Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Isolering och kemisk karakterisering av lipid A från gramnegativa bakterier

Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50623
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

Summary

Isolering och karakterisering av lipid A-domänen av lipopolysackarid (LPS) från gramnegativa bakterier ger en inblick i cellytan baserade mekanismer för antibiotikaresistens, bakteriell överlevnad och fitness, och hur kemiskt varierande lipid A molekylslag modulera differentiellt värd medfödda immunsvar.

Abstract

Lipopolysackarid (LPS) är den huvudsakliga cellytemolekyl av gramnegativa bakterier som är anbragta på den yttre bipacksedel av yttermembrandubbelskiktet. LPS kan delas in i tre områden: det distala O-polysackarid, en kärna oligosackarid och lipid A-domänen bestående av en lipid A-molekylslag och 3-deoxi-D-manno-okt-2-ulosonic syrarester (KDO). Den lipid En domän är den enda som är väsentligt för bakteriell cellöverlevnad. Efter dess syntes, är lipid A kemiskt modifierad som svar på miljöstress, såsom pH eller temperatur, till ökad resistens till antibiotiska föreningar, och för att undgå igenkänning av mediatorer av värdens naturliga immunsvar. Följande protokoll specificerar små och storskalig isolering av lipid A från gramnegativa bakterier. Isolerade materialet sedan kemiskt karaktäriseras av tunnskiktskromatografi (TLC) eller masspektrometri (MS). Förutom matris-assisterad laser desorption / jonisering-tid av fljus (MALDI-TOF) MS beskriver vi även tandem MS-protokoll för att analysera lipid A molekylslag med hjälp av elektro (ESI) kopplat till kollision inducerad dissociation (CID) och nyanställd ultraviolett photodissociation (UVPD) metoder. Vår MS-protokoll tillåter entydig bestämning av kemisk struktur, avgörande för karakterisering av lipid A-molekyler som innehåller unika eller nya kemiska modifieringar. Vi beskriver också den radioisotopmärkning, och efterföljande isolering, av lipid A från bakterieceller för analys med TLC. I förhållande till MS-baserade protokoll, ger TLC en mer ekonomisk och snabb karaktärisering metod, men kan inte användas för att entydigt tilldela lipid A kemiska strukturer utan användning av standarder med känd kemisk struktur. Under de senaste två decennierna isolering och karakterisering av lipid A har lett till många spännande upptäckter som har förbättrat vår förståelse av fysiologi av gramnegativa bakterier, mekanismer för antibiotika motstånddelse, den humana medfödda immunsvar, och har gett många nya mål för utvecklingen av antibakteriella föreningar.

Introduction

Lipopolysackarid (LPS) är den huvudsakliga yttre ytan molekyl av nästan alla gramnegativa organismer och består av tre molekylära domäner: en bortre O-antigen polysackarid, en kärna oligosackarid, och membranassocierade lipid A-domänen avsatt på den yttre bipacksedel för yttre membrandubbelskikt 1,2. Den lipid En domän består av 3-deoxi-D-manno-okt-2-ulosonic (KDO) rester och en lipid en molekyl, där lipid A kan definieras som den kloroform lösliga delen av LPS vid mild-sur hydrolys 1, 2. Standarden lipid A-molekylen kan kemiskt definieras som en diglucosamine ryggrad som är hexa-acylerade och bis-fosforylerade; konsekvent med de stora lipid A arterna observerade i modellorganismen Escherichia coli (E. coli) 1,2. Nio konstitutivt uttryckta gener, konserverade hela gramnegativa bakterier, är ansvariga för produktionen av lipid A domän (Figur 1) 1,2. De flesta bakterier som har en ytterligare uppsättning av gener, som varierar i grad av fylogenetisk konservering, att delta i ytterligare kemisk modifiering av lipid A-3. Defosforylering, borttagning av acylkedjor, och tillsats av kemiska delar såsom aminosocker (t.ex. aminoarabinose) och / eller fosfoetanolamin är de vanligast observerade aktiviteter (Figur 1). Många av de enzymer som ansvarar för lipid A modifiering påverkas direkt av miljösignaler, såsom divalenta katjoner, eller deras uttryck regleras av två komponent respons-regulatorsystem 3.

Erkännande av lipid A arter av värd medfödda immunsystemet förmedlas av Toll-like receptor 4/myeloid differentieringsfaktor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofoba krafter mellan MD2 och lipid A acylkedjorna, liksom mellan TLR4 och 1 och 4 'fosfatgrupper av lipid A främja stark sammanslutning av läppid A med TLR4/MD2 4,5. Ändringar som förändrar acyle stat eller den negativa laddningen av lipid A inverkan TLR4/MD2 baserad lipid Ett erkännande och nedströms stimulering av det medfödda immunsvaret aktivatorer NF-kB och mediatorer av inflammation såsom TNF och IL1-β 6,7. Ändringar som döljer den negativa laddningen av lipid A förhindrar också bakteriedödande katjoniska antimikrobiella peptider från att binda till gram-negativa cellytor 3,8. Många lipid A ändringar hypotes att öka bakterie kondition under specifika miljöförhållanden, som t.ex. inuti den mänskliga värden eller i en ekologisk nisch. Av denna anledning många modifierings enzymer är attraktiva mål i en rationell utveckling av antimikrobiella föreningar. Den kemiska mångfalden av lipid A strukturer med avseende på organism och / eller miljö, och de biologiska konsekvenserna av dessa olika strukturer gör strukturbestämning av lipid A en viktig strävan itHan studerar för gramnegativa bakterier.

Isolering av lipid A-molekyler från hela bakterier involverar extraktion av LPS från bakteriecellytan, ett hydrolytiskt steg för att befria lipid A, följt av en slutlig reningsförfarande 9-11. Den oftast citerade LPS extraktionsförfarande är den varm fenol vattenuttag förfarande, först introducerades av Westphal och Jann 10. Efter extraktion hela LPS utsattes för mild syrahydrolys, vilket kemiskt separerar Kdo från 6'-hydroxylgruppen av den distala glukosaminsocker av lipid A (figur 1). Många fallgropar finns för varm fenol vatten förfarande inklusive användning av en hög risk reagens, är behovet av att bryta ned co-extraherade nukleinsyror och proteiner, och flera dagar krävs för att slutföra protokollet 10.

Vårt labb har vidareutvecklat extraktion och isolering av lipid A som först utvecklades av Caroff och Raetz 12,13. Jämfört med varmfenol vatten förfaranden, är den metod som presenteras här mer snabb och effektiv och rymmer ett brett utbud av kulturvolymer från 5 ml till flera liter. Till skillnad från hot-fenol vatten extraktioner, vår metod inte välja för grov-eller släta typer av LPS, som ger optimal återhämtning av lipid A-arter. I vårt protokoll, kemisk lys av hela bakteriella celler utfördes med användning av en blandning av kloroform, metanol och vatten, där LPS kan pelleteras genom centrifugering. En kombination av mild syrahydrolys och lösningsmedelsextraktionerna (Bligh-Dyer) används för att befria lipid A från kovalent bunden polysackarid. Metoden för Bligh och Dyer först tillämpades till utvinning av fettarter från en mängd olika djur-och växtvävnader 14, modifierat här att skilja hydrolyserad polysackarid från lipid A. I denna sista separationssteget, kloroform lösliga lipider selektivt fördelas i den lägre organiska fas. För att ytterligare rena lipid A, omvänd-fas elleranjonbytar-kolonnkromatografi kan användas 12.

Efter isolering av lipid A-arter från hela celler, kan ett antal analytiska metoder användas för att karakterisera den kemiska strukturen hos det isolerade material, såsom NMR, TLC och MS-baserad analys. NMR möjliggör icke-förstörande strukturell belysning, och ger strukturell detalj i samband med glykosidlänkar, entydig tilldelning av acylkedja positioner och tilldelning av fästplatser för lipid A modifieringar som aminoarabinose eller fosfoetanolamin 15-17. NMR-analys av lipid A diskuteras inte i våra protokoll, men har beskrivits på lämpligt sätt på andra ställen 15,16. För snabb analys TLC baserade metoder används ofta, men misslyckas med att ge direkt information om fina kemiska struktur. MS baserade protokoll är de ofta används metoden att karaktärisera lipid A strukturer 18,19. Matrix associeras laserdesorptionsjonisering (MALDI)-MS används ofta för att inledningsvis kart intakta lipid A arterna. Enkelladdade joner genereras från analyt framställd enligt våra extraktionsmetoder. När fler fina strukturell analys krävs, MS / MS-baserade metoder visa sig vara mer informativa än MALDI-MS. Kopplat till elektrosprayjonisering (ESI) för sig eller multiplicera laddad lipid A prekursor joner är dessutom splittrad genom kollision inducerad dissociation (CID) eller ultraviolett photodissociation (UVPD), för att generera strukturellt informativa produktjoner 18,20,21. Neutrala produkter förlust från lipid A-prekursor joner också ofta genereras under ESI-MS ger ett extra lager av strukturell information.

Tandem masspektrometri (MS / MS) har visat sig vara en nödvändig och mångsidig metod för att klarlägga lipid A-strukturer. Under MS / MS, joner aktiveras för att ge ett diagnostiskt fragmenteringsmönster som kan användas för att belysa strukturen av moderjon. Den mest available MS / MS-metoden är CID. Denna metod ger fragmentjoner via kollisioner i den valda moderjon med en inert mål gas, vilket resulterar i energi nedfall som leder till dissociation. CID har visat sig vara ett viktigt verktyg i tilldelningen av lipid En struktur för ett stort antal bakteriearter 22-33,.

Även CID är den mest allmänt implementeras MS / MS-metod, genererar det en begränsad uppsättning av produktjoner. 193 nm UVPD är ett alternativ och komplement MS / MS metoden. Denna metod använder en laser för att bestråla joner, och absorptionen av fotoner resulterar i aktivering av de joner och efterföljande dissociation. Denna högre energi MS / MS-teknik ger ett mer varierat utbud av produktjoner än CID och därmed ger mer informativa fragmenteringsmönster. Framför allt ger UVPD information om subtila förändringar i lipid En art som baseras på klyvningar vid glykosidbindning, amin, acyl och CC obligationer 18,21,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla lösningar skall beredas med ultrarent vatten och HPLC-kvalitet metanol och kloroform. Beredda lösningar som innehåller organiska lösningsmedel, såsom metanol, kloroform eller pyridin och koncentrerade syror eller baser bör framställas och användas inom ramen för ett kemiskt dragskåp. Alla lösningar kan lagras vid rumstemperatur. Lösningsmedel ska mätas i en graderad glascylinder och förvaras i glaslösningsmedelsflaskor med PTFE-fodrade mössor. För långtidslagring kloroform-innehållande lösningsmedel bör förvaras i tonade bruna glasflaskor för att undvika produktion av fosgen, en mycket reaktiv syraklorid. PTFE centrifugrör och roterande förångare kolvar bör sköljas med metanol och kloroform före användning. Följ nödvändiga federala, statliga och / eller bortskaffande institutionellt avfall föreskrifter när du kasserar lösningsmedel och / eller radioaktivt avfall.

1. Large Scale lipid A Extraktion (50 ml till 1,5 L)

  1. Förbered en enfas Bligh-Dyer blandning: klorformulär-metanol-1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4; 1:2:0.8 v / v). Kombinera 200 ml kloroform, 400 ml metanol och 160 ml PBS i 1 L lösningsmedelsflaskan. Cap flaskan och blanda genom inversion (> 30x). Lossa locket periodvis under blandning för att ventilera och lagra slöts.
  2. Bered en förekvilibrerad två-fas Bligh-Dyer blandning-kloroform: metanol: vatten (2:2:1.8 v / v). Kombinera 400 ml kloroform, 400 ml metanol och 180 ml vatten i en L lösningsmedelsflaskan. Cap flaska och blanda genom inversion, och se till att lossa locket regelbundet under blandning för att ventilera. Låt jämvikt O / N och lagra förseglas.
  3. Förbered mild syrahydrolys-buffert (50 mM natriumacetat, pH 4,5, 1% natriumdodecylsulfat (SDS)). Till 500 ml av mild syrahydrolys buffert, väger 2,05 g natriumacetat och överför till en 500 ml bägare. Tillsätt vatten till en volym av ~ 350 ml och rör om, tillsätt sedan 50 ml 10% SDS. Blanda och justera pH till 4,5, överför till en graderad cylinder, och tillsätt vatten till 500 ml.
  4. Förberedkloroform: metanol (04:01, v / v): Mät 100 ml kloroform och överföra till lösningsmedelsflaskan. Mät 25 ml metanol och blandas med kloroform. Förvara i bärnstensfärgad glasflaska.
  5. Inokulera 5 ml medium (Luria buljong eller andra) från en enda bakteriekoloni. Grow O / N vid 37 ° C, eller vid behov ° C för tillväxt. Ett diagram av extraktionsförfarandet är visad i figur 2.
  6. Nästa dag, mät OD600 och använda 5 ml O / N-kulturen för att ympa 200 ml av kulturen till ett utgångs OD 600 av 0,05. Odla celler tills en OD 600 av 0,8 till 1,0 har uppnåtts.
  7. Skörda cellerna via centrifugering vid 10000 x g under 10 min. Längre snurrar kan krävas för påfrestningar som pellets dåligt. Häll av medievätskan.
  8. Tvätta cellpelleten med 50 ml 1x fosfat saltlösning (PBS). Upprepa centrifugering för att pelletera cellerna. Häll bort supernatanten och lagra cellpellet vid -20 ° C, eller vidare till steg 1,9.
  9. Återsuspendera cellerna i 40 mlav 1 x PBS och klyftan mellan två 250 ml PTFE-centrifugrör (vilket gav 20 ml av cellsuspension / rör). Tillsätt 25 ml kloroform och 50 ml metanol till varje rör, till en enda fas Bligh-Dyer (kloroform: metanol: vatten; 1:2:0.8 v / v) (Figur 2). Blanda genom inversion och inkuberas vid RT i> 20 min för att säkerställa fullständig cellys.
  10. Centrifugera blandningen vid 2000 x g under 20 min. LPS kommer pelle tillsammans med proteiner och nukleinsyror (figur 2), men kommer fosfolipider, isoprenyl lipider, och små, hydrofoba peptider förblir i supernatanten. Kasta bort supernatanten.
  11. Tvätta LPS pellets med ~ 100 ml enfas Bligh-Dyer blandning. Centrifugera vid 2000 x g under 20 min. Kassera supernatanten. När isolering av lipid A från E. coli eller Salmonella, är bara en tvätt behövs, men ytterligare tvättsteg kan behövas för att minska fosfolipid förorening när isolera lipid A från vissa organismer.
  12. Lägg till 27 ml milld syrahydrolys-buffert (50 mM natriumacetat, pH 4,5, 1% SDS, se steg 1,3) till LPS-pellet, och blanda genom att pipettera upp och ned tills endast små partiklar blir kvar. Sonikera för att homogent resuspendera LPS pelleten i lösning med sondspetsen sonikator vid en konstant arbetscykel för 20 sekunder vid 50% effekt. Upprepa ultraljudsbehandling av prov 2x (20 sek / brista, ~ 5 sek mellan skurar).
  13. Koka proverna i ett vattenbad under 30 min. Varning: se till att locken är täta, men inte helt tät. Vissa organismer, t.ex. Vibrio cholerae (V. cholerae) kräver längre inkubationstider (1 timme) för att öka den totala avkastningen av lipid A. Ta bort flaskorna från vattenbadet och låt provet svalna till rumstemperatur innan du fortsätter.
  14. För att extrahera lipider efter hydrolys, konvertera SDS-lösningen in i en två-fas Bligh-Dyer (Figur 2)-blandning genom att tillsätta 30 ml kloroform och 30 ml metanol, under en kloroform: metanol: vatten (2:2:1.8, v / vol)-blandning. Blanda genom att vända upp och centrifugera provet under 10 min vid 2,000 X g. Extrahera den undre fasen i en ren PTFE centrifugrör med hjälp av ett glas pipett.
  15. Utför en andra extraktion genom att tillsätta 30 ml undre fas från en förekvilibrerad tvåfas Bligh-Dyer blandning (steg 1,2), till den övre fasen från steg 1,14. Mix, sedan centrifugera vid 2000 xg under 10 minuter. Extrahera den undre fasen, och pool med den lägre fasen extraherades i steg 1.14.
  16. Tvätta de sammanslagna lägre faserna (60 ml totalt) genom att tillsätta 114 ml förjämviktad två fas Bligh-Dyer övre fasen (steg 1,2) för att skapa en två-fas Bligh-Dyer blandning (kloroform: metanol: vatten, 02:02: 1,8, vol / vol). Blanda. Centrifugera vid 2000 x g under 10 min.
  17. Ta bort den undre fasen till ett rent glas rotationsförångare kolv och torra provet med användning av rotationsindunstning (Figur 2).
  18. Tillsätt 5 ml kloroform: metanol (4:1, v / v) till den roterande kolven och bad-sonikat (> 30 sek) för att bistå i suspension av lipid från sidorna av kolven. Använd ett glas överföringspipett att överföra lipiden till en renglasrör (13 x 100 mm eller större) täckta med PTFE-fodrade fenolskruvlock. Torr provet under en ström av kväve med användning av en kväve torktumlare.
  19. Resuspendera torkad lipid i 1 ml kloroform: metanol (04:01, v / v). Överföring till små glasprovflaska (12 x 32 mm) med en avsmalnande bas för mer kvantitativ resuspension med hjälp av små volymer (se tabell av utrustning / reagenser). Torka med hjälp av en kväve torktumlare.
  20. Torkade prov kan förvaras vid -20 ° C fram till efterföljande TLC (protokoll 2) eller MS-analys (Protokoll 3, 4 eller 5). (OBS: Mängden material isoleras och användas i efterföljande protokoll föreslås baserat på vad som är tillräckligt för de flesta organismer Samma lipid prov kan användas i protokollen 2-5 och noterade% material avlägsnas Se Diskussion för mer information...).

2. Visualisering av Lipid A Arter via tunnskiktskromatografi

  1. Förbered TLC mobilfas lösningsmedelssystem (kloroform: pyridin: 88% myrsyra: vatten; 50:50:16:5 volym / volym). Combine 200 ml kloroform, 200 ml pyridin, 64 ml 88% myrsyra, och 20 av ml vatten i en 1 L lösningsmedelsflaskan. Cap flaska, blanda genom inversion flera gånger, och ventilera.
  2. Använd en TLC tank som kommer att rymma 20 x 20 cm plattor. Linje TLC tank med ~ 40 cm kromatografipapper.
  3. Till TLC tank lägga 200 ml kloroform: pyridin: 88% myrsyra: vatten (50:50:16:5, volym / volym)-blandning. Tillåt tanken att i förväg bringas i jämvikt i> 3 timmar, ofta O / N är föredraget och bekvämare.
  4. Ta bort torkade lipid prover från frysen (steg 1.20) och låt varmt till RT.
  5. Med en rakhyvel avlägsna kiseldioxiden från den övre kanten av en silikagel 60 TLC-platta. Med hjälp av en tråkig penna, rita en linje parallell med botten av plattan, 2 cm från botten. Denna linje är ursprunget för spotting prover. Mark stegar längs denna referenslinje för att upptäcka prover 1 cm från varandra.
  6. Lös torkad lipid från steg 2,4 i 200 ul av kloroform: metanol (04:01, v / v), virvel och sonikera (3x, ~ 15 sek vardera), utbyten ~ 100 -500 ng / | il lipid A om extraherad från E. coli.
  7. Genom att använda en mikrokapillär glas-pipett, spot en tiondel av den volym (20 | il) på TLC-plattan som markerat i steg 2,5. Låt proverna lufttorka på TLC-platta för ~ 15 min. (OBS: Prov i små glasflaskor kan torkas med hjälp av en kvävetork och förvaras vid -20 ° C för senare användning i protokollen 3-5 Notera% material avlägsnats.).
  8. Placera TLC-plattan innehåller prickiga prov i förjämviktad tank. När lösningens front når toppen av TLC-plattan (~ 2,5-3 timmar), ta bort plattan och lufttorka (> 60 min). En kall luftpistol kan användas för att säkerställa fullständig torrhet.
  9. Medan plattan torkar, slå på värmeplatta vid 250 ° C för kolning.
  10. I ett ventilerat dragskåp, förbereda 10% svavelsyra-etanolblandning för förkolning lipider lösta på silika TLC-platta (koncentrerad svavelsyra: 100% etanol, 01:09 v / v). Mät 10 ml svavelsyra och tillsätt långsamt till 90 ml av 100% etanol. Carefullt blanda och överför till en glas kromatografisk reagenssprejflaska.
  11. I dragskåp, använd ett glas kromatografisk reagens sprayflaska att spraya torkade TLC-plattan med 10% svavelsyra-etanolblandning. Spraya blandningen jämnt över plattan.
  12. Placera TLC-plattan i 250 ° C varm platta tills förkolnade lipid prover visas som svart / bruna fläckar (<1 min). Inte överexponera plattan, eftersom detta kommer att leda till att hela plattan för att bli brun och gör visualisering av lipid A arter svårt.

3. Strukturell karakterisering av lipid A genom MALDI-TOF-masspektrometri

  1. Från steg 1,20, (eller steg 2,7) avlägsna lipid Ett prov från frysen och låt varm till RT. Resuspendera torkad lipid Ett prov i ~ 20 | il kloroform: metanol (4:1, volym / volym) och skaka för att erhålla en ~ 1-5 ug / ul lipid A-lösning om extraherad från E. coli. (OBS: 10% mindre koncentrerad om material som används från steg 2,7).
  2. Förbered ATT matriskomponenter. Mättade 6-aza-2-thiothymine i 50% acetonitril: tillsätt 500 | il vatten och 500 | il acetonitril till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och lägger sedan till> 10 mg 6-aza-2-thiothymine så att 50% acetonitril är övermättad. Mättat trebasiskt ammoniumcitratlösning: Lägg> 1 mg till 500 l vatten, fällning ska vara lätt att identifiera. Vortex och centrifug lösningar före användning, endast mättade supernatanten används.
  3. Förbered ATT matris blandningen: mättad 6-aza-2-thiothymine i 50% acetonitril, mättad tribasiskt ammoniumcitrat (20:01, v / v). Blanda matrixkomponenter samman genom att tillsätta 20 pl ATT lösning på 1 pl mättade trebasiskt ammoniumcitratlösning i 500 pl mikrocentrifugrör, virvel att blanda och centrifugera innan du ansöker till MALDI platta.
  4. Förbered MALDI platta genom att lägga till 0,5 pl kalibreringsblandning till MALDI plattan på en plats nära där proverna kommer att deponeras, för att ge den mest exakta massa / laddningsförhållande beslutsamhet.
  5. Deposit 0,5 jilav ATT matris på MALDI platta på varje plats där lipid Ett prov kommer att deponeras.
  6. Deposition 0,5 pl av prov (2,5% av totala urvalet) på plats i ATT-matris, för att blanda på plattan, och förvärva spektra genom att skanna provet för optimal jon-signaler (Figur 3). Anmärkning: beloppen för den mest optimala MS-signalen kan variera med organismen och måste bestämmas empiriskt. För att lägga till mer material man kan upptäcka 0,5 pl flera gånger medger fläckig blandning torka i mellan tillägg av mer prov. Provet kan också vara koncentrerad (torr och återsuspendera i en mindre volym) eller utspädd efter behov. Mer utgångsmaterial (volymen av startcellkultur) kan också användas (se diskussion).

4. Elektro jonisering masspektrometri och Collision dissociation of Lipid A

  1. Bered en kloroform: metanol-lösningsmedelsblandning (01:01, v / v) genom blandning av en 200 | il lager av HPLC-kvalitet metanol med 200 ml av HPLC-kvalitet kloroform i en glas solventilera flaskan.
  2. Överför 200 ìl av kloroform: metanol lösningsmedelsblandning till flaskan med lipid A (t.ex. från steg 1,20, 2,7, eller torkas efter protokoll 3) och låt ligga lipid en lösning i 5 min eller tills allt material är upplöst.
  3. Ställ in masspektrometer för negativ läge elektrosprayjonisering.
  4. Med hjälp av en spruta 250 | il och en sprutpump, direkt ingjuta den utspädda lipid A-provet vid en flödeshastighet av 2,0 till 3,5 | il / min.
  5. Optimera och förbättra lipid En jon signal genom att ställa de jon optik. En komplett masspektrum kan nu samlas av lipid A arterna (figur 4).
  6. Isolera och aktivera målet lipid A genom att välja CID eftersom MS / MS-metod.
  7. Öka CID spänningen (eller normaliserad kollisionsenergin, NCE) tills prekursor lipid A arterna är ca 10% relativt överskott jämfört med den högsta produkten jon.
  8. Förvärva och genomsnittlig spektra tills tillräcklig signal-till-brus uppnås för the produktjoner. Antalet avsökningar som krävs är beroende av signalintensiteten av den ursprungliga prekursorn och kan variera från 3 till 300 skanningar (figur 5A).

5. MS / MS på Lipid A från ultraviolett Photodissociation

  1. Förbered prov och masspektrometer som i steg från 4,1 till 4,5.
  2. Sätt på lasern interface-anpassad till masspektrometern. Masspektrometern var utrustad med en 193 nm excimerlaser och modifieras för att tillåta UV-aktivering i HCD cell av instrumentet. Photodissociation genomfördes på ett sätt liknande det som beskrivits tidigare 35. Vi använder en modifierad vakuumgrenrör med en CaF2 optiska fönstret för att överföra fotoner i det högre energi C-trap dissociation (HCD) cell. Lasern utlöses under MS / MS av en transistor-transistorlogik (TTL) signal från masspektrometern för en puls / fördröjningsgeneratorn.
  3. Ställ in instrumentets programvara, så att lasern kommer att utlösa excimerlaser närjoner in i HCD cellen. Detta kräver en blygsam modifiering av programvaran.
  4. Slå på pulsgeneratorn så att lasern pulsas varje 2 ms (500 Hz).
  5. Isolera lipid A moderjon genom att välja HCD som MS / MS-metoden och justera kollisionsenergi till 1% NCE. Detta gör att isolering av utgångsjoner för ultraviolett dissociation inom HCD cellen. Fastän HCD cellen används är programvaran modifierats för att utföra UVPD under detta intervall.
  6. Aktivera isolerade lipid A jon genom ökning av laserenergi och inställning av antalet laserpulser. Ett typiskt UVPD experiment kommer att utföras med hjälp av tio 6 ml pulser.
  7. Precis som i steg 4.8, förvärva och genomsnittlig spektra tills tillräcklig signal-till-brus uppnås för UVPD produktjoner. Antalet avsökningar som krävs är beroende av signalintensiteten av den ursprungliga prekursorn och kan variera från 3 till 300 skanningar (Figur 5B).

32 P-märkning 6.av lipid A och efterföljande isolering

  1. Inokulera 5 ml medium (Luria buljong eller andra medier) från en enda koloni. Grow O / N vid 37 ° C eller vid önskad temperatur.
  2. Nästa dag, mät OD600 och använd O / N-kulturen för att ympa 7 ml av kulturen till ett utgångs OD 600 på ~ 0,05, som odlas i ett standard 20 x 150 mm engångsglas odlingsrör. Lägg till 2,5 ^ Ci / ml av oorganiskt 32 s. Odla celler tills en OD 600 av 0,8 till 1,0 har uppnåtts. Följ federala, statliga och / eller institutionella riktlinjer för säker och korrekt hantering av radioaktivt material.
  3. Skörda cellerna i 16 x 125 mm glas centrifugrör med PTFE-fodrade lock med användning av en fixerad vinkel klinisk centrifug vid 1500 x g under 10 min. Avlägsna supernatanten i lämplig avfallsbehållare radioaktiv. Allt radioaktivt avfall (t.ex. vätska, glas, biohazard) genereras i efterföljande steg ska kasseras i enlighet med federala, statliga och / eller institutionella guidelines.
  4. Tvätta cellpelleten med 5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Centrifugera i 10 minuter vid 1500 x g.. Kassera supernatanten.
  5. Återsuspendera cellerna i 5 ml av enfas Bligh-Dyer blandningen (figur 2) bestående av kloroform: metanol: vatten (1:2:0.8, volym / volym). Vortex för att blanda och inkubera vid RT i> 20 min för att säkerställa fullständig cellys.
  6. Centrifugera i klinisk centrifug vid 1500 x g under 20 min. Häll försiktigt av supernatanten, som innehåller fosfolipider och isoprenyl lipider.
  7. Resuspendera LPS pelleten i 1,8 ml 50 mM natriumacetat, pH 4,5, 1% SDS-buffert genom att vortexa. Sonikera provet med en badsonikator tills pellets är jämnt spridd (~ 30 sek).
  8. Inkubera provet under 30 minuter i kokande vattenbad. Se till att locken är täta men inte förseglade.
  9. Ta bort från vattenbadet och låt provet svalna vid rumstemperatur under 5-10 min.
  10. Konvertera lösningen i en två-fas Bligh-Dyer blandning genom tillsats av 2 ml kloroform och 2 mlmetanol, vilket gav en kloroform: metanol: vattenhaltig (2:2:1.8 v / v) blandning. Vortex för att blanda och centrifugera i 10 min i klinisk centrifug vid 1500 x g för att separera faserna.
  11. Extrahera den undre fasen i ett rent glas centrifugrör med hjälp av ett glas pipett (första extraktion).
  12. Utför en andra extraktion på provet genom att tillsätta 2 ml av en pre-ekvilibrerad två-fas Bligh-Dyer undre fasen (som framställts såsom i steg 1,2) till den återstående övre fasen från steg 11. Vortexa och centrifugera 10 min. Ta bort nedre fas och kombinera med den undre fasen från den första extraktionen.
  13. Till den poolade undre fasen (~ 4 ml total volym), tillsätt 7,6 ml av pre-ekvilibrerad övre fasen (steg 1,2), vilket gav en två-fas Bligh-Dyer lösning (kloroform: metanol: vatten; 2:2:1.8, v / v). Vortexa och centrifugera i 10 min.
  14. Ta bort den undre fasen till ett rent glasrör och torrt med en kväve torktumlare. Torkade prover kan lagras vid -20 ° C tills vidare användning.

7. Visualiseringtion av 32 P-märkt lipid A Arter via tunnskiktskromatografi

  1. Förbered 32 P-märkt lipid Ett prov, TLC tank, och TLC-plattor som beskrivs i steg från 2,1 till 2,8.
  2. Lös upp 32 P-märkta provet i 500 | il av 04:01 kloroform-metanol (volym / volym). Vortex och bad sonikat att helt upplösa fettmaterial. Lägg 5 | il av provet till scintillations-flaska innehållande 5 ml scintillationscocktail. Räkna in scintillationsräknare och beräkna totalräkningar / min av prov.
  3. När visualisera radiomärkta fettarter, kan användas 10 x 20 cm eller 20 x 20 cm TLC-plattor. För 10x20 cm plattor, bör prover upptäckas längs ursprung markerade i steg 2,5, så att plattans längsta dimension är vertikalt (dvs. prover prickiga vid ursprungs märkt 2 cm över 10 cm kant).
  4. Med hjälp av en mikrokapillär pipett, spot 10,000-20,000 cpm / prov på plåt och låt fläckar torka (> 15 min). Proverna kan behöva koncentreras genom torkning underkväve och suspenderade i en lämplig volym, för att uppnå 10,000-20,000 räkningar / min / spot (2 l eller 2 l åt gången för <10 l totalt).
  5. Placera TLC-platta som innehåller radiomärkta prover i förjämviktad tank. När lösningens front når toppen av TLC-plattan (~ 3 timmar), ta bort plattan och lufttorka (> 60 min). Varning: TLC-plattor som drivs i närvaro av pyridin måste torkas noggrant i ett kemiskt dragskåp, såsom spårmängder av pyridin kan skada phosphorimaging skärmar. En kall luftpistol kan användas för att säkerställa fullständig torrhet.
  6. Linda in plattan i plastfolie och utsättas för fosforskärmen i en autoradiografi kassett O / N. Nästa morgon, skanna på skärmen för att få bilden (Figur 6). Använda bild densitometry analysprogram, tillåter denna metod för exakt, relativ kvantifiering av lipid A arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Canonical lipid A från E. coli och Salmonella enterica serovar Typhimurium är en hexa-acylerad disackarid av glukosamin med fosfatgrupper vid 1 - och 4 "-positionerna. Under tillväxt i rika medier (t.ex. Luria Broth) ett parti av den lipid A innehåller en pyrofosfatgrupp vid 1-ställningen i utbyte ge en Tris-fosforylerade art 36 (figur 1). Kdo (3-deoxi-D-manno-octulosonic syra), är fäst vid 6'-hydroxylgruppen och tjänar som en brygga för att koppla lipid A till de återstående kolhydrat domäner (dvs kärna oligosackarid-och O-antigen domäner) av LPS. Även gramnegativa bakterier delar en konserverad väg för lipid A biosyntesen liknande den för E. coli K-12, finns det en stor mängd av mångfald i lipid A-strukturer. Denna mångfald beror på verkan av latenta enzymer som modifierar den lipid A-struktur, vilka aktiveras som svar på stimuli från omgivningen. Till exemle, i S. enterica fosfatgrupperna av lipid A kan modifieras med den katjoniska socker L-4-aminoarabinose (Figur 1; blå) eller med en fosfoetanolamin återstod (Figur 1; magenta). I Salmonella dessa ändringar regleras av två-komponentsvarsregulatorsystem, tillade som svar på låga [Mg2 +], mild-surt pH, och närvaron av katjoniska antimikrobiella peptider. Dessutom i Salmonella, kan palmitat sättas för att bilda en hepta-acylerad lipid A, som befrämjar motstånd mot katjoniska antimikrobiella peptider (Figur 1; grön) 8. Andra modifieringar innefattar, men är inte begränsade till, avlägsnande av fosfatgrupper och acylkedjor, eller dioxygenas katalyserade additionen av en hydroxylgrupp till 3'-länkad sekundär acylkedja observerats i en rad olika organismer 1,3.

Isolering av intakt lipid A från hela celler av vår modifikation av metoden av Caroff och Raetz beskrivs i protokoll 1 (figur 2). Denna isolering metod har använts för att uppskatta att 10 sex molekyler av lipid A existera per bakteriecell av E. coli 37. Följande protokoll 1 och 3, den negativa jon MALDI-TOF mass spektrum av lipid A från E. coli K-12 (W3110) ger var för sig deprotoneras jon ([MH] -) vid m / z 1,796.20 som majorly observerade arter (Figur 3). MALDI-TOF-MS utfördes i negativ-reflektron-läge för att förbättra spektral upplösning. Alternativt kan samma lipid prov utsattes för negativ läge nano-ESI (Protokoll 4) ger huvudsakligen dubbelt deprotoneras lipid A joner vid m / z 898,1 betecknas med [M-2H] 2 - (bild 4). Var för sig deprotonerad lipid A joner [MH] - vid m / z 1,796.20 är observer, men är av lägre relativa överflöd till [M-2H] 2 - joner (Figur 4). Multiplicera laddade species övervägandenate vid användning av ESI. Fragmentering av CID (figur 5A) eller 193 nm UVPD (figur 5B) utfördes på [MH] - lipid A jon m / z 1,796.20. Dessa tekniker kan användas för att bättre tilldela kemiska strukturer, särskilt av lipid A-arter innehåller komplexa kombinationer av ändringar eller tidigare uncharacterized kemiska modifieringar. Fragmentation profiler visas med streckade linjer som representerar klyvningsställen och matchas med m / z-värden under var och en försedd struktur (figur 5). De m / z-värden och klyvningsställen markerade med rött representerar unika produktjoner i samband med UVPD.

Såsom beskrivs i protokoll 6 och 7, 32 P-märkt lipid A isolerades från två olika E. coli K-12-stammar analyserades med TLC (Figur 6). W3110 mestadels innehåller bis-och tris-fosforylerades lipid A (Figur 6;vänster körfält), medan en mer komplex TLC-mönstret observerades med 32 P-lipid A isolerades från E. coli-stam WD101 (Figur 6, höger körfält) 38. WD101 tillverkar lipid En kraftigt modifierad med aminoarabinose (L-Ara4N) och fosfoetanolamin (PETN). Eftersom både 1 - och 4 "- fosfater är tillgängliga för modifiering, kan lipid A från WD101 beskrivas som var för sig ändras, innehåller endast en L-Ara4N eller PETN antingen fosfat, eller dubbelt modifierade där båda fosfater ändras i kombinato sätt. Förutom modifiering vid 1 - och 4 "- fosfater, palmitat Dessutom observeras också (se figur 1) och ökar Rf-värde av lipid A arterna i detta lösningsmedelssystem (figur 6). Om så önskas densitometri analys med användning av en fosforavbildning, kan användas för att kvantifierbar uppskatta relativa mängder av lipid A arterna inom samma prov.


Figur 1. Representant lipid A domänstrukturer från E. coli K-12 och S. enterica serovar Typhimurium. Ändringar av den bevarade lipid En struktur visas (till höger), som beskrivs i Representativa resultat. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Schematisk bild av lipid A isoleringsförfarande. Outline skildrar kemisk lys av bakteriecellpellet använda enfas Bligh-Dyer blandning, centrifugering av lysatet till pellets LPS, mild-a cid hydrolys för att frigöra lipid A från bifogad polysackarid, och slutlig rening av lipid A med två fas Bligh-Dyer extraktion. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. MALDI-MS-analys av lipid A isolerades från E. coli K-12 (W3110). Spektra erhölls från medelvärdet av> 300 skott. Enkelladdade [MH] - lipid A observeras som den molekylära jonen vid m / z 1,796.2, vilket motsvarar en deprotonerade arter av strukturen visas till höger.

0623/50623fig4.jpg "/>
Figur 4. ESI-MS-analys av lipid A isolerats från E. coli K-12 (W3110) Enkla [MH] och dubbelt laddade [M-2H] 2 -. lipid A arter observeras som molekylära joner med m / z 1,796.2 och m / z 898,1, respektive.

Figur 5
Figur 5. MS / MS-analys av lipid A isolerades från E. coli K-12 (W3110). Kollision dissociation (A) eller ultraviolett photodissociation (B) användes för att fragmentera moderjon m / z 1,796.2. UVPD specifika produktjoner är markerade med rött. En splittrings karta tillhandahålls (C), där svart streckade linjerna indikerar fragmentering associerad med både CID och UVPD och röda streckade linjerna indikerar UVPD specifika fragmentering. Värden som anges under fragmentering kartan motsvarar exakt massor [MH] -. Produkt joner Klicka här för att visa en större bild .

Figur 6
Figur 6. TLC-baserad separation av lipid A arter isoleras från E. coli K-12 32 P-märkt lipid A isolerades från W3110 (vänster fält) eller WD101 (höger bana) och separerades på en TLC-tank lösningsmedelssystem innehållande kloroform:. pyridin: 88% myrsyra: vatten (50:50:16 : 5 v / v).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll har vi detaljerade isolering av lipid A arter från hela celler av bakterier, och beskrev TLC eller MS baserade analysmetoder för att kemiskt karakterisera denna isolerade material. Tandem masspektrometri är en kraftfull strategi för de novo strukturell karakterisering av biologiska ämnen, och är ovärderlig för den kemiska karakterisering av arsenalen av lipid A-molekyler som finns i naturen. CID och UVPD är två kompletterande aktiveringsmetoder som skapar olika typer av produktjoner som ger nyckel fingeravtryck för lipid A-molekyler. MS / MS fragmentering med hjälp av både CID och UVPD möjliggör belysning av subtila skillnader i lipid A-strukturer, som ger finare detaljer för kemisk struktur uppdrag. Uppgifter av detta slag är nödvändigt att fastställa exakta korrelat struktur / funktionssamband i biologi lipid A molekylslag. Vi har också beskrivit förfarandet för 32 P-radiomärkning lipid En art i sgalleria skala bakteriekulturer, där den kemiska mönster av 32 P-lipid En art kan visualiseras med hjälp av TLC och autoradiografi.

Det finns ett antal funktioner för att detta protokoll att alla användare bör vara medveten om. För storskaliga preparat lipid A (protokoll 1), kan andelen starta lösningsmedel till mängden bakteriell pellet optimeras för att förbättra den totala avkastningen. Men detta förhållande kan endast bestämmas empiriskt. De belopp som anges i detta protokoll utgör en bra utgångspunkt för de flesta bakteriestammar. Kultur volymer för lipid A extraktion och isolering kan också justeras beroende på vilken bakteriestam som du arbetar med. Till exempel V. cholerae kräver minst 200 ml kultur för att få hög kvalitet masspektra, men kulturen volymen för E. coli kan skalas ner till 5 ml. Mer utgångsmaterial (större kulturvolymer) krävs för vissa bakteriearter eftersom hydrolysutförs steg som frigör lipid A från hela LPS är mindre effektiv. Exempelvis organismer som innehåller en funktionell Kdo dioxygenas eller Kdo kinas uppvisar minskade lipid A ger efter mild sur hydrolys 39. Ofta mutanter med förändrade LPS / lipid A-strukturer eller en särskild bakterieart är ofta svåra att pelle under cellskörd. För dessa stammar kan längden av centrifuge förlängas för att öka utbytet. Värt att notera, efter cell-lys i en enfas Bligh-Dyer blandningen och LPS pelleteras (se steg 1.9), kan ytterligare tvättsteg krävas för att minska fosfolipid kontamination. När isolering av lipid A från E. coli eller Salmonella, är endast en tvätt krävs. Om isolera lipid A från andra organismer (t.ex. V. cholerae eller Helicobacter pylori) krävs ytterligare tvättsteg krävs.

Efter mild syra hydrolys i SDS, utbytet av lipid En art med nedsatt hydrofoba (dvs. mer phosphate grupper> 2 eller färre acylkedjor <5) kan förbättras genom att använda en sur Bligh-Dyer extraktion. För de mängder som används i protokollenheten 1, tillsätt 225 | il av koncentrerad HCl till den SDS-lösning innehållande hydrolyserat lipid A, följt av 30 ml kloroform och 30 ml metanol under en två fas Bligh-Dyer blandning av kloroform: metanol: 0,1 M HCl (2:2:1.8, volym / volym). För de mängder som används i protokollenheten 6 lägga 15 ^ il koncentrerad HCl till den SDS-lösning innehållande hydrolyserat lipid A, följt av 2 ml kloroform och 2 ml metanol, vilket gav en kloroform: metanol: 0,1 M HCl (2:2:1.8, v / vol)-blandning. Efter en sur Bligh-Dyer extraktion, kan pyridin tillsättas till de sammanslagna lägre faserna för att neutralisera syran (1 droppe pyridin / 2 ml av en slutlig provvolym). Detta ytterligare steg bör utföras innan torkning av provet, i en kemisk dragskåp. Var noga med att inte använda överskotts pyridin, vilket kan leda till avlägsnande av esterbundna fettsyror. Dessutom, om lipiden sample är svåra att torka under kväve, tillsätt några ml kloroform: metanol (04:01, v / v) till kolven och fortsätter att torkas provet till fullständighet.

Den komplexa kemiska heterogenitet lipid A arter som observerats i vissa organismer (t.ex. V. cholerae, Yersinia pseudotuberculosis) kan ibland göra TLC-eller MS-baserad analys svår. Pelarkromatografi kan användas uppströms av dessa analysmetoder för att pre-fraktionera isolerade lipid A arter i mer enkla blandningar. Anjonbytare med dietylaminoetyl (DEAE)-cellulosa används oftast 40. Som en allmän riktlinje lipid En modifierad antingen fosfat läge, med icke-sura grupper såsom aminoarabinose eller fosfoetanolamin, elueras före omodifierade lipid En art 40. Likaså tris-fosforylerades lipid A eluerar väl efter omodifierade bisphosphorylated arter 36,40. Omvänd fas-kromatografi kan användas för fraktionering av lipid A species av varierande grader av hydrofobicitet 41. Kolonnkromatografi är också användbara vid avlägsnande av kvarvarande SDS efter mild syrahydrolys och efterföljande Bligh-Dyer lipid A extraktionssteg. Höga halter av rest SDS kan bidra till att signalera dämpning i spektra som erhållits av våra känsliga ESI-MS-protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag AI064184 och AI76322 från National Institutes of Health (NIH) och av Grant 61789-MA-MUR från Army Research Office till MST forskning stöddes också av Welch Foundation Grant F1155 och NIH bevilja R01GM103655 till JSB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Tags

Chemistry membranlipider Toll-like receptors Endotoxiner glykolipider lipopolysackarider lipid A mikrobiologi Lipids lipid A Bligh-Dyer tunnskiktskromatografi (TLC) en lipopolysackarid masspektrometri Collision Induced Dissociation (CID ) Photodissociation (PD)
Isolering och kemisk karakterisering av lipid A från gramnegativa bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Henderson, J. C., O'Brien, J. P.,… More

Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter