Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif

Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50623
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

Summary

Isolement et caractérisation des lipides Un domaine de lipopolysaccharide (LPS) des bactéries à Gram négatif donne un aperçu des mécanismes de surface cellulaire sur la base de la résistance aux antibiotiques, la survie des bactéries et de remise en forme, et comment chimiquement lipidique diversifié A espèces moléculaires moduler différemment les réponses immunitaires innées de l'hôte.

Abstract

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface cellulaire des bactéries gram-négatives, déposée sur le feuillet externe de la bicouche de la membrane externe. LPS peuvent être subdivisés en trois domaines: le O-polysaccharide distale, un oligosaccharide de noyau, et le lipide A domaine constitué d'un lipide A des espèces moléculaires et des résidus d'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo). Le lipide A est le seul domaine composant essentiel pour la survie de la cellule bactérienne. Suite à la synthèse, le lipide A est chimiquement modifiée en réponse à des stress environnementaux tels que le pH ou la température, de favoriser la résistance aux composés antibiotiques, et d'échapper à la reconnaissance par les médiateurs de la réponse immunitaire innée hôte. Le protocole suivant détaille l'isolement à petite et grande échelle de lipide A partir de bactéries gram-négatives. Matériau isolé chimiquement est alors caractérisé par chromatographie sur couche mince (TLC) ou la spectrométrie de masse (MS). En plus de laser assistée par matrice de désorption / ionisation à temps de flumière (MALDI-TOF) MS, nous décrivons également les protocoles MS en tandem pour l'analyse des lipides Une espèce moléculaire en utilisant l'ionisation électrospray (ESI) couplée à dissociation induite par collision (CID) et nouvellement employés photodissociation ultraviolet (UVPD) des méthodes. Nos protocoles de MS permettent une détermination sans faille de la structure chimique, primordiale pour la caractérisation de molécules lipidiques A qui contiennent des modifications uniques ou de nouveaux produits chimiques. Nous décrivons également l'étiquetage radio-isotopique, et isolement subséquent, de lipide A partir de cellules bactériennes pour l'analyse par CCM. Par rapport à des protocoles MS, CCM fournit une méthode de caractérisation plus économique et plus rapide, mais ne peut pas être utilisé pour attribuer sans ambiguïté lipide A structures chimiques sans l'utilisation des normes de la structure chimique connue. Au cours des deux dernières décennies isolement et la caractérisation de lipide A a conduit à de nombreuses découvertes passionnantes qui ont amélioré notre compréhension de la physiologie des bactéries, des mécanismes de résistance aux antibiotiques à Gram négatiftance, la réponse immunitaire innée humaine, et ont fourni de nombreuses nouvelles cibles pour le développement de composés antibactériens.

Introduction

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface extérieure de presque tous les organismes gram-négatif et est constituée de trois domaines moléculaires: un antigène O polysaccharidiques distale, un oligosaccharide de noyau et le lipide associé à la membrane Un domaine déposé sur le feuillet externe de la membrane bicouche externe 1,2. Le lipide Un domaine se compose de 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) les résidus et un lipide une espèce moléculaire, où le lipide A peut être définie comme la fraction soluble dans le chloroforme de LPS lors de l'hydrolyse légère acide 1, 2. Le lipide A de la molécule de type peut être défini chimiquement comme une épine dorsale qui est diglucosamine hexa-acylé et le bis-phosphorylé, en accord avec les principales espèces de lipide A observées dans l'organisme modèle Escherichia coli (E. coli) 1,2. Neuf gènes exprimés de manière constitutive, conservés tout au long de bactéries gram-négatives, sont responsables de la production du domaine de lipide A (Figure 1) 1,2. La plupart des bactéries ont un jeu supplémentaire de gènes, qui varient en degré de conservation phylogénétique, qui participent à une autre modification chimique du lipide A 3. La déphosphorylation, l'élimination des chaînes acyle, et l'addition de groupements chimiques, tels que des amino-sucres (par exemple aminoarabinose) et / ou de la phosphoéthanolamine sont les activités les plus fréquemment observés (Figure 1). Beaucoup des enzymes responsables de lipides Une modification sont directement activés par des signaux environnementaux, tels que des cations bivalents ou leur expression est régulée par deux systèmes de réponse-régulateur composants 3.

Reconnaissance d'espèces lipidiques A par le système immunitaire inné hôte est médiée par le récepteur de type Toll-like facteur de différenciation 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-récepteur 4. Forces hydrophobes entre MD2 et le lipide A des chaînes acyle, ainsi qu'entre TLR4 et les 1 et 4 'groupes phosphates de lipide A promouvoir la forte association de la lèvreid avec TLR4/MD2 4,5. Les modifications qui modifient l'état d'acylation ou la charge négative du lipide A à base de lipide A TLR4/MD2 incidence reconnaissance et en aval de la stimulation de la réponse immunitaire innée activateurs de NF-kB et de médiateurs de l'inflammation tels que TNFa et IL1-β 6,7. Modifications qui masquent la charge négative de lipide A éviter également des peptides antimicrobiens cationiques bactéricides de se lier à Gram négatif surfaces cellulaires 3,8. De nombreuses modifications de lipide A sont émis l'hypothèse d'améliorer la condition physique des bactéries dans des conditions environnementales spécifiques, tels que l'intérieur de l'hôte humain ou dans une niche écologique. Pour cette raison, de nombreuses enzymes de modification sont des cibles intéressantes dans le développement rationnel de composés antimicrobiens. La diversité chimique des structures lipidiques A, par rapport à l'organisme et / ou de l'environnement, et les implications biologiques de ces diverses structures rendre la caractérisation structurale de lipide A un effort important dans de til étudier des bactéries gram-négatives.

L'isolement des molécules de lipide A de bactéries entières implique l'extraction de LPS à partir de la surface de la cellule bactérienne, une étape d'hydrolyse pour libérer le lipide A, suivie par une procédure de purification finale 9-11. Le LPS procédure la plus fréquemment citée d'extraction est le chaud phénol procédure d'extraction de l'eau, d'abord introduit par Westphal et Jann 10. Après extraction LPS ensemble est soumis à une hydrolyse douce-acide, qui sépare chimiquement Kdo de la 6'-hydroxy du sucre de glucosamine distale du lipide A (figure 1). De nombreux écueils existent pour la procédure de l'eau chaude-phénol y compris l'utilisation d'un réactif de risque élevé, la nécessité de dégrader les acides co-extraits nucléiques et des protéines, et plusieurs jours sont nécessaires pour compléter le protocole 10.

Notre laboratoire a développé l'extraction et l'isolement du lipide A comme premier développé par Caroff et Raetz 12,13. Par rapport aux procédés de l'eau chaude-phénol, le procédé présenté ici est plus rapide et efficace et s'adapte à une large gamme de volumes de culture de 5 ml à plusieurs litres. En outre, contrairement à l'extraction de l'eau chaude-phénol, notre méthode ne sélectionne pas pour rugueuses ou lisses-types de LPS, en fournissant une récupération optimale des espèces lipidiques A. Dans notre protocole, la lyse chimique des cellules bactériennes entières est effectuée en utilisant un mélange de chloroforme, de méthanol et d'eau, où LPS peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation. Une combinaison d'une hydrolyse douce-acide et extractions par solvant (Bligh-Dyer) sont utilisés pour libérer le lipide A de polysaccharide lié de manière covalente. La méthode de Bligh et Dyer a été appliqué d'abord à l'extraction d'espèces lipidiques à partir d'une variété d'animaux et des végétaux tissus 14, modifié ici pour séparer le polysaccharide hydrolysé de lipide A. Dans cette étape de séparation finale, le chloroforme lipides solubles partitionner de manière sélective dans la phase organique inférieure phase. Pour purifier davantage le lipide A, en phase inverse ouChromatographie sur colonne d'échange anionique peut être utilisé 12.

Après isolement des espèces lipidiques A partir de cellules entières, un certain nombre de méthodes d'analyse peut être utilisée pour caractériser la structure chimique de la matière d'isolement telles que la RMN, chromatographie sur couche mince, et l'analyse MS. RMN permet élucidation de la structure non-destructive, et fournit des détails structurel lié à des liaisons glycosidiques, l'attribution sans équivoque des positions de la chaîne acyle, et cession de sites de fixation pour le lipide A modifications comme aminoarabinose ou phosphoethanolamine 15-17. analyse par RMN du lipide A n'est pas discutée au sein de notre protocole, mais a été correctement décrit ailleurs 15,16. Pour une analyse rapide TLC basées méthodes sont fréquemment utilisées, mais ne parviennent pas à fournir des informations directes sur la structure de la chimie fine. Protocoles MS sont la méthode la plus fréquemment utilisée pour caractériser les structures lipidiques A 18,19. Matrice associée ionisation par désorption laser (MALDI)-MS est souvent utilisé pour sonder initialement espèce de lipide A intactes. Ions à charge sont générés à partir analyte préparée selon nos procédures d'extraction. Comme l'analyse structurale plus fine est nécessaire, des méthodes basées MS / MS s'avèrent plus informatif que MALDI-MS. Couplé à ionisation électrospray (ESI) de lipides seuls ou à plusieurs charges A ions précurseurs sont encore fragmenté par dissociation induite par collision (CID) ou photodissociation ultraviolet (UVPD), pour générer des ions structurellement information sur les produits 18,20,21. Produits de perte de neutre lipide A ions précurseurs sont également fréquemment générés pendant ESI-MS à fournir une couche supplémentaire d'information structurale.

Spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) s'est avérée être une méthode indispensable et polyvalent pour l'élucidation des structures lipidiques A. Au cours de MS / MS, les ions sont activés pour obtenir un schéma de fragmentation de diagnostic qui peut être utilisée pour élucider la structure de l'ion précurseur. Le plus largement available méthode MS / MS est CID. Cette méthode produit des ions fragmentés par collision de l'ion précurseur choisi avec un gaz inerte cible, ce qui entraîne le dépôt d'énergie qui conduit à la dissociation. CID s'est avéré un outil essentiel dans l'attribution des lipides Une structure pour un large éventail d'espèces bactériennes 22-33.

Bien que le procédé est CID MS / MS plus universellement mis en oeuvre, il génère un éventail limité d'ions sur les produits. 193 nm UVPD est une alternative et complémentaire méthode MS / MS. Cette méthode utilise un laser pour irradier des ions, et l'absorption de photons se traduit par excitation des ions et la dissociation subséquente. Cette énergie technique MS / MS plus élevée produit un éventail plus diversifié d'ions produits que CID et fournit des modèles de fragmentation plus informatifs ainsi. En particulier, UVPD donne des informations sur les changements subtils dans les espèces lipidiques A sur la base de clivages au glycosidique, amine, acyle et CC obligations indexées 18,21,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les solutions doivent être préparées avec de l'eau ultra pure et méthanol de qualité HPLC et le chloroforme. Solutions préparées contenant des solvants organiques tels que le méthanol, le chloroforme, ou la pyridine et les acides concentrés ou de bases doivent être préparés et utilisés sous une hotte chimique. Toutes les solutions peuvent être stockées à température ambiante. Les solvants doivent être mesurés dans un cylindre de verre gradué et stockés dans des bouteilles en verre de solvant avec PTFE bordée bouchons. Pour le stockage à long terme des solvants contenant du chloroforme doivent être stockés dans des flacons en verre ambré teinté afin d'éviter la production de phosgène, un chlorure d'acide hautement réactif. Tubes PTFE de centrifugeuses et des flacons de l'évaporateur rotatif doivent être rincés avec du méthanol et du chloroforme avant de l'utiliser. Respecter les règlements fédéraux, provinciaux et / ou d'élimination des déchets institutionnel nécessaires lors de l'élimination des solvants et / ou de déchets radioactifs.

Une. Large Scale lipide A Extraction (50 ml à 1,5 L)

  1. Préparer une Bligh-Dyer mélange monophasé: chlorophosphate sous forme-méthanol-1X (PBS), pH 7,4 en tampon; 1:2:0.8 v / v). Mélanger 200 ml de chloroforme, 400 ml de méthanol et 160 ml de PBS dans une bouteille de solvant L. bouteille de Cap et mélanger par inversion (> 30x). Desserrer le bouchon périodiquement pendant le mélange pour évacuer et stocker fermé.
  2. Préparer deux phases Bligh-Dyer mélange chloroforme pré-équilibrée: méthanol: eau (2:2:1.8 v / v). Combiner 400 ml de chloroforme, 400 ml de méthanol et 180 ml d'eau dans une bouteille de solvant L. Cap bouteille et mélanger par inversion, en veillant à desserrer bouchon périodiquement pendant le mélange se défouler. Laissez équilibrer O / N et magasin fermé.
  3. Préparer le tampon d'hydrolyse acide douce (acétate de sodium 50 mM, pH 4,5 et 1% de dodécylsulfate de sodium (SDS)). Pour 500 ml de tampon d'hydrolyse acide douce, peser 2,05 g d'acétate de sodium et le transférer à un bêcher de 500 ml. Ajouter de l'eau à un volume d'environ 350 ml et mélanger, puis ajouter 50 ml de SDS à 10%. Mélanger et ajuster le pH à 4,5, transférer à une éprouvette graduée, et ajouter de l'eau à 500 ml.
  4. Préparerchloroforme: methanol (4:1, v / v): Mesurer 100 ml de chloroforme et le transférer à la bouteille de solvant. Mesurer 25 ml de methanol et mélanger avec du chloroforme. Stocker dans de l'ambre bouteille en verre.
  5. Inoculer 5 ml de milieu (bouillon Luria ou autres) à partir d'une seule colonie bactérienne. Cultiver O / N à 37 ° C, ou du nécessaire ° C pour la croissance. Un schéma de la procédure d'extraction est représentée sur la figure 2.
  6. Le lendemain, mesurer la DO 600 et utiliser la culture 5 ml O / N pour inoculer 200 ml de culture à un OD à partir de 600 de 0,05. Cultiver les cellules jusqu'à une DO 600 de 0,8-1,0 est atteint.
  7. récolte des cellules par centrifugation à 10 000 xg pendant 10 min. Tourne plus peut être nécessaire pour les souches qui Pellet mal. Verser le surnageant des médias.
  8. Laver culot de cellules avec 50 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS). Répétez centrifugation pour sédimenter les cellules. Verser le surnageant et culot cellulaire de conserver à -20 ° C, ou passez à l'étape 1.9.
  9. Resuspendre les cellules dans 40 mlde PBS 1x et fracture entre deux tubes PTFE 250 ml de centrifugeuses (rendement 20 ml de suspension de cellules / tube). Ajouter 25 ml de chloroforme et 50 ml de methanol à chaque tube, à une seule phase de Bligh-Dyer (chloroforme: méthanol: eau, 1:2:0.8 v / v) (Figure 2). Mélanger par inversion et incuber à température ambiante pendant> 20 minutes pour assurer une lyse complète des cellules.
  10. Centrifuger le mélange à 2000 xg pendant 20 min. LPS se sédimenter en même temps que des protéines et des acides nucléiques (figure 2), cependant, des phospholipides, des lipides, et isoprényles petits peptides hydrophobes resteront dans le surnageant. Jeter le surnageant.
  11. Laver le culot LPS avec un mélange ~ 100 ml monophasé Bligh-Dyer. Centrifuger à 2000 g pendant 20 min. Rejeter le surnageant. Lorsque isoler le lipide A de E. coli ou Salmonella, un seul lavage est nécessaire, mais les étapes de lavage supplémentaires peuvent être nécessaires pour réduire la contamination des phospholipides lors de l'isolation lipide A de certains organismes.
  12. Ajouter 27 ml de kmtampon d'hydrolyse acide de ld (acétate de sodium 50 mM, pH 4,5 et 1% de SDS, voir étape 1.3) de pastille LPS, et mélanger par pipetage de haut en bas jusqu'à ce que de petites particules restent. Soniquer à remettre en suspension homogène LPS culot en solution avec la pointe de la sonde de traitement ultrasonique à un cycle de service constant pendant 20 secondes à la sortie de 50%. Répétez sonication de 2x de l'échantillon (20 sec / éclater, ~ 5 sec entre les salves).
  13. Échantillons Faire bouillir dans un bain d'eau pendant 30 min. Attention: assurez-vous que les bouchons sont serrés, mais pas totalement étanche. Certains organismes, comme Vibrio cholerae (V. cholerae) nécessitent de plus longues durées d'incubation (1 h) pour augmenter le rendement global du lipide A. Retirez les bouteilles du bain d'eau et laisser l'échantillon refroidir à température ambiante avant de procéder.
  14. Pour extraire les lipides après hydrolyse, la solution de SDS à convertir en une à deux phases Bligh-Dyer (figure 2) le mélange par addition de 30 ml de chloroforme et 30 ml de methanol, par un mélange chloroforme: méthanol: eau (2:2:1.8, v / v). Mélanger par inversion et centrifuger l'échantillon pendant 10 min à 2,000 x g. Extraire la phase inférieure dans un tube de centrifugeuse en PTFE propre à l'aide d'une pipette en verre.
  15. Effectuer une seconde extraction en ajoutant 30 ml de phase inférieure d'un mélange de Bligh-Dyer pré-équilibré à deux phases (étape 1.2), de la phase supérieure de l'étape 1.14. Mix, puis centrifuger à 2000 g pendant 10 min. Extraire la phase inférieure, et en commun avec la phase inférieure extrait à l'étape 1.14.
  16. Laver les phases inférieures communs (60 ml au total) en ajoutant 114 ml de pré-équilibrée à deux phases Bligh-Dyer phase supérieure (étape 1.2) pour créer un mélange à deux phases Bligh-Dyer (chloroforme: méthanol: eau; 02h02: 1,8, v / v). Mélanger. Centrifuger à 2000 g pendant 10 min.
  17. Retirer la phase inférieure à un ballon d'évaporateur rotatif en verre propre et sèche l'échantillon en employant une evaporation rotative (figure 2).
  18. Ajouter 5 ml de chloroforme: méthanol (4:1, v / v) dans le ballon rotatif, et un bain de sonication-(> 30 sec) pour aider à la suspension de lipides à partir des côtés du ballon. Utiliser une pipette de transfert en verre pour transférer des lipides à un nettoyagetube de verre (13 x 100 mm ou plus) coiffé d'PTFE phénoliques capsules à vis. Extrait sec sous un courant d'azote en utilisant un sécheur d'azote.
  19. Remettre en suspension les lipides séchés dans 1 ml de chloroforme: methanol (4:1, v / v). Transfert à petite fiole à échantillons en verre (12 x 32 mm) avec une base conique pour la remise en suspension plus quantitative à l'aide de petits volumes (voir le tableau de l'équipement / Réactifs). Séchez à l'aide d'un sèche-azote.
  20. Échantillon séché peut être conservé à -20 ° C jusqu'à ce qu'une CCM ultérieure (Protocole 2) ou MS analyse (protocole n ° 3, 4, ou 5). (Remarque: Montant de matériel isolé et utilisé dans des protocoles ultérieurs est suggéré basé sur ce qui est suffisant pour la plupart des organismes du même échantillon de lipides peut être utilisé dans les protocoles 2-5, prenant note de matériel% enlevé Voir discussion pour plus de détails...).

2. Visualisation des lipides Une espèce par chromatographie sur couche mince

  1. Préparer le système de solvant de phase mobile TLC (chloroforme: pyridine: acide formique à 88%: de l'eau; 50:50:16:5 v / v). Combine 200 ml de chloroforme, 200 ml de pyridine, 64 ml d'acide formique à 88%, et 20 ml d'eau dans une bouteille de 1 litre de solvant. Cap bouteille, mélanger par inversion à plusieurs reprises, et de ventilation.
  2. Utilisez un réservoir TLC qui pourra accueillir 20 x 20 cm plaques. Ligne réservoir CCM avec ~ papier de chromatographie de 40 cm.
  3. Pour réservoir TLC ajouter 200 ml de chloroforme: pyridine: 88% d'acide formique: eau (50:50:16:5, v / v). Laissez le réservoir de pré-s'équilibrer pendant> 3 heures, souvent O / N est préférable et plus pratique.
  4. Retirer les échantillons lipidiques secs du congélateur (étape 1.20) et laisser tiédir à température ambiante.
  5. Avec un rasoir retirer la silice à partir du bord supérieur d'une plaque de gel de silice 60 TLC. En utilisant un crayon terne, tracer une ligne parallèle au fond de la plaque, 2 cm du fond. Cette ligne est à l'origine pour repérer les échantillons. Mark incrémente le long de cette ligne de référence pour repérer des échantillons de 1 cm.
  6. Dissoudre lipide séché de l'étape 2.4 dans 200 ul de chloroforme: methanol (4:1, v / v), vortex et sonication (3 x, ~ 15 s chacun), les rendements ~ 100 -500 ng / ul lipide A si extrait de E. coli.
  7. En utilisant une pipette de verre de micro-capillaire, repérer un dixième du volume (20 ul) sur la plaque de chromatographie sur couche mince comme indiqué dans l'étape 2.5. Laisser les échantillons à l'air sec sur plaque de CCM pour ~ 15 min. (Note: les échantillons dans des flacons en verre petit peuvent être séchées en utilisant un sécheur d'azote et conservés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure dans des protocoles 5.3 Notez% de matière enlevée.).
  8. Placer la plaque CCM contenant des échantillons repérés dans le réservoir pré-équilibrée. Une fois devant solvant atteint le sommet de la plaque de CCM (~ 2,5-3 h), enlever la plaque et l'air sec (> 60 min). Un pistolet d'air froid peut être utilisé pour assurer siccité complète.
  9. Tandis que la plaque sèche, tourner sur la plaque chaude à 250 ° C pour la carbonisation.
  10. Dans une hotte chimique ventilé, préparer le mélange d'acide sulfurique et d'éthanol à 10% pour la carbonisation des lipides résolus sur la plaque de chromatographie sur couche mince de silice (acide sulfurique concentré: 100% d'éthanol, 01:09 v / v). Mesurer 10 ml d'acide sulfurique et on ajoute lentement à 90 ml d'éthanol à 100%. Soinsentièrement mélanger et transférer à un réactif atomiseur de chromatographie en verre.
  11. Dans la hotte, utiliser un verre chromatographique réactif atomiseur pour pulvériser la plaque de CCM séché avec un mélange d'acide sulfurique et d'éthanol 10%. Vaporisez le mélange uniformément sur la plaque.
  12. Placer la plaque CCM sur la plaque chauffante à 250 ° C jusqu'à ce que des échantillons de lipides carbonisés apparaissent comme des taches noires / brunes (<1 min). N'exposez pas la plaque, car cela provoquerait la totalité de la plaque à brunir et rendre la visualisation des espèces lipidiques A difficile.

3. La caractérisation structurale du lipide A par l'intermédiaire de MALDI-TOF Mass Spectrometry

  1. De l'étape 1.20, (ou étape 2.7) enlever lipides Un échantillon du congélateur et laisser réchauffer à température ambiante. Remettre en suspension les lipides séchés dans un échantillon de ~ 20 ul de chloroforme: methanol (4:1, v / v) et pour obtenir un vortex ~ 5.1 ug / ul de solution de lipide A si extrait de E. coli. (Remarque: 10% moins concentré si le matériel utilisé à partir de l'étape 2.7).
  2. Préparer ATT composants de la matrice. Saturés 6-aza-2-thiothymine à 50% d'acétonitrile: ajouter 500 ul d'eau et 500 pi d'acétonitrile dans un tube de 1,5 ml, puis ajouter> 10 mg 6-aza-2-thiothymine de sorte que le 50% d'acétonitrile est super-saturée. Tribasique une solution saturée de citrate d'ammonium: Ajouter> 1 mg à 500 pi d'eau, précipiter devrait être évident. solutions Vortex et centrifugeuses avant utilisation; ne surnageant saturé est utilisé.
  3. Préparer le mélange de matrice ATT: saturée 6-aza-2-thiothymine à 50% d'acétonitrile, saturé citrate d'ammonium tribasique (20:01, v / v). Mélanger ensemble des composants de matrice en ajoutant 20 ul d'une solution à 1 ul ATT saturés tribasique solution de citrate d'ammonium dans 500 ul de centrifugation de tubes, vortex pour mélanger et centrifuger avant l'application à la plaque MALDI.
  4. Préparer la plaque MALDI en ajoutant mélange d'étalonnage de 0,5 pi à la plaque MALDI sur une place près du lieu où les échantillons seront déposés, pour fournir la plus précise masse / charge rapport détermination l'.
  5. Déposer 0,5 piATT de matrice sur la plaque MALDI sur chaque endroit où lipidique Un échantillon sera déposé.
  6. Caution 0,5 pi de l'échantillon (2,5% de l'échantillon total) sur la place de la matrice ATT, à mélanger sur la plaque, et d'acquérir des spectres par échantillon de balayage des signaux d'ions optimales (Figure 3). Note: Les montants pour le signal le plus optimal MS peuvent varier en fonction de l'organisme et doivent être déterminées empiriquement. Pour ajouter plus de matière, on peut repérer 0,5 pi à plusieurs reprises permettant mélange repéré sécher entre outre de plus l'échantillon. L'échantillon peut également être concentré (sec et remettre en suspension dans un volume plus petit) ou dilué si nécessaire. Plus la matière de départ (en volume de culture cellulaire de départ) peut également être utilisé (voir la discussion).

4. Spectrométrie de masse électrospray et dissociation induite par collision de lipide A

  1. Préparer un mélange chloroforme: méthanol mélange de solvants (01:01, v / v) en mélangeant 200 pi actions de méthanol de qualité HPLC avec 200 ml de chloroforme HPLC grade dans un sol de verreventilation bouteille.
  2. Transférer 200 ul de chloroforme: méthanol mélange solvant dans le flacon avec le lipide A (par exemple de l'étape 1.20, 2.7, ou séché après Protocol 3) et le lipide soniquer une solution pendant 5 min ou jusqu'à ce que tout le matériel est dissous.
  3. Préparer le spectromètre de masse en mode électrospray négatif ionisation.
  4. En utilisant une seringue de 250 pl et une pompe à seringue, injecter directement le lipide Un échantillon dilué à un débit de 2,0 à 3,5 pl / min.
  5. Optimiser et d'améliorer le lipide A signal d'ions en réglant l'optique ionique. Un spectre de masse complet peut alors être recueilli de l'espèce de lipide A (figure 4).
  6. Isoler et activer la cible lipide A en sélectionnant CID que la méthode MS / MS.
  7. Augmenter la tension de la DRC (ou énergie de collision normalisée, NCE) jusqu'à ce que le lipide A de précurseur espèces est d'environ 10% d'abondance relative par rapport à l'ion de produit plus élevée.
  8. Acquérir et spectres moyenne jusqu'à ce que suffisamment de signal-bruit est obtenue pour eions produits e. Le nombre de balayages nécessaires dépend de l'intensité du signal du précurseur initial et peut aller de 3 à 300 scans (Figure 5A).

5. MS / MS sur le lipide A par ultraviolet Photodissociation

  1. Préparer l'échantillon et le spectromètre de masse comme dans les étapes 4.1 à 4.5.
  2. Allumer le laser est relié au spectromètre de masse. Le spectromètre de masse a été équipé d'un laser à excimère de 193 nm et modifié pour permettre l'activation des UV dans la cellule de HCD de l'instrument. Photodissociation a été mis en œuvre d'une manière similaire à celle décrite précédemment 35. Nous utilisons une rampe à vide modifiée avec une fenêtre optique de CaF 2 pour transmettre des photons en énergie la plus élevée C-piège dissociation (HCD) cellule. Le laser est déclenché pendant MS / MS par une logique transistor-transistor (TTL) signal du spectromètre de masse à un générateur d'impulsions / de retard.
  3. Mettre en place le logiciel de l'appareil de sorte que le laser va déclencher le laser excimer lorsque leles ions entrent dans la cellule de HCD. Cela nécessite une modification modeste du logiciel.
  4. Mettre en marche le générateur d'impulsions de telle sorte que le laser est pulsé toutes les 2 ms (500 Hz).
  5. Isoler le lipide A ion précurseur en sélectionnant HCD comme méthode MS / MS et ajuster l'énergie de collision de 1% des RCE. Cela permet l'isolement des ions précurseurs pour la dissociation ultraviolet à l'intérieur de la cellule HCD. Bien que la cellule HCD est utilisé, le logiciel est modifié pour effectuer UVPD pendant cet intervalle.
  6. Activer le lipide A ion isolé en augmentant l'énergie du laser et en ajustant le nombre d'impulsions laser. Une expérience de UVPD typique sera effectuée en utilisant dix 6 ml impulsions.
  7. Comme à l'étape 4.8, et acquérir des spectres moyenne jusqu'à ce que le bruit de signal-à-suffisante est obtenue pour les ions produits de UVPD. Le nombre de balayages nécessaires dépend de l'intensité du signal du précurseur initial et peut aller de 3 à 300 scans (Figure 5B).

6. 32 P-étiquetagede lipide A et isolement subséquent

  1. Inoculer 5 ml de milieu (bouillon de Luria ou autre support) à partir d'une seule colonie. Cultiver O / N à 37 ° C ou à la température requise.
  2. Le lendemain, mesurer la DO 600 et utiliser la culture O / N pour inoculer 7 ml de culture à un OD à partir de 600 ~ 0,05, cultivées dans un tube de culture en verre jetable de 20 x 150 mm. Ajouter 2,5 pCi / ml de 32 inorganique P. Cultiver les cellules jusqu'à une DO 600 de 0,8-1,0 est atteint. S'il vous plaît suivez fédéral, état, et / ou les directives institutionnelles pour la manipulation correcte et sans danger des matières radioactives.
  3. Récupération des cellules en 16 x 125 mm tubes à centrifuger en verre avec bouchon en PTFE aide d'une centrifugeuse clinique d'angle fixe à 1500 g pendant 10 min. Retirer le surnageant dans un récipient approprié des déchets radioactifs. Tous les déchets radioactifs (par exemple, liquide, verre, biohazard) généré dans les étapes suivantes doivent être éliminés conformément aux règlements fédéraux, provinciaux et / ou gui institutionneldelines.
  4. Laver culot de cellules avec 5 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS). Centrifuger pendant 10 min à 1500 x g. Rejeter le surnageant.
  5. Resuspendre les cellules dans 5 ml d'une seule phase de Bligh-Dyer mélange (figure 2) constitué par le chloroforme: méthanol: eau (1:2:0.8, v / v). Vortex pour mélanger et incuber à température ambiante pendant> 20 minutes pour assurer une lyse complète des cellules.
  6. Centrifugeuse centrifugeuse clinique à 1500 g pendant 20 min. Verser doucement le surnageant, qui contient des phospholipides et lipides isoprényles.
  7. Reprendre le culot dans 1,8 ml de LPS de l'acétate de sodium 50 mM, pH 4,5; tampon SDS 1% au vortex. Soniquer échantillon en utilisant un bain sonique jusqu'à culot est répartie de façon égale (~ 30 sec).
  8. Incuber l'échantillon pendant 30 minutes dans un bain d'eau bouillante. Assurez-vous que les chapeaux sont serré, mais pas étanche.
  9. Supprimer de bain d'eau et laissez refroidir l'échantillon à température ambiante pendant 5-10 min.
  10. Autre solution dans l'un de Bligh-Dyer mélange à deux phases par addition de 2 ml de chloroforme et 2 ml d'methanol, ce qui donne un mélange chloroforme: methanol: mélange aqueux (2:2:1.8 v / v). Vortex à mélanger et centrifuger pendant 10 min dans la centrifugeuse clinique à 1500 xg à phases séparées.
  11. Extraire la phase inférieure dans un tube à centrifuger en verre propre en utilisant une pipette en verre (première extraction).
  12. Effectuer une seconde extraction sur l'échantillon en ajoutant 2 ml de la pré-équilibré à deux phases Bligh-Dyer phase inférieure (préparée comme dans l'étape 1.2) de la phase supérieure restante de l'étape 11. Vortex et centrifuger 10 min. Retirer phase inférieure et se combiner avec la phase inférieure de la première extraction.
  13. Pour la phase inférieure commun (~ 4 ml de volume total), ajouter 7,6 ml de pré-équilibrée phase supérieure (étape 1.2), ce qui donne une solution à deux phases Bligh-Dyer (chloroforme: méthanol: eau; 2:2:1.8, v / v). Vortex et centrifuger pendant 10 min.
  14. Retirez la phase inférieure dans un tube de verre propre et sécher avec un sèche-azote. Les échantillons séchés peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

7. Visuation de 32 P marqué lipide A espèces par chromatographie sur couche mince

  1. Préparer marqué au 32P lipide A échantillon, TLC réservoir, et des plaques de CCM comme décrit dans les étapes 2.1 à 2.8.
  2. Dissoudre 32 échantillon de P-marqué dans 500 ul de chloroforme-méthanol 04:01 (v / v). Vortex et bain de traitement par ultrasons pour dissoudre complètement la matière lipidique. Ajouter 5 ul d'échantillon de flacon à scintillation contenant 5 ml de cocktail de scintillation. Compter dans un compteur à scintillation et calculer totale coups / min de l'échantillon.
  3. Lorsque la visualisation des espèces lipidiques radiomarqués, 10 x 20 cm ou 20 cm x 20 plaques de TLC peuvent être utilisés. Pour les plaques 10x20 cm, les échantillons doivent être repérés le long de l'origine marquée dans l'étape 2.5 de sorte que la plus grande dimension de la plaque est verticale (c.-à-échantillons repérés à l'origine marqués 2 cm au-dessus du bord de 10 cm).
  4. En utilisant une pipette de micro-capillaire, repérer 10.000-20.000 cpm / échantillon sur la plaque et laisser sécher les gouttes (> 15 min). Les échantillons peuvent avoir besoin d'être concentré par séchage sousazote et remises en suspension dans un volume approprié, pour atteindre 10.000-20.000 coups / min / place (2 pi ou 2 pi à la fois pour <10 pi total).
  5. Placer la plaque CCM contenant des échantillons radiomarqués dans le réservoir pré-équilibrée. Une fois devant solvant atteint le sommet de la plaque de CCM (~ 3 h), enlever la plaque et l'air sec (> 60 min). Attention: plaques de CCM exécuter en présence de pyridine doivent être soigneusement séchés dans une hotte chimique, comme des traces de pyridine peuvent abimer les écrans phosphorimaging. Un pistolet d'air froid peut être utilisé pour assurer siccité complète.
  6. Enveloppez la plaque dans une pellicule plastique et exposer à l'écran Phosphorlmager dans une autoradiographie cassettes O / N. Le lendemain matin, balayer l'écran pour obtenir l'image (Figure 6). En utilisant un logiciel d'analyse d'image de densitométrie, cette méthode permet une exacte, la quantification relative des espèces lipidiques A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Canonical lipide A de E. coli et Salmonella enterica sérotype Typhimurium est un disaccharide hexa-acylés de la glucosamine avec des groupes de phosphate à 1 - et 4 'positions. Au cours de la croissance dans des milieux riches (par exemple Luria Broth) une partie du lipide A contient un groupe pyrophosphate en position 1 qui donne une espèce de tris-phosphorylée 36 (figure 1). Kdo (3-désoxy-D-manno-octulosonique acide), est fixé à la 6'-hydroxy et sert de pont pour relier le lipide A aux autres domaines d'hydrates de carbone (c.-à-noyau d'oligosaccharides et domaines O-antigène) de LPS. Bien que les bactéries gram-négatives part une voie conservée pour la biosynthèse du lipide A similaire à celui de E. coli K-12, il existe une grande quantité de la diversité dans les structures lipidiques A. Cette diversité résulte de l'action des enzymes latentes qui modifient la structure de lipide A, qui sont activés en réponse à des stimuli environnementaux. Pour example, au S. enterica les groupements phosphate de lipide A peuvent être modifiées avec le sucre cationique L-4-aminoarabinose (Figure 1; bleu) ou avec un résidu de la phosphoéthanolamine (figure 1; magenta). En Salmonella ces modifications sont régis par des systèmes de régulation réponse à deux composants, a ajouté en réponse à faible [Mg 2 +], pH doux-acide, et la présence de peptides antimicrobiens cationiques. De plus en Salmonella, le palmitate peut être ajouté pour former un hepta-acylés lipide A, ce qui favorise la résistance aux peptides antimicrobiens cationiques (figure 1; vert) 8. D'autres modifications comprennent, mais ne sont pas limités à, l'élimination des groupes phosphate et des chaînes d'acyle, ou dioxygénase catalysée par addition d'un groupe hydroxyle de la chaîne acyle secondaire 3'-lié observé dans un certain nombre d'organismes 1,3.

Isolement de lipide A intact à partir de cellules entières par notre modification de la méthode de Caroff et Raetz est décrit dans le protocole 1 (figure 2). Cette méthode d'isolement a été utilisé pour estimer que 10 6 molécules de lipide A par cellule bactérienne existent de E. coli 37. Protocoles suivants 1 et 3, l'ion négatif MALDI-TOF spectre de masse du lipide A de E. coli K-12 (W3110), on obtient l'ion individuellement déprotoné ([MH] -) à m / z 1,796.20 comme les espèces majorly observés (Figure 3). MALDI-TOF MS a été réalisée en mode négatif-réflectron pour améliorer la résolution spectrale. En variante, le même échantillon de lipide soumis à mode négatif nano-ESI (protocole n ° 4), on obtient essentiellement des ions doublement déprotonés lipide A à m / z 898,1 notée [M-2H] 2 - (figure 4). Ions lipide A Singly déprotonés [MH] - à m / z 1,796.20 sont observables, mais sont de l'abondance relative inférieure à [M-2H] 2 - ions (Figure 4). Espèces à charges multiples princiNate lors de l'utilisation ESI. La fragmentation par CID (figure 5A) ou à 193 nm UVPD (Figure 5B) a été effectuée sur le [MH] - lipide A ion m / z 1,796.20. Ces techniques peuvent être utilisés pour mieux affecter les structures chimiques, en particulier des espèces de lipide A contenant des combinaisons complexes de modifications ou modifications chimiques non définies auparavant. des profils de fragmentation sont indiqués en pointillés représentant les sites de clivage et sont mis en correspondance avec les valeurs m / z en dessous de chaque structure fournie (figure 5). Les valeurs m / z et sites de clivage mis en évidence en rouge représentent les ions uniques de produits associés à UVPD.

Comme décrit dans les protocoles 6 et 7, 32 lipide marqué au P A isolée à partir de deux différentes E. coli K-12 souches ont été analysées par CCM (Figure 6). W3110 contient principalement des bis-et tris-phosphorylée lipide A (figure 6;voie de gauche), tandis qu'un motif TLC plus complexe est observée avec 32 P-lipide A isolée à partir de E. souche de E. coli WD101 (figure 6; la voie de droite) 38. WD101 produit lipide A fortement modifiée avec aminoarabinose (L-Ara4N) et phosphoéthanolamine (PETN). Puisque les deux 1 - et 4 '- les phosphates sont disponibles pour la modification, le lipide A de WD101 peut être décrit comme des liaisons simples modifié, contenant un seul L-Ara4N PETN ou au phosphate ou l'autre, ou doublement modifié où les deux phosphates sont modifiés d'une manière combinatoire. En plus de la modification de la 1 - et 4 '- les phosphates, l'addition de palmitate est également observée (voir la figure 1) et augmente la valeur Rf des espèces lipidiques A dans ce système de solvant (figure 6). Si on le désire, l'analyse de la densitométrie en utilisant un phosphorimager, peut être utilisé pour quantifiable quantités relatives d'estimation d'espèces lipidiques A l'intérieur du même échantillon.


Figure 1. Lipides représentant A structures de domaine de E. coli K-12 et S. enterica sérotype Typhimurium. Les modifications apportées à la structure de lipide A conservé sont présentés (à droite), comme décrit dans Les résultats représentatifs. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Schéma de lipide A l'isolement procédure. Plan dépeint lyse chimique de culot cellulaire bactérienne en utilisant une seule phase Bligh-Dyer mélange, centrifugation de lysat pour sédimenter LPS, doux-un cid hydrolyse pour libérer le lipide A de polysaccharide fixé, et la purification finale de lipide A l'aide de deux phases d'extraction Bligh-Dyer. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. Analyse de lipide A isolée à partir de E. MALDI-MS coli K-12 (W3110). spectres obtenus à partir de la moyenne de> 300 coups. Monochargé [MH] - lipide A est observée sous forme d'ion moléculaire à m / z 1,796.2, ce qui correspond à une espèce déprotonés de la structure illustrée à la droite.

0623/50623fig4.jpg "/>
Figure 4. Analyse de lipide A isolée à partir de E. ESI-MS coli K-12 (W3110) Singly [MH] et doublement chargée [M-2H] 2 -. espèces lipidiques A sont observés comme des ions moléculaires de m / z 1,796.2 et m / z 898,1, respectivement.

Figure 5
Figure 5. Analyse de lipide A isolée à partir de E. MS / MS coli K-12 (W3110). dissociation induite par collision (A) ou photodissociation ultraviolette (B) ont été utilisés pour fragmenter le précurseur ion m / z 1,796.2. Ions UVPD de produits spécifiques sont indiquées en rouge. Une carte de fragmentation est fourni (C), où le noir lignes pointillées indiquent la fragmentation associée à la fois CID et UVPD et rouge pointillés indiquent UVPD spéfragmentation de spécifique. Les valeurs figurant sous la carte de fragmentation correspondent aux masses exactes de [MH] -. Ions produits Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 6
Figure 6. Séparation à base de TLC espèce lipidique A isolée à partir de E. coli K-12 marqué au 32P lipide A a été isolé à partir de W3110 (file de gauche) ou WD101 (file de droite) et séparé dans un système de solvant de la cuve contenant le chloroforme TLC:. pyridine: 88% d'acide formique: eau (50:50:16 : 5 v / v).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans ce protocole, nous avons détaillé l'isolement des lipides Une espèce de cellules entières de bactéries, et décrit les méthodes d'analyse TLC ou MS pour caractériser chimiquement ce matériel isolé. Spectrométrie de masse tandem est une stratégie puissante pour de novo caractérisation structurale des composés biologiques, et est inestimable pour la caractérisation chimique de la panoplie de molécules lipidiques A observés dans la nature. CID et UVPD existe deux méthodes d'activation complémentaires qui créent différents types d'ions produits qui fournissent des empreintes digitales clés pour lipidiques molécules A. Fragmentation MS / MS en utilisant à la fois CID et UVPD permet élucidation des différences subtiles de structures lipidiques A, en fournissant des détails plus fins pour les missions de la structure chimique. Les données de ce type sont nécessaires pour établir des relations précises structure de corrélation / fonction dans la biologie du lipide A des espèces moléculaires. Nous avons également décrit la procédure pour 32 espèces lipidiques A P-radiomarquage en scultures bactériennes centre-échelle, où le modèle chimique de 32 espèces de P-lipidique peut être visualisé par CCM et autoradiographie.

Il ya un certain nombre de caractéristiques de ce protocole que tout utilisateur doit être conscient de. Pour des préparations à grande échelle du lipide A (protocole 1), la proportion de solvant à partir de quantité de culot bactérien peut être optimisée afin d'améliorer le rendement global. Toutefois, cette proportion ne peut être déterminée de manière empirique. Les montants visés dans le présent protocole représentent un bon point de départ pour la plupart des souches bactériennes. volumes de culture pour le lipide A l'extraction et l'isolement peuvent également être ajustés en fonction de la souche bactérienne que vous travaillez avec. Par exemple, V. cholerae nécessite au moins 200 ml de culture en vue d'obtenir des spectres de masse de haute qualité, mais le volume de culture pour E. coli peut être réduite à 5 ml. Plus matériau de départ (grands volumes de culture) est nécessaire pour certaines espèces bactériennes parce que les hydrolysest l'étape qui libère le lipide A de l'ensemble LPS est moins efficace. Par exemple organismes contenant une dioxygénase Kdo fonctionnelle ou Kdo kinase exposition diminué lipides rendements A après hydrolyse douce-acide 39. Souvent, les mutants avec LPS / lipide structures A altérés ou une espèce bactérienne particuliers sont souvent difficiles à sédimenter pendant la récolte des cellules. Pour ces souches, la durée de la centrifugation peut être étendue pour augmenter le rendement. A noter également, après la lyse des cellules dans un mélange et LPS Bligh-Dyer monophasé est granulé (voir l'étape 1.9), les étapes de lavage supplémentaires peuvent être nécessaires pour réduire la contamination des phospholipides. Lorsque isoler le lipide A de E. coli ou Salmonella, un seul lavage est nécessaire. Cependant, si l'isolement du lipide A provenant d'autres organismes (par exemple, V. cholerae ou Helicobacter pylori), des étapes de lavage supplémentaires sont nécessaires.

Après hydrolyse acide douce dans du SDS, le rendement en essences lipide A d 'hydrophobicité réduite (c'est à dire plus de phogroupes sphate> 2 ou moins des chaînes acyles <5) peuvent être améliorées en utilisant une extraction de Bligh-Dyer acide. Pour les volumes utilisés dans l'article protocole n ° 1, ajouter 225 ul de HCl concentré à la solution de SDS contenant hydrolysé lipide A suivi par 30 ml de chloroforme et 30 ml de methanol pendant une Bligh-Dyer mélange à deux phases de chloroforme: methanol: HCl 0,1 M (2:2:1.8, v / v). Pour les volumes utilisés dans la section Protocole 6 ajouter 15 ul de HCl concentré à la solution contenant du SDS hydrolysé lipide A suivi de 2 ml de chloroforme et 2 ml de methanol, ce qui donne un mélange chloroforme: methanol: HCl 0,1 M (2:2:1.8, v / v). Après une extraction acide Bligh-Dyer, la pyridine peut être ajoutée aux phases inférieures regroupées pour neutraliser l'acide (1 goutte de pyridine / 2 ml de volume de l'échantillon final). Cette étape supplémentaire doit être effectuée avant le séchage de l'échantillon, dans une hotte d'aspiration chimique. Veillez à ne pas utiliser un excès de pyridine, ce qui peut conduire à l'élimination des acides gras à liaison ester. En outre, si la samp lipidiquele est difficile à sécher sous atmosphère d'azote, ajouter quelques millilitres de chloroforme: methanol (4:1, v / v) dans le ballon et continuer à sécher l'échantillon à la fin.

L'hétérogénéité chimique complexe d'espèces A lipidiques observées dans certains organismes (par exemple V. cholerae, Yersinia pseudotuberculosis) peut parfois faire l'analyse MS CCM ou difficile. Une Chromatographie sur colonne peut être utilisée en amont de ces techniques d'analyse pour effectuer une pré-fractionner espèce de lipide A isolés dans des mélanges plus simples. échange d'anions avec diéthylaminoéthyle (DEAE)-cellulose est le plus couramment utilisé 40. En règle générale lipide A modifié à chaque position de phosphate, avec des groupes non-acides tels que aminoarabinose ou phosphoethanolamine, élue avant que les espèces non modifiées lipide A 40. De même tris-phosphorylée lipide A élue bien après les espèces non modifiées bisphosphorylated 36,40. Chromatographie en phase inverse peut être utilisée pour fractionner le lipide A species de divers degrés de l'hydrophobie 41. La Chromatographie sur colonne est également utile dans l'élimination de SDS résiduel après hydrolyse acide douce et ultérieur Bligh-Dyer lipide A des étapes d'extraction. Des niveaux élevés de SDS résiduels peuvent contribuer à signaler la suppression dans les spectres obtenus par nos protocoles ESI-MS sensibles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par des subventions AI064184 et AI76322 des National Institutes of Health (NIH) et par Grant 61789-MA-MUR de l'Army Research Office de MST de recherche a également été soutenue par Welch Foundation Grant F1155 et NIH accorder R01GM103655 à ACC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Tags

Chimie Numéro 79 lipides membranaires Toll-Like Receptors endotoxines glycolipides Lipopolysaccharides le lipide A microbiologie lipides le lipide A Bligh-Dyer chromatographie sur couche mince (CCM) lipopolysaccharide la spectrométrie de masse dissociation induite par collision (CID ) Photodissociation (PD)
Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Henderson, J. C., O'Brien, J. P.,… More

Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter