Summary
RAS V12 ve karalanmış, tümör hücreleri de invaziv davranışlar sergileyen Drosophila tümör büyüme neden gibi hücre polarite genlerindeki mutasyonlar gibi bir aktive onkogen arasındaki işbirliği. Burada iyi huylu ve invaziv tümörlerin indüksiyon ve gözlem için basit bir protokol verilmektedir.
Abstract
Drosophila karmaşık hastalıkların 1-7 anlamamıza büyük katkı devam ediyor son birkaç yıldır ve bugün için normal gelişim ve hastalığın genetik temeli anlayışımızı aydınlatmıştır. Bir metastatik duruma iyi huylu tümörlerin ilerlemesi karmaşık bir olay 8 ve bizi daha iyi bu hastalığın 9 genetik temelini anlamak için Drosophila modellenmiştir. Burada genetik, neden gözlemlemek ve sonra Drosophila larvaları tümörlerin ilerlemesini analiz etmek için basit bir protokol mevcut. Tümör indüksiyon tekniği MARCM 10 sistemi tabanlı ve aktif bir onkogen, Ras V12 ve hücre polarite genlerinin kaybı (karalanmış, diskler büyük ve ölümcül dev larva) invaziv tümörleri 9 üretmek arasındaki işbirliğini patlatır edilir. Ben bu tümörler sağlam larvaları görüntülendi olabilir nasıl göstermek veo zaman nasıl bu daha fazla analiz için dışarı disseke edilebilir. Burada sunulan basitleştirilmiş protokolü mümkün bu tekniğin tümör işgali bir genin rolünü anlamak isteyen araştırmacılar tarafından kullanılmak için yapmalıdır.
Introduction
Metastatik bir duruma bir iyi huylu tümörlerin ilerlemesi gövde 8 içinde mevcut koruyucu mekanizmaların kaçırma ile karakterize aşamalı bir işlemdir. Örneğin, vücut, tümör hücrelerinin, apoptoz ve bağışıklık sistemini kaçmasına Bazal Membran olarak adlandırılan özel bir hücre dışı matrisi (ECM) atılım ve çevredeki hücrelerin 8 tarafından uygulanan herhangi bir sosyal kontrol aşmak gerekir. Bu kanser hücreleri metastaz denilen bir süreçte uzak siteleri göç ve kolonize yeteneğini kazanmış bir adım akıllıca ilerlemesi geçer. Tümör hücresi vücut tarafından dayatılan engellerin üstesinden nasıl anlayışımız, ancak araştırma ortaya çıkan resim kanser hücreleri 11-13 normal gelişim süreçleri ve sinyal yollarının tekrar tekrar kullanılması bugüne kadar puan yapmış, hala emekleme döneminde olduğunu.
Meyve Drosophila melanogaster bizim und müthiş katkıda bulunmuştur uçmakSon birkaç on yıl boyunca 14-17 geliştirmiştir gelişmiş genetik tekniklerin kullanımı ile normal büyüme ve gelişme hastalığı erstanding. Biz çeşitli onkogenler ve tümör baskılayıcı genlerin 18-22 daha iyi anlaşılması ulaştık mutajenizi ve ekspresyonu araçlarını kullanma. Bununla birlikte, tümör metastazı hücre kültürü modelleri 23,24 yanı sıra çeşitli ksenograft modelleri 25-27 temel olarak incelenmiştir çeşitli genetik lezyonlar arasındaki işbirliğinin bir sonucudur. Bunlar tamamen canlı bir organizmada bulunan koşullarını taklit yok gibi, bu modellerin güçlü olsa sınırlamaları var. Ayrıca, farelerde mevcut transgenik modeller hantal ve invaziv davranış 28,29 genetik analizi için elverişli değildir. Çeşitli çalışmalar Drosophila 30,31 tümör hücrelerinin işgali anlamaya çalıştılar. Bu teknikler öncelikle hosts birincil tümörlerin nakli kullanmak ve sonra tra izleme güveniyorkomşu dokuların 32,33 işgali için tümörleri nsplanted. MARCM 10 denilen güçlü bir tekniktir Drosophila 9 tümör işgali model Pagliarini ve Xu tarafından uyarlandı. Invazyon Bu zarif genetik modelleme bir aktive onkogen ve hücre polarite kaybı arasındaki işbirliğini kullandı. Bu modelleme gücü istilacı tümör böylece dokuların nakli ihtiyacını engellemeyi sağlam bir organizma içinde oluşturulan gerçeğinde yatmaktadır. Onkojenik işbirliği meydana getirmek için, Ras V12 gibi aktive edilmiş bir onkogen larva göz antennal disk hücre klonlarının ifade edilir. MARCM tekniğin bir sonucu olarak, bu klonlar, aynı zamanda kolay görselleştirme için yeşil floresan protein (GFP) ile işaretlenmiştir ve dev larva öldürücü, karalanmış ve büyük diskler gibi cep kutup mutantlar için homozigot yapılır. Sonuç GFP invaziv tümörleri olan etiketli sefalik karmaşık. Bu raporda Iikna etmek için nasıl göstermek ve sağlam bir larva bağlamında ve dışarı disseke sefalik kompleksi hem bu invaziv tümörleri görselleştirmek. Burada sunulan tümör indüksiyonu Drosophila ikinci kromozomu üzerinde reaktif kullanır. Tablo 2 de, aynı amaç için kullanılabilir X ve 3. kromozomlar üzerine stokların bir listesini sağlar. Bu basitleştirilmiş bir protokol progresyonla moleküler temelini anlamak isteyen araştırmacılar bu tekniği kolayca erişilebilir hale getireceğine inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Benign Non-invaziv Tümörlerinde indüksiyon
- Iyi huylu tümörlerin uyarılması için Tablo 2'de listelenen stokları kullanın.
- Aşağıdaki genotip "tester" hisse senedi için bir starter kültür hazırlayın:; Küvet-Gal80, FRT40A, y, ey-FLP1, w Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
- Aşağıdaki genotip "test" hisse senedi için bir starter kültür hazırlayın: w FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo
- "Test" stok "tester" stoktan on kadın ve on erkek bakireler toplayın.
- Sinek gıda ile bir şişede iki yerleştirerek "tester" ve "test" stoktan erkek ve dişileri çapraz.
- 25 ° C inkübatör haç yerleştirin ve erkek ve dişiler çiftleşmek ve 24-48 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin verir.
- Yeterli yumurta birikimi ve birinci değişim safhasındaki larva kültürü kurumasının olmadığından emin varlığı için şişeleri edin.
- Otoklavlanmış bir kaç damla(kültür kuruma ise) nemli tutmak için kültüre damıtılmış su.
- Kültür izlemek ve gerektiğinde adımı 1.7.1 tekrar devam.
- Bölüm 3'te belirtildiği gibi, flöresanlı bir stereomikroskop altında üçüncü instar larvaları dolaşan dikkate alınmalıdır.
2. İnvaziv Tümörlerinde indüksiyon
- Istilacı tümör indüksiyonu için, Tablo 2'de listelenen stokları kullanın.
- Aşağıdaki genotip yukarıdaki adım 1.2 'den starter kültür kullanın:, y ey-FLP1, w, Küvet-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
- LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo, w: Aşağıdaki genotip "test" hisse senedi için bir starter kültür hazırlayın
- "Test" stok "tester" stoktan on kadın ve on erkek bakireler toplayın.
- Sinek f ile bir şişede iki yerleştirerek "tester" ve "test" stoktan erkek ve kadın çaprazood.
- 25 ° C inkübatör haç yerleştirin ve erkek ve dişiler çiftleşmek ve 24-48 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin verir.
- Yeterli yumurta birikimi ve birinci değişim safhasındaki larva kültürü kurumasının olmadığından emin varlığı için şişeleri edin.
- (Kültür kuruma ise) nemli tutmak için kültüre otoklavlanmış damıtılmış su içinde birkaç damla ekleyin.
- Gerektiği gibi kuruluk ve tekrar adım 2.7.1 için kültür izlemeye devam edin.
- Bölüm 3'te belirtildiği gibi, flöresanlı bir stereomikroskop altında üçüncü instar larvaları dikkate alınmalıdır.
3. Benign ve İnvaziv Tümörler Gözlem
- Iyi huylu tümör izolasyon ve görselleştirme için üçüncü larva evresindeki kullanın.
- Damıtılmış su içinde, bir boya fırçası ıslatın ve bu boya fırçası kullanılarak kültür şişe duvarında bir kaç üçüncü instar larvaları kazıyın.
- 1X PBS ile bir depresyon slayt larva yerleştirin ve daha sonra ıslak bir boya fırçası hurdaları kullanaraklarva epidermis herhangi bir gıda maddesini kapalı e.
- Bir Petri plaka içindeki larvaları larva yerleştirin ve hareketsiz hale getirmek için 30 dakika boyunca -20 ° C dondurucuda bırakın.
- FLYNAP kullanarak larva hareketsiz hale getirmek için alternatif bir yöntemdir.
- 3.1.3.2 gelen flakon FLYNAP batırılmış bir FLYNAP değnek yerleştirin ve larvaları ile flakon let takılı şişeyi takıp sonra 30 ila 40 dakika boyunca durmak.
- , Hafif halokarbonlu bir damla yağ ekleyebilirsiniz bir cam kapak ile kapak ve Yeşil Floresan Protein (GFP) görselleştirmek için yeteneği ile bir floresan stereomikroskop altında gözlemlemek, bir cam slayt üzerinde hareketsiz larva yerleştirin.
- Iyi huylu tümör taşıyan larvalar sefalik karmaşık mevcut ön bölgede yeşil floresan olacaktır.
- Invaziv tümörlerin gözlem için yukarıdaki 2. adımda belirlenen kültürünün günü (indüksiyon sonrası) 10 larva seçin. Istilacı tümör taşıyan larva uzatılmış l çünkü gün 10 larva seçilir:genellikle ARVAL sahne ve pupariate başarısız.
- Yerine üçüncü dönem larva kullanımı gün 10 larva hariç 3.1.4 adımlar 3.1.1 izleyin.
- Gün 10 invaziv tümör taşıyan larvalar sefalik karmaşık mevcut ön bölgede yeşil floresan olacaktır.
- Floresan mikroskop dijital bir kamera ile donatılmış ise, o zaman floresanlama benign ve invaziv tümör taşıyan larva fotoğraf çekmek.
4. Benign ve İnvaziv Tümörlerin Cephalic Kompleksi ve ayrıntılı Gözlem Diseksiyon
Larva saydam epidermis zor tümörlerin işgali ölçüde gözlemlemek için yapar. Böylece işgali ölçüde daha iyi larva dışarı sefalik kompleksi diseksiyon tarafından görüntülenmiştir. Aşağıdaki adımlar sefalik kompleksi incelemek için kullanılabilir olmalıdır.
- Islak bir boya fırçası kullanarak f Üçüncü dönem (iyi huylu tümörler için) larvaları ve günü (invaziv tümörlerde) 10 larva seçinilgili kültür şişeleri rom.
- Soğuk 1X PBS içeren bir diseksiyon çanak bir kuyuda larva yerleştirin. Larva epidermis herhangi bir yiyecek artıklarını kazımak için boya fırça kullanın.
- Soğuk 1X PBS içeren diseksiyon çanak taze bir kuyuya temiz larva transferi.
- Floresan tespit etme yeteneğine sahip bir stereomikroskop kullanılarak GFP floresans olmadığını kontrol edin. Non-GFP taşıyan larvaları atın.
- Diseksiyon çanak taze bir kuyuya soğuk 1X PBS 1.0 ml ekleyin ve forseps bir çift kullanarak huylu veya invaziv tümörleri (diseksiyon protokol tümörlerin bu iki tür için aynı kalır) ya taşıyan bir larva transferi.
- Ön ucundan 2/3rds yaklaşık bir çift forseps kullanarak larva basılı tutun.
- Forseps diğer çifti kullanmak ve akıllıca larva posterior 1/3rd ayırmak ve atın.
- Larva ön 2/3rds gidelim. Larva içindeki basınç içeriğini serbest olaraklarva vücut boşluğundan dışarı sızmak olacaktır.
- Gut, vücut yağ ve vücut boşluğundan dışarı oozed olan larva diğer iç içeriğini kaldırmak için forseps bir çift kullanın.
- Larva ağız kancasını tutun ve larva epidermis içine itmek için forseps bir çift kullanın ve tamamen larva ters forseps diğer çifti kullanılarak.
- Nazikçe ve dikkatli vücut yağ, tükürük bezleri, gut, kanat disk kompleksi ve herhangi trakeal tüpleri kaldırmak için forseps kullanın. Cephalic kompleksi ters larva ağız kanca takılı görünür olmalıdır. Beyin hemisfer ve ventral sinir kablosu (VNC) hala VNC çıkan sinirler aracılığıyla larva epidermis bağlı olacaktır.
- Nazikçe sefalik sinirler ve larva epidermis arasındaki bağlantıları kırmak için forseps bir çift kullanın.
- VNC ve larva epidermis arasında sinir bağlantıları kırık ve aşırı vücut yağ ve diğer doku kaldırılır gibi, sefalik işbirliğimplex açıkça görülebilir olacak ve sadece ağız kancalar larva epidermis eklenecektir.
- Karmaşık antikor boyama gibi downstream uygulamalar için veya daha sonra görselleştirme için sabit gerekiyorsa cephalic karmaşık larva epidermis bağlı bırakılabilir.
- Başka bir alt uygulama bundan sonra, yapılan olması halinde, sefalik karmaşık larva epidermisten ayrılır, ve daha fazla analiz için gözlem ve montaj ortamı dayalı bir gliserol bir damla yerleştirilebilir. Montaj ortamı olarak Vectashield kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol bir sonucu olarak, burada sunulan kullanıcı larva göz antennal hayali disk aktifleştirilmiş onkojeni aşırı ifade edenler tarafından iyi huylu tümörler teşvik edebilecektir. Kullanıcı aynı zamanda bir hücre kutup gen için mutant hücre klonları içinde aktive edilmiş bir onkojeni aşırı ifade ile göz antennal disk invaziv tümörler teşvik edebilecektir. Tümörler kolayca bütün larvaları ya da larva vücut boşluğuna (Şekil 1) üzerinden kesilir edilmiştir sefalik kompleksleri "yeşil floresan" doku gibi, flöresanlı bir stereomikroskop yardımıyla gözlemlenebildi. Istilacı tümör ve tümörler VNC ve diğer bitişik organlara GFP pozitif invaziv tümörlerin daha sonra göç büyük aşırı neden olur oysa iyi huylu tümörler, GFP pozitif hücrelerin klonlar olarak göz antennal disk kompleksine lokalize olacaktır. > 10 günlük larvaları GFP pozitif ve müstakil ikincil tümörler (invaziv tümör genotip türetilmiş) floalarva vücut boşluğunda ting da görülebilir. Iyi huylu tümörleri taşıyan larvalar zaman pupariate iken Ayrıca, invaziv tümörleri taşıyan olanlar uzun bir larva dönemi olması ve pupariate başarısız. Bu invaziv tümör taşıyan larvalar kolayca sıvı dolu vücut boşluğu ile "dev larva" olarak gözlenebilir.
Şekil 1. . Sırasıyla huylu ve invaziv tümörlerde Yeşil floresan larva, AB sağ panel:.. Larva huylu tümörler göz antennal lokalize A) sırasıyla huylu veya invaziv tümörleri ya açısı Dissected kefalik kompleksleri Drosophila benign ve İnvaziv tümörler AB paneli bıraktı Bu uyarılmaktadır diski. GFP etiketli doku gibi bitişik organlara göç değil dikkat edinventral sinir kablosu (VNC). Cephalic karmaşık taşıyan invaziv tümörlerde bir günde 10 larva) B. B ile karşılaştırın. Tümör dokusu (yeşil) üremesine ve aynı zamanda VNC ve (kırmızı ok ile gösterilen) tümör dokusu gibi ağız kanca bitişik organları istila edin. Invaziv tümör dokusu ile bitişik organların işgali bir ok ile gösterilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. VNC üzerinden göç ölçüde dayalı invaziv tümörler için bir sınıflandırma düzeni. VNC şematik yeşil renk dolgusu ile tasvir tümör göç ölçüde gösterilir. Ile ilişkili sayısıgöç şiddeti her şematik, yukarıda verilmiştir.
| Kromozom # | Tester gerginlik genotip | Test gerginlik genotip | Referans | |
| İyi huylu tümörler | Invaziv tümörler | |||
| 1 | ey-FLP5, Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP, Küvet-Gal80, FRT19A, w | w, FRT19A, UAS-Ras V12 | DLG m52, FRT19A/FM7C, UAS-Ras V12 | Pagliarini ve Xu, 2003 |
| 2 | y, ey-FLP1, w, Küvet-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP | w FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo | w LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo | Pagliarini ve Xu, 2003 |
| 3 | y, ey-FLP1, w; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP;FRT82B, Küvet-Gal80 | w UAS-Ras V12; FRT82B | w UAS-Ras V12; FRT82B, Scrib 1 / TM6Tb | Pagliarini ve Xu, 2003 |
Tablo 2. Iyi huylu tümörler ve invaziv indüklemek için gereken stoklarının genotip. Tüm stokları belirtilen referansta tarif edilmiştir. Hisse Tian Xu laboratuvar talep edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanser geçmişte çok daha iyi bir anlayış bugün karmaşık bir hastalıktır. Ancak, hala çok öğrendim ve biz altında yatan mekanizmaları tam bir resim var önce açıklanması gerekir. Burada sunulan basit bir protokol mümkün genetik olarak bütün bir organizma içinde iyi huylu ve invaziv tümörleri neden ve bu modelde, tümör ilerlemesi ile ilişkili biyoloji çalışma kolaylaştırır. Drosophila ve diğer organizmalarda mevcut tekniklerin çoğu tümörogenez ve metastazı veya 23-27 yetişkin taşıyıcılara yerleştirildiği primer tümör dokularının nakli kullanan bir sistemi anlamak için bir hücre kültür sistemi kullanmak ya göre. Hücre bazlı ve transplantasyon teknikleri sınırlamaları var hem de. Örneğin, transplantasyon teknik zahmet verici ve zaman alıcı ve konakçıya tümör olmayan doku nakli neden olabilir. Bu deneysel eserler üretilmesine neden olabilir. Bundan başka, hücre külture tabanlı sistemler bütün bir organizma içinde mevcut olan gerçek ortamının sadece yaklaşık değerlerdir. Bu sınırlama, sert tümör büyümesi ve metastazı 34 önemli bir rol oynayan çok önemli bir tümör ve mikro çevre etkileşimi taklit kolaylaştırır. Burada sunulan tekniği başarıyla Drosophila progresyonla genetik ve moleküler temelini araştırmak için çeşitli araştırma grupları tarafından istihdam edilmiştir. Örneğin, bu teknik kullanılarak bu JNK yolunun her iki invaziv tümörlerde yukarı-regüle olan ve aynı zamanda tümörlerin 35,36 arasında ilerlemesi için gerekli olduğu gösterilmiştir. Başka bir çalışmada, tümör ilerlemesinde matris metaloproteaz rolü bu genetik modeli 12,37 gösterilmiştir.
Burada yer alan protokol ile ilgili kritik adım iyi huylu ve istilacı tümör indüksiyonu için kullanılan stoklarının doğru genotipi ile başlar. Bakım sağlamak için alınması gereken buhisse senetleri "yıkarak" değildir. Stokları periyodik sarı varlığı için kontrol edilebilir (y -) stok arıza göstergesi olacağını uçar. Bu MARCM test stok FLP-Out kaset kendiliğinden dışarı çevirdi ve böylece yapıcı Gal4 ifade olacağını işaret eder. Bu tümörler bağlı olarak, aynı zamanda şişelerde 18 ° C 'de çift stokları tutarak önlenebilir, larva ve iyi huylu tümörler için invazif kontrol edilmelidir hangi gün de önemlidir. Iyi huylu tümör taşıyan larvalar vahşi tip larva yakından benzer bir gelişim çizelgesi takip ederken, larva taşıyan invaziv tümörlerde hikaye farklıdır. Invaziv tümör taşıyan larvalar ekran larva genişletilmiş ve bazı pupariate başarısız. Gerçekten de başarısız pupariation karşı pupariation bu özellik için genişletilmiş bir larva Menut et al. 38 ile istilacı tümör bastırma bir ölçüsü olarak kullanılmıştırevre invaziv tümör taşıyan larvaları en iyi sonuçlar için günde 8-10 sonrası indüksiyon etrafında invaziv tümörleri gözlemlemek önemlidir. Bir stereo mikroskop altında kolayca gözlemlenebilir, böylece günde 8-10 yeterli tümör göç VNC üzerinde oldu. Tümör gözlemlenebilirken 10. günde ötesinde, tamamen zor kesilmiş örneklerinde sefalik karmaşık yönlendirmek için yapım VNC yutmak başlar. Bütün larvaları tümörlerin görüntülenmesi ile bağlantılı başka bir kritik adım larvaların hareketsiz yeteneğidir. FlyNap ve düşük sıcaklıklar ikisi de detaylı bir protokol de tarif edilen larva immobilize etmek için kullanılabilir. Parçalara sefalik kompleksleri bir antikor ile boyanmış olması gerekir Son olarak, daha sonra buz üzerine diseksiyon yapılmalıdır kompleksleri ve otuz dakika içinde tespit edilmelidir.
Burada sunulan teknik, tümör ilerlemesinde rol oynadığı düşünülmektedir genlerin katkı anlamak için araştırmacılar tarafından kullanılabilir.Bu genetik modelinde kullanarak bir genin yukarı düzenleme antikor boyama teknikleri ile ya da RT-PCR kullanımı ile in-situ olarak incelenebilir. Bir gen aynı zamanda bir soru veya RNAi reaktifler de gen için mutantlar ile kombinasyon halinde, bu modeli ile tümör ilerlemesi için gerekli olup olmadığını anlamak için çalışabilir. Örneğin, tümör baskılaması için test edilecek olan bir gen için bir RNAi reaktif 3. kromozom üzerinde mevcut olabilir. Bu durumda kromozom 2 için test ve test edilmiş hisse kombinasyonu sadece RNAi 3. kromozom test stok içine geçildi rulman sonra (Tablo 2) kullanılabilir. Bu daha sonra elde edildikten sonra kromozom 2 için test cihazı ve test stok çaprazlanabilir ve istilacı tümör bastırma tahlil edilmiştir. Invaziv tümör fenotip A bastırma invaziv sürecinde bir genin katılımını öneririm. Bununla birlikte, invaziv fenotip bastırılması tamamen nüfuz olmayabilir ve bu nedenledir ki, IVNC üzerinde tümörlerin göç ölçüde (Şekil 2) göre invaziv tümörler için bir sınıflandırma şeması mevcut. Biri kolayca işgali dahil olmak şüphelenilen bir gen nakavt olmuştur invaziv tümörler invaziv tümörleri karşılaştırabilirsiniz bu sınıflandırma düzeni kullanmak. Birkaç sefalik komplekslerinin Analizi invaziv davranış bastırılması ölçüde daha iyi bir fikir verebilir.
Burada yer alan protokol tümör ilerlemesi ile ilgili genlerin etkisinin incelenmesi için, bir ya da iki genin demonte ile bir arada kullanılabilecek olmakla birlikte, en fazla iki genin aynı anda knockdowns elde etmek teknik olarak zor olacaktır. Son olarak, bu tekniğin bir değişiklik hücre kutup genleri mutant olduğu hücrelere karşı aktif onkojeni eksprese eden hücreler yan yana etkilerini anlamak için Wu ve diğ. 39 tarafından kullanılmıştır. Wu tarafından teknik et al. Genetik reaktifler saat seviyesinde bir değişiklik oldutümörlerin görüntülenmesi için sefalik komplekslerin deney kullanılan diseksiyonu owever. Dolayısıyla burada sunulan sefalik kompleksleri incelemek için yöntem Wu ve arkadaşları tarafından sunulan modifiye tekniği kullanmaya çalışıyor bilim adamları için yararlı olabilir. Yanı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ben ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Benim Araştırma laboratuvarında Biyoloji başlangıç fonları WKU Bölümü, WKU Araştırma Vakfı RCAP-I # 11-8032 hibe tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü'nden bir ana hibe ile finanse edilen bir KBRIN-ALAN hibe Sağlık ödül sayısı 5P20GM103436-13 altında. Ben ayrıca, laboratuvar ilk Xu laboratuvarda bu tekniği kurulan bu tekniği ve Dr Raymond Pagliarini tanıtıldı Dr Tian Xu içinde kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. | |||
References
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
- Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
- Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
- Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
- Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
- Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genetics. 154, 695-712 (2000).
- Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetics. 156, 1231-1242 (2000).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
- Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
- Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
- Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
- Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
- Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
- Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genetics. 177, 1667-1677 (2007).
- Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).
