 2.05 g ağırlığında bir 500 ml'lik bir cam kaba transfer edilir. Daha sonra 50 ml% 10 SDS eklemek, ~ 350 ml ve karıştırmaya bir hacme kadar su ilave edilir. Karıştırın ve 4.5 pH ayarlamak için, dereceli bir silindire aktarın ve 500 ml su ilave edilir.
  4. Hazırlamakkloroform: metanol (4:1, v / v): 100 ml kloroform ölçün ve şişe çözücü aktarın. Metanol 25 ml ölçün ve kloroform ile karıştırın. Amber cam şişede saklayın.
  5. Tek bir bakteriyel koloniden ortam 5 ml (Luria brot ya da diğer) inoküle. 37 ° C'de O / N büyütün, ya da büyümesi için gerekli olan C. Ekstraksiyon işleminin bir şeması Şekil 2'de gösterilmiştir.
  6. Ertesi gün, OD 600 ölçmek ve 0.05 'lik bir başlangıç ​​OD 600 kültür 200 ml aşılamak için 5 ml O / N kültür kullanın. 0,8-1,0 600 ulaşılana kadar bir OD hücreler büyür.
  7. 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. Daha uzun spin kötü pelet suşları için gerekli olabilir. Medya Süpernatantı dökün.
  8. 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 50 ml hücre pelletini yıkayın. Pelet hücreleri santrifüj tekrarlayın. -20 ° C'de süpernatant ve mağaza hücre pelet dökün ya da 1.9 adıma geçin.
  9. 40 ml süspansiyon hücreleri1x PBS ve (hücre süspansiyonu / tüp 20 ml gr), iki 250 ml PTFE santrifüj tüpleri arasında bölmek. Tek faz Bligh-Dyer için, her tüpe 25 ml kloroform ve 50 ml metanol ekleyin (kloroform: metanol: su; 1:2:0.8 v / v) (Şekil 2). Ters çevirerek karıştırınız ve komple hücre lizizi sağlamak için> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  10. 20 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje karışımı. Bununla birlikte, fosfolipid, izoprenil yağlar, ve küçük hidrofobik peptitler, süpernatan içinde kalır; LPS protein ve nükleik asit (Şekil 2) ile birlikte topak olacaktır. Süpernatant atın.
  11. ~ 100 ml bir faz Bligh-Dyer karışımı ile LPS pelet yıkayın. 20 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj. Süpernatant atın. E lipit A izole zaman E. coli veya Salmonella, tek bir yıkama gereklidir, ancak ek bir yıkama adımları bir organizmalardan lipid izole edilerek zaman fosfolipid kirlenmeyi azaltmak için gerekli olabilir.
  12. Mi 27 ml ekleyinld asit hidrolizi tampon LPS pelletine (50 mM sodyum asetat, pH 4.5,, 1% SDS adım 1.3) ve sadece küçük parçacıkların kalıncaya kadar aşağı yukarı pipetleme ile karıştırın. Sonikasyon homojen olarak% 50 çıkışında 20 saniye boyunca bir sabit görev döngüsü prob ucu sonikatör ile çözelti içinde tekrar süspansiyon LPS pelet. Örnek 2x (patlamaları arasında 20 sn / patlama, ~ 5 saniye) Sonikasyon tekrarlayın.
  13. 30 dakika boyunca bir su banyosu içerisinde kaynatın örnekleri. Dikkat: kapaklar sıkı, ancak tam kapalı olmadığından emin olun. Vibrio cholerae (V. cholerae) gibi bazı organizmalar, su banyosundan çıkarın ve şişe örnek geçmeden önce oda sıcaklığına soğumaya bırakın lipid A'nın genel verimini artırmak için daha uzun bir bekleme süresi (1 saat) gerektirir.
  14. , Hidrolizden sonra lipidlerin çıkarılmasına bir kloroform, kloroform ve 30 ml metanol ve 30 ml ilave etmek suretiyle, iki fazlı Bligh-Dyer (Şekil 2) kanşımı içine SDS çözeltisi dönüştürmek için: metanol: su (2:2:1.8, v / v) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Ters çevirerek karıştırın ve 2 'de, 10 dakika için örnek santrifüj,000 x g. Cam bir pipet kullanarak temiz bir PTFE santrifüj tüpü içine alt fazı ayıklayın.
  15. Adım 1.14 gelen üst faz, bir ön-dengelenmiş iki fazlı Bligh-Dyer karışım (adım 1.2) daha düşük fazın 30 ml ilave etmek suretiyle ikinci bir ekstraksiyon gerçekleştirin. Karışım, daha sonra 10 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüj. Alt fazı ayıklayın ve adım 1.14 çıkarılan alt aşaması ile havuzu.
  16. Metanol: önceden dengelenmiş iki fazlı Bligh-Dyer üst faz iki fazlı bir Bligh-Dyer karışım (kloroform oluşturmak için (adım 1.2) 114 ml ilave etmek suretiyle toplanmış alt evrelerini (60 ml toplam), yıkama suyu, 02:02: 1.8, v / v). Karıştırın. 10 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj.
  17. Döner buharlaştırma (Şekil 2) kullanılarak temiz bir cam bir döner buharlaştırıcı kabına ve kuru numune için alt faz çıkarın.
  18. Şişenin taraftan lipidin süspansiyon içinde yardımcı olmak üzere döner bir şişede metanol (4:1, v / v), ve banyo-ses dalgalarına maruz bırakın (> 30 saniye): 5 kloroform ml ilave edilir. Temiz bir lipidin aktarmak için bir aktarma cam pipet kullanıncam tüp (13 x 100 mm veya daha büyük) PTFE ile kaplı fenolik vidalı kapakları kaplı. , Bir nitrojen kurutucu kullanılarak bir nitrojen akışı altında Kuru örnek.
  19. Kloroform içinde 1 ml kuru lipid süspanse: metanol (4:1, v / v). Küçük hacimlerde kullanarak daha fazla nicel süspansiyonu için konik bir üs (aletler / reaktiflerin tabloya bakınız) küçük cam numune şişesine (12 x 32 mm) aktarın. Bir azot makinesi kullanarak kurutun.
  20. Kurutulmuş örnek daha sonra, TLC (Protokol 2) veya MS analizi (Protokol 3, 4, ya da 5) kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir. (Not: Malzeme izole ve sonraki protokollerde kullanılan miktarı çoğu organizmalar için yeterli ne dayalı önerilmektedir aynı lipid örnek Protokolleri 2-5 kullanılabilir kaldırıldı% malzemenin not alarak daha fazla bilgi için Tartışma bakın...).

2. İnce Tabaka Kromatografiyle Lipid A Türlerin görselleştirme

  1. TLC, hareketli faz olarak çözücü sistemi hazırlayın (: piridin:% 88 formik asit: kloroform su; 50:50:16:5 v / v). Combinkloroform e 200 mi, 200 ml piridin içinde, bir 1 L şişe içinde solvent 64% 88 formik asit ml ve 20 ml su. Cap şişe, inversiyon birden çok kez karıştırın ve havalandırma.
  2. 20 x 20 cm tabak barındıracak bir TLC tankı kullanın. ~ 40 cm kromatografi kağıdı ile hat TLC tankı.
  3. Piridin:% 88 formik asit: su (50:50:16:5, v / v) kanşımı TLC tanka kloroform içinde 200 ml. Tank, genellikle O / N tercih edilir ve daha uygun,> 3 saat boyunca ön denge sağlaması için izin verin.
  4. Dondurucu kurutulmuş lipid örnekleri çıkarın (1,20 adıma) ve RT ılıştırıldı.
  5. Bir tıraş bıçağı ile bir silika jel 60 TLC levhası üst kenarından silis çıkarın. Sıkıcı bir kalem kullanarak, plakanın alt, alttan 2 cm paralel bir çizgi çizin. Bu hat örnekleri tespit için kökenlidir. Mark 1 cm arayla örnekleri nokta bu referans hattı boyunca artırır.
  6. Kloroform 200 ul aşama 2.4 kurutuldu, lipid çözülür: metanol (4:1, v / v), girdap ve sonikasyon (3x, her biri ~ 15 saniye), verim ~ 100 -E çıkarılan 500 ng / ml lipid A ise coli.
  7. Adım 2,5 işaretlenmiş bir microcapillary cam pipet kullanarak, TLC plakası üzerine hacminin (20 ul) onda birini nokta. 15 dakika için ~ TLC plakası üzerinde kurumaya örnekleri izin verin. (Not: küçük cam şişeler içinde Numuneler, bir nitrojen kurutucu kullanılarak kurutulur ve protokoller 3-5 daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza edilebilir çıkarıldı% malzeme not edin.).
  8. Önceden dengelenmiş tanka lekeli örneklerini içeren TLC plaka koyun. Çözücü ön TLC plakasına (~ 2.5-3 saat) üst ulaştığında, plaka ve hava kuru (> 60 dk) çıkarın. Soğuk hava gun tam kuruluğa sağlamak için kullanılabilir.
  9. Plaka kururken, yanmaları için 250 ° C'de sıcak plaka açın.
  10. , Havalandırmalı kimyasal bir davlumbaz olarak, silis TLC plakası üzerinde çözüldü lipitler yanmaları için% 10 sülfürik asit-etanol karışımı hazırlanması (konsantre edilmiş sülfürik asit:% 100 etanol; 01:09 v / v). Sülfürik asit 10 ml ölçün ve% 100 etanol içinde 90 ml kadar yavaş yavaş ekleyin. Bakımtamamen karıştırın ve bir cam kromatografik reaktif atomizöre transfer.
  11. Duman başlığı içinde,% 10 sülfürik asit-etanol karışımı ile kurutuldu, TLC plaka sprey için bir cam kromatografik reaktif atomizer kullanın. Plaka üzerinde eşit bir karışım sprey.
  12. Kömürleşmiş lipit örnekleri siyah / kahverengi lekeler (<1 dak) olarak görünür kadar 250 ° C sıcak plaka üzerine TLC plakası yerleştirin. Bu tüm plaka kahverengi açmak için neden ve lipid A türlerin görselleştirme zor yapacak, plaka overexpose etmeyin.

3. MALDI-TOF kütle spektrometresi yolu ile lipid A'nın yapısal Karakterizasyonu

  1. Adım 1.20, (veya adım 2.7) kaynaktan dondurucudan lipid A örneği kaldırmak ve oda sıcaklığına ılıştırıldı. Kuru lipid ~ bir örnek tekrar 20 ul kloroform: metanol (4:1, v / v) ve E ekstrakte edilen bir ~ 1-5 mg / ml lipid A çözelti elde etmek için girdap coli. (Not:% 10 daha az yoğun, adım 2.7 den kullanılan malzeme).
  2. ATT matris bileşenleri hazırlayın. Doymuş 6-aza% 50 asetonitril-2-tiyotimin: 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne su ve 500 ul asetonitril içindeki 500 ul ekleyin ve sonra eklemek> 10 mg 6-aza-2-tiyotimin% 50 asetonitril süper doymuş böylece. Doymuş tribazik amonyum sitrat çözeltisi: çökeltilmesi, 500 ul su ile> 1 mg ekleyin aşikar olmalıdır. Kullanmadan önce Vortex ve santrifüj çözümleri; sadece doymuş yüzer kullanılır.
  3. ATT matris karışım hazırlayın:% 50 asetonitril, doymuş 6-aza-2-tiyotimin, tribazik, doymuş amonyum sitrat (20:1, v / v). MALDI plakasına uygulamadan önce 500 ul mikro santrifüj tüpüne, karıştırmak için girdap ve santrifüj tribazik amonyum sitrat çözeltisi, doymuş 1 ul ATT çözeltisinin 20 ul eklenmesi ile birlikte matris bileşenlerini karıştırın.
  4. En doğru kütle / yük oranı belirlenmesini sağlamak için, numuneler, yatırılır yere yakın bir noktada MALDI plakaya 0.5 ul kalibrant karışımı ekleyerek MALDI plaka hazırlayın.
  5. 0.5 ul Yatirmamlipid A numunesi yatırılır olacak her noktada MALDI tabağa ATT matrisi.
  6. Plaka karıştırın ve en uygun iyon sinyalleri için tarama numunesi tarafından spektrumu (Şekil 3) elde etmek için ATT matrisin nokta üzerine Deposit örnek 0.5 ul (toplam numune% 2.5). Not: en uygun MS sinyali tutarlar organizma ile değişir ve ampirik olarak tespit edilmesi gerekiyor olabilir. Daha fazla malzeme eklemek için bir 0.5 ul lekeli karışım daha numunenin eklenmesinden arasında kurumasını sağlayan birden çok kez nokta olabilir. Örnek, aynı zamanda (a daha küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon ve kuru) konsantre edilmiş veya gerektiğinde seyreltilebilir. Daha başlangıç ​​malzemesi (hücre kültürü başlangıç ​​hacmi) da (tartışmaya bakınız) kullanılabilir.

4. Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometrisi ve Lipid A Çarpışmanın neden olduğu ayırma

  1. Bir kloroform hazırlayın: metanol çözücü karışımı (1:1, v / v), bir cam sol içinde 200 ml HPLC dereceli kloroform ile HPLC dereceli bir metanol 200 ul stok karıştırılarakşişe delik.
  2. (Adım 1.20, 2.7, 3 ya da Protokol sonra kurutuldu, ikinci gibi) lipid A ile şişeye metanol çözücü karışımı ve lipid 5 dakika için ya da tüm malzeme çözülünceye kadar bir çözelti sonikasyon: kloroform 200 ul aktarın.
  3. Negatif mod elektrosprey iyonizasyon için kütle spektrometresi ayarlayın.
  4. 250 ul şırınga ve bir şırınga pompası kullanılarak, doğrudan 2,0-3,5 ul / dk 'lık bir akış oranında seyreltilmiş lipid A örneği aşılamak.
  5. Iyon optik tuning tarafından optimize etmek ve lipid A iyon sinyali geliştirmek. Tam Kütle spektrumu artık lipit A türlerinin (Şekil 4) toplanabilir.
  6. Yalıtmak ve MS / MS yöntemi olarak CID seçerek hedef lipit A'yı etkinleştirmek.
  7. Bir tür yüksek ürün iyonu ile karşılaştırıldığında yaklaşık% 10 nispi bolluk öncü lipid kadar CID gerilimi (veya normalize çarpışma enerjisi, NCE) artırın.
  8. Sinyal-gürültü yeterli th için elde edilene kadar, elde edilmesi ve ortalama spektrumlarıe ürün iyonları. Gerekli tarama sayısı, orijinal ön sinyal yoğunluğuna bağlıdır ve 3-300 taramaları (Şekil 5A) arasında olabilir.

5. Ultraviyole Fotodissosiasyon tarafından Lipid A MS / MS

  1. Adımlarda 4.1-4.5 gibi örnek ve kütle spektrometresi hazırlayın.
  2. Kütle spektrometresine arabirim lazer açın. Kitle spektometre cihazı bir 193 nm excimer lazer ile donatılmış ve aletin HCD hücrede UV aktivasyonunu sağlamak için modifiye edildi. Fotodissosiasyon önce 35 de tarif edilene benzer bir şekilde uygulanmıştır. Biz yüksek enerji C-trap ayrışma (HCD) hücre içine fotonlar iletmek için bir CaF2'nin optik pencere ile modifiye vakum manifoldu kullanın. Lazer pulse / gecikme jeneratörü kütle spektrometresi bir transistör-transistör mantığı (TTL) sinyali ile MS / MS sırasında tetiklenir.
  3. Lazer excimer lazer tetikleyecek böylece enstrüman yazılımı kurduğunuzdaiyonları HCD hücreye girin. Bu, yazılımın mütevazı bir değişiklik yapılmasını gerektirir.
  4. Lazer her 2 msn (500 Hz) darbeli olduğu gibi darbe jeneratörü açın.
  5. MS / MS yöntemi olarak HCD seçerek lipid A ön-madde izole iyonu ve% 1 NCE çarpışma enerjisi ayarlayın. Bu HCD hücre içinde ultraviyole ayrışması için ön-madde iyonları izolasyonunu sağlar. HCD hücre kullanılır, ancak yazılım bu aralıkta UVPD gerçekleştirmek için modifiye edilir.
  6. Lazer enerjisini lazer artırmak ve pals sayısını ayarlayarak, izole edilmiş lipid A iyonu etkinleştirir. Tipik bir deney UVPD on 6 ml darbeleri kullanılarak gerçekleştirilir.
  7. , Yeterli bir sinyal-gürültü UVPD ürün iyonları için elde edilene kadar aşama 4.8 'de olduğu gibi, elde etmek ve ortalama spektrumları. Gerekli tarama sayısı, orijinal ön sinyal yoğunluğuna bağlıdır ve 3-300 taramaları (Şekil 5B) arasında olabilir.

6.. 32 P-EtiketlemeLipid A ve sonraki İzolasyonu

  1. Tek bir koloniden ortam (Luria suyu ya da diğer ortam) 5 ml inoküle. 37 ° C ya da gerekli sıcaklıkta O / N büyütün.
  2. Ertesi gün, OD 600 ölçmek ve standart bir 20 x 150 mm atılabilir cam tüp kültür yetiştirilir ~ 0.05 'lik bir başlangıç ​​OD 600, kültür 7 ml aşılamak için O / N kültür kullanın. İnorganik 32 P. 2.5 uCi / ml ekleyin 0,8-1,0 600 ulaşılana kadar bir OD hücreler büyür. Federal, eyalet ve / veya radyoaktif maddelerin güvenli ve uygun kullanımı için kurumsal yönergeleri takip edin.
  3. PTFE ile 16 x 125 mm cam santrifüj tüplerine Hasat hücreleri 10 dakika için 1500 xg, sabit açılı bir klinik santrifüj kullanılarak kap dizildi. Uygun radyoaktif atık kabı içine süpernatant kaldırmak. Sonraki adımda üretilen tüm radyoaktif atıklar (örneğin sıvı, cam, biohazard) federal, eyalet uyarınca bertaraf ve / veya kurumsal gui olmalıdırdelines.
  4. 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 5 ml hücre pelletini yıkayın. 1500 x g 10 dakika boyunca santrifüj. Süpernatant atın.
  5. Tek fazlı Bligh-Dyer karışımı, 5 ml kloroformdan oluşan (Şekil 2) içinde süspanse hücreleri: metanol: su (1:2:0.8, v / v). Vortex karıştırın ve tam hücre lizizi sağlamak için> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe.
  6. 20 dakika boyunca 1500 x g'de klinik santrifüjünde santrifüj. Yavaşça fosfolipidler ve izoprenil lipitleri içeren süpernatant, dökün.
  7. 50 mM sodyum asetat, pH 4.5, 1.8 ml LPS pelletini, 1% SDS tampon girdaplanır. Pelet eşit dağılana kadar bir banyo sonikatörle sonicate örnek (~ 30 sn).
  8. Kaynayan su banyosu, 30 dakika için örnek inkübe edin. Emin kapaklar sıkı ama mühürlü değildir olun.
  9. Su banyosundan çıkarın ve örnek 5-10 dakika için oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
  10. 2 ml kloroform ve 2 ml ilave etmek suretiyle, iki fazlı Bligh-Dyer karışımına solüsyonu değiştirmekmetanol, bir kloroform elde edilmiştir: metanol: sulu (2:2:1.8 v / v) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Karıştırmak Vortex ve ayrı fazlar 1500 xg'de klinik santrifüj cihazında 10 dakika boyunca santrifüj.
  11. Bir cam pipet (ilk ekstraksiyon) kullanarak temiz bir cam santrifüj tüpü içine alt fazı ayıklayın.
  12. Adım 11 kalan üst faz (adım 1.2 'de olduğu gibi hazırlanmıştır) önceden dengelenmiş iki fazlı Bligh-Dyer alt faz 2 ml eklenerek numune üzerine bir ikinci çıkarma yapın. Vortex ve santrifüj 10 dk. Alt faz çıkarın ve birinci çıkartılmasından alt faz ile bir araya getirmektedir.
  13. Metanol: toplanmış alt faz (~ 4 mL toplam hacim) için, iki fazlı bir Bligh-Dyer çözeltisi (kloroform, sonuçta önceden dengelenmiş üst faz (adım 1.2) içinde 7.6 ml su ekleyin, 2:2:1.8, v / v). 10 dakika boyunca vorteks ve santrifüj.
  14. Temiz bir cam tüpe alt evresine çıkarın ve bir azot kurutma makinesi ile kurutun. Kurutulmuş numuneler sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

7. Visualiİnce Tabaka Kromatografisi ile 32 P-etiketli Lipid A Türlerin yon

  1. 2,1-2,8 adımları tarif edildiği gibi 32 P-etiketli lipid A örneği, TLC tankı ve TLC plakaları hazırlayın.
  2. 04:01 kloroform-metanol (v / v) 500 ul 32 P-etiketli örnek çözülür. Vortex ve banyo sonicate tamamen lipid malzemeyi eritmek için. Sintilasyon kokteyli ihtiva eden 5 ml sintilasyon şişesine örnek 5 ul ekle. Sintilasyon sayacında sayısı ve numunenin toplam sayım / dak hesaplar.
  3. Radyo-etiketli lipid türleri imgelerken, 10 x 20 cm veya 20 cm x 20 TLC plakaları kullanılabilir. Levhanın en uzun boyut (kökeni lekeli yani numuneler 10 cm kenarı üzerinde 2 cm işaretli) dikey şekilde 10x20 cm levhalar için, numuneler adım 2.5 işaretli kökenli birlikte tespit edilmelidir.
  4. Microcapillary pipet kullanarak, plaka üzerinde 10,000-20,000 cpm / örnek nokta ve noktalar (> 15 dakika) kurumasını bekleyin. Örnekler altında kurutma ile konsantre edilmesi gerekebilirazot ve 10,000-20,000 sayım / dakika / nokta (<10 ul toplam için her seferinde 2 ul ya da 2 ul) elde etmek için, uygun bir hacimde yeniden süspansiyon haline getirilmiştir.
  5. Önceden dengelenmiş tanka radyo-etiketli örneklerini içeren TLC plaka koyun. Çözücü ön TLC plakası (~ 3 saat) üst ulaştığında, plaka ve hava kuru (> 60 dk) çıkarın. Dikkat: piridinin eser miktarda fosforlu ekranlar zarar olarak piridin varlığında gerçekleştirilir TLC levhalar, kimyasal bir çeker ocak içinde iyice kurutulmalıdır. Soğuk hava gun tam kuruluğa sağlamak için kullanılabilir.
  6. Plastik wrap plaka sarın ve bir otoradyografisidir kaset O / N. fosforimager ekrana maruz Ertesi sabah, görüntüyü (Şekil 6) elde etmek için ekrana tarar. Görüntü dansitometre analizi yazılımını kullanarak, bu yöntem, lipid A türlerin, doğru nispi ölçümü sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

E. kanonik lipid A ve 4 '-pozisyonları - coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium bir heksa-asilatlanmış 1 de fosfat grupları ile glukozamin disakkarittir. Zengin ortam (örneğin, Luria Broth) büyüme sırasında lipid A kısmı, tris-fosforile türlerin 36 (Şekil 1) elde 1-pozisyonunda bir pirofosfat grubu içerir. Kdo (3-deoksi-D-manno-oktuiosonik asit), bağlı olup 6'-hidroksil ve LPS kalan karbonhidrat etki (yani çekirdek oligosakkarit ve O-antijen etki) lipid A bağlamak için bir köprü olarak hizmet vermektedir. Gram-negatif bakteriler lipid için korunmuş bir yol olsalar E: edilene benzer bir biyosentez E. coli K-12, lipid A yapılarda çeşitlilik büyük miktarda mevcuttur. Bu çeşitlilik, çevresel uyarılara cevap olarak aktif hale getirilen bir lipid yapının ve değişiklikler latent enzimlerin aksiyonu sonucu ortaya çıkar. Examp içinS. le, ya da bir kalıntı fosfoetanolamin (Şekil 1, kırmızı) ile, lipid A'nın enterica fosfat grupları, katyonik şeker L-4-amino-arabinozun (mavi Şekil 1) ile modifiye edilebilir. Salmonella olarak, bu değişiklikler, iki bileşenli tepki düzenleyici sistemleri tarafından düzenlenir, düşük [2 Mg +] tepki olarak hafif asidik pH ve katyonik antimikrobiyal peptitlerin varlığı ilave edildi. 8; Ayrıca Salmonella, palmitat (yeşil Şekil 1) katyonik antimikrobiyal peptitlerin direnç teşvik eden bir hepta-açillenmiş lipid A, oluşturmak için ilave edilebilir. Diğer modifikasyonlar arasında, bunlarla sınırlı olmamak üzere, fosfat grupları ve asil zincirleri, ya da dioksigenaz çıkarılması organizmaların 1,3 bir dizi gözlenen 3'-bağlı ikincil asil zincirine bir hidroksil grubunun eklenmesini katalize.

Caro metodunun modifikasyonu ile bizim bütün hücrelerden sağlam lipid A'nın izolasyonuff ve Raetz protokolü 1 (Şekil 2) tarif edilmektedir. Bu izolasyon yöntem, lipid A, 10 6 molekülleri E: bakteri hücre başına var olduğunu tahmin etmek için kullanılmıştır coli 37. Aşağıdaki protokoller 1 ve 3, E. lipid A'nın negatif iyon MALDI-TOF kütle spektrumu E. coli K-12 (W3110) tek başına deprotone iyon ([MH] -) verir oranda görülen bir tür olarak, m / z 1,796.20 (Şekil 3). MALDI-TOF MS spektral çözünürlüğü artırmak için negatif reflektron modunda yapıldı. (Şekil 4) - Alternatif olarak, negatif mod nano-ESI (Protokolü 4) tabi aynı lipid örnek [M-2H] 2 ile belirtilen m / z 898,1 de baskın olarak iki kat daha deprotone lipid A iyonları verir. Tekli deprotone lipid A iyonları [MH] -, m / z 1,796.20 de gözlemlenebilir, ancak [M-2H] 2 göreceli olarak düşük yoğunlukta olması - iyonları (Şekil 4). Çarp yüklü türler tabloya hakimNate ESI kullanırken. Bir iyon m / z 1,796.20 lipid - CID (Şekil 5A) ve 193 nm UVPD (Şekil 5B) ile parçalanması [MH] üzerinde gerçekleştirildi. Bu teknikler, özellikle daha iyi bir modifikasyon, daha önce karakterize Kimyasal modifikasyonların bir bileşimini ihtiva eden lipid A türlerin kimyasal yapılarını, atamak için kullanılabilir. Parçalanma profilleri bölünme mevkilerini temsil eden kesik çizgi ile gösterilir ve her yapı aşağıda verilen m / z değerleri (Şekil 5) ile eşleştirilir. M / z değerleri ve bölünme siteleri UVPD ile ilişkilendirilmiş benzersiz bir ürün iyonlarını temsil kırmızı yazı vurgulanır.

Protokolleri 6 ve iki farklı E izole 7, 32 P-etiketli lipit A da tarif edildiği gibi E. coli K-12 suşu TLC (Şekil 6) ile analiz edilmiştir. W3110 daha çok bis-ve tris-fosforile lipid A (Şekil 6, ihtiva etmektedir;Sol şerit), daha karmaşık bir TLC model E izole 32 P-lipid A ile görülmektedir, oysa coli suşu WD101 (Şekil 6, sağ şeritte) 38.. WD101 ağır amino-arabinozun (L-Ara4N) ve fosfoetanolamin (PETN) ile modifiye edilmiş lipit A üretir. Ve 4 '- - her ikisi de 1 yana fosfat modifikasyonu için kullanılabilir, WD101 lipit A fosfat, ya da her ikisi de çift fosfatlar, bir birleştirici bir şekilde tadil edilmiş olan tadil edilmiş ya da burada da bir L-ya da Ara4N PETN sadece ihtiva eden, hem tek başına modifiye tanımlanabilir. Ve 4 '- - 1 ile modifikasyon ek olarak fosfatlar, palmitat eklenmesi de gözlenmiştir (bkz. Şekil 1) ve bu solvent sistemi içerisinde lipit A türlerin Rf değeri (Şekil 6) artar. Eğer arzu edilirse, bir fosforimager kullanılarak densitometre analizi, aynı numune içinde lipid A türlerin tahmini nispi miktarları quantifiably kullanılabilir.


Şekil 1. E. Temsilcisi lipid bir etki yapılar E. coli K-12 ve S. enterica serovar Typhimurium. Korunmuş lipid A yapısına Değişiklikler Temsilcisi Sonuçlar açıklandığı gibi, (sağ) gösterilmektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Lipid şematik bir izolasyon prosedürü. Hatları tek fazlı Bligh-Dyer karışımı, LPS topak haline lizat santrifüj, hafif-A kullanılarak bakteriyel hücre pelet kimyasal lizizine tasvir cid bağlı polisakarittten lipit A'yı kurtarmak için hidroliz, ve iki faz Bligh-Dyer çıkarımı kullanarak lipid A'nın son saflaştırma. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. E izole lipid A'nın MALDI-MS analizi E. coli K-12 (W3110). Spectra> 300 atış ortalamasından elde edilmiştir. Tek yüklü [MH] - lipid A sağda gösterilen yapının bir deprotone edilmiş türlere tekabül m / z 1,796.2, en moleküler iyonu olarak görülmektedir.

0623/50623fig4.jpg "/>
Şekil 4. E izole lipid A'nın ESI-MS analizi E. coli K-12 (W3110) Tekli [MH] + ve çift yüklü [M-2H] 2 -. lipid A türleri, sırasıyla, m / z 1,796.2 ve m / z 898,1 moleküler iyonlar olarak gözlenir.

Şekil 5,
Şekil 5,. E izole lipid A'nın MS / MS analizi E. coli K-12 (W3110). Çarpışmanın neden olduğu ayırma (A) ya da mor ötesi Fotodissosiasyon (B) ön-madde iyon m / z 1,796.2 parçalara için kullanılmıştır. UVPD özel ürün iyonları kırmızı ile gösterilmiştir. Bir parçalanma haritası siyah çizgiler CID ve UVPD ile birliktedir parçalanma gösterir ve kırmızı çizgiler UVPD SPE gösterir kesik kesik (C), sağlanansifik parçalanma. Parçalanma harita altında listelenen değerler [MH] tam kitlelere uygun -. Ürün iyonları büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 6,
Şekil 6,. E izole lipid A türlerinin TLC dayalı ayırma E. coli K-12 W3110 A (sol şerit) veya WD101 (sağ şerit) izole edilmiş ve kloroform ihtiva eden bir depo TLC çözücü sistemi içinde ayrıldı, 32 P-etiketli lipid:. piridin:% 88 formik asit: su (50:50:16 5 v / v).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolde, bakterilerin bütün hücrelerden lipid A türlerin izole ayrıntılı ve kimyasal olarak, bu izole edilmiş malzemenin karakterize etmek için TLC ya da MS-analitik yöntemler tarif etmişlerdir. Tandem kütle spektrometresi biyolojik bileşiklerin de novo yapısal karakterizasyonu için güçlü bir stratejidir, ve doğada gözlenen lipid A molekülleri yelpazesine kimyasal karakterizasyonu için paha biçilemez. CID ve UVPD lipid A molekülleri için anahtar parmak izi sağlayan ürün iyonlarının değişik türleri oluşturmak iki tamamlayıcı aktivasyon yöntemleri vardır. CID ve UVPD hem kullanan MS / MS parçalanması veriyor kimyasal yapısı atamaları için ince ayrıntı sağlayan lipit yapıları ince farkları, aydınlatılması. Bu tür veri lipid A moleküler türün biyolojisinde hassas bağıntılı yapı / fonksiyon ilişkiler kurmak için gereklidir. Ayrıca, s 32-P, radyo-etiketleme lipid A türler için prosedür tarif etmişlerdir32 P-lipid A türlerin kimyasal model TLC ve otoradyografi ile görüntülenmiştir edilebilir merkezi çaplı bakteri kültürleri,.

Herhangi bir kullanıcı farkında olmalı, bu protokol için bir dizi özellik vardır. Büyük ölçekli lipid A preparatlar (protokol 1) için, bakteri pelet miktarı ile solvent, başlangıç ​​oranı genel verimi artırmak için optimize edilebilir. Bununla birlikte, bu oran, sadece ampirik olarak saptanabilir. Bu protokol açıklanan miktarlarda en bakteri suşları için iyi bir başlangıç ​​noktasını temsil eder. Lipid A çıkarma ve izolasyonu için kültür hacimleri de çalıştığınız bakteri suşu bağlı olarak ayarlanabilir. Örneğin, V için E için, ancak kültür hacmi; cholerae, yüksek kaliteli kütle spektrumu elde etmek için kültürün en az 200 ml gerektirir coli 5 ​​ml kadar küçültülmüş olabilir. Daha başlangıç ​​malzemesi (kültür daha büyük bir hacim) bir bakteri türleri için gereklidir, çünkü hydrolysBütün LPS lipid A Lig adım daha verimlidir. Örneğin, fonksiyonel Kdo dioksigenaz veya Kdo kinaz sergi içeren organizmalar yumuşak asit hidrolizi 39 sonra lipid A verim azalmıştır. Çoğu zaman, değiştirilmiş LPS / lipid A yapılar ya da belirli bir bakteri türleri ile de mutantlar genellikle hücre hasat sırasında topak zordur. Bu suşlar için, santrifüj uzunluğu verimini artırmak için uzatılabilir. Ayrıca Not, tek fazlı bir karışım Bligh-Dyer ve LPS hücre lizi sonrasında (adım 1.9) topak haline getirilir, ek yıkama adımları fosfolipid kirlenmeyi azaltmak için gerekli olabilir. E lipit A izole zaman E. coli veya Salmonella, tek bir yıkama gereklidir. Diğer organizmalar (örneğin V. cholerae veya Helicobacter pylori) lipid A izole Ancak, ek yıkama adımları gereklidir.

SDS indirgenmiş hidrofobiklik (yani daha fazla pho olan lipid A türlerin verimle yumuşak asit hidrolizi sonrasında> 2 sphate grubu ya da daha az asil zincirleri <5) bir asidik Bligh-Dyer ekstraksiyon kullanılarak geliştirilebilir. Protokol 1. bölümdeki kullanılan miktarlar için, 30 ml kloroform ve kloroform içinde iki fazlı bir Bligh-Dyer karışımı için 30 ml metanol ile hidroliz ve ardından lipid A ihtiva SDS çözeltisine konsantre HCl 225 ul ekleyin: metanol: 0.1 M HCl (2:2:1.8, v / v). : Metanol: Protokol bölüm 6'da kullanılan miktarlar, 2 ml kloroform ve kloroform elde edildi, 2 ml metanol, ardından hidroliz lipid A ihtiva SDS çözeltisine konsantre HCl 15 ul eklemek için, 0.1 M HCI (2:2:1.8, v / v) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Asidik Bligh-Dyer ekstre etmeden sonra, piridin asit (son numune hacminin piridin / 2 ml 1 damla) ile etkisiz hale getirmek için bir araya getirilmiş alt aşamaları eklenebilir. Bu ilave adım, kimyasal bir çeker ocak içinde, bir numuneyi kurutmak önce yapılmalıdır. Ester bağlı yağ asitlerinin kaldırılmasına yol açabilir aşırı piridin, kullanmak için dikkatli olun. Buna ek olarak, eğer lipid SAMPle, nitrojen altında kuru kloroform içinde birkaç mililitre eklemek zordur: metanol (4:1, v / v) şişeye ve tamamlanması için örnek kuru devam etmektedir.

Bazı organizmalar (örneğin V. cholerae, Yersinia pseudotüberküloz) gözlenen lipid A türlerin karmaşık kimyasal heterojenlik bazen TLC-veya MS-tabanlı analiz zorlaştırabilir. Kolon kromatografisi, daha basit karışımlar halinde izole edilmiş lipit A tür ön fraksiyonlanması Bu analitik teknikler üst kullanılabilecektir. Dietilaminoetil'den ile anyon değiştirme (DEAE)-selüloz en çok 40 kullanılır. Bu tür amino-arabinozun veya fosfoetanolamin olmayan asidik grup ile, fosfat, ya da tadil edilmiş konumda genel bir kural olarak lipid A gibi, modifiye edilmemiş lipit A türlerinin 40 önce çözülür. Benzer şekilde tris-fosforile lipid A zamanda, modifiye edilmemiş bisphosphorylated türleri 36,40 sonra ayrışır. Ters fazlı kromatografi lipid A specie fraksiyonlanması kullanılabilirhidrofobiklikte 41 değişen derecelerde s. Kolon kromatografisi da hafif asit hidrolize ve daha sonra Bligh-Dyer lipid A ekstraksiyon adımları sonra kalıntı SDS'nin uzaklaştırılması yararlıdır. Kalıntı SDS yüksek düzeyde hassas eden ESI-MS protokolleri ile elde spektrumlarında bastırma sinyal katkıda bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma aynı zamanda JSB için R01GM103655 hibe Welch Vakfı Hibe F1155 ve NIH tarafından desteklenen Sağlık (NIH) National Institutes Bağış AI064184 ve AI76322 tarafından ve MST Araştırma Ordu Araştırma Bürosu Grant 61789-MA-MUR tarafından desteklenen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Tags

Chemistry Sayı 79 membran lipidleri Toll benzeri reseptörler endotoksinler glikolipitler Lipopolisakaritler Lipid A Microbiology Lipidler lipid A Bligh-Dyer ince tabaka kromatografisi (TLC) lipopolisakarit kütle spektrometrisi Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID ) Fotodissosiasyon (PD)
Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Henderson, J. C., O'Brien, J. P.,… More

Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter