Summary
Die Zusammenarbeit zwischen einer aktivierten Onkogen RAS wie V12 und Mutationen in Genen, die Zellpolarität wie gekritzelt, führen in das Tumorwachstum in Drosophila, wo Tumorzellen invasive Verhalten zeigen auch. Hier wird ein einfaches Protokoll für die Induktion und Beobachtung der benignen und invasiven Tumoren präsentiert.
Abstract
Drosophila hat unser Verständnis der genetischen Grundlagen der normalen Entwicklung und Krankheit in den letzten Jahrzehnten und heute immens zu unserem Verständnis der komplexen Krankheiten beitragen 07.01 geht es weiter beleuchtet. Progression von Tumoren von einem gutartigen zu einem metastatischen Stadium ist ein komplexes Ereignis 8 und hat in Drosophila modelliert worden, um uns helfen, die genetischen Grundlagen der Erkrankung 9 besser zu verstehen. Hier stelle ich ein einfaches Protokoll, genetisch zu induzieren, beobachten und analysieren dann die Progression von Tumoren in Drosophila-Larven. Die Tumorinduktion Technik basiert auf der MARCM System 10 auf und nutzt die Zusammenarbeit zwischen einer aktivierten Onkogen Ras V12 und der Verlust der Zellpolarität Gene (gekritzelt, Scheiben großen und tödlichen Riesen Larven) zu invasiven Tumoren 9 generieren. Ich zeigen, wie diese Tumoren können in der intakten Larven visualisiert unddann, wie diese können zur weiteren Analyse seziert werden. Die vereinfachte Protokoll hier vorge sollte es möglich machen, damit diese Technik durch Forscher interessiert Verständnis der Rolle von einem Gen in Tumorinvasion verwendet werden.
Introduction
Progression von Tumoren von einem gutartigen zu einem metastatischen Stadium ist ein schrittweise Prozess, der durch Hinterziehung von in den Körper 8 vorhandenen Schutzmechanismen gekennzeichnet ist. Zum Beispiel Tumorzellen im Körper muss in der Lage, Apoptose und das Immunsystem zu entgehen, Durchbruch des Fachextrazellulären Matrix (ECM) genannt Basalmembran und der Bewältigung der sozialen Kontrolle durch die umgebenden Zellen 8 unterliegen. Es ist durch eine schrittweise Fortschreiten, dass die Krebszellen die Fähigkeit erwerben, entfernten Stellen in einem Prozess namens Metastasen wandern und zu kolonisieren. Unser Verständnis von, wie die Tumorzellen, die Barrieren durch den Körper auferlegt windet ist immer noch in den Kinderschuhen, aber die Schwellen Bild von der Forschung bisher getan verweist auf eine wiederholte Verwendung von normalen Entwicklungsprozesse und Signalwege von den Krebszellen 11-13.
Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist enorm, unsere und trugerstanding der normalen Entwicklung und Krankheit durch den Einsatz von hoch entwickelten genetischen Techniken in den vergangenen Jahrzehnten 14 bis 17 entwickelt. Mutagenese und Überexpression Instrumente haben wir auf ein besseres Verständnis der verschiedenen Onkogene und Tumorsuppressorgene 18-22 angekommen. , Tumormetastase ist jedoch ein Ergebnis der Zusammenarbeit mehrerer genetischer Läsionen, die hauptsächlich in Zellkulturmodellen 23,24 sowie verschiedene Xenograft-Modellen 25-27 untersucht worden. Diese Modelle aber leistungsstarke haben ihre Grenzen, da sie nicht gänzlich nachvollziehen dürfen die in einem lebenden Organismus gefunden. Außerdem transgenen Modelle in Mäusen sind umständlich und nicht förderlich für die genetische Analyse von invasiven Verhalten 28,29. Mehrere Studien haben versucht, die Invasion von Tumorzellen in Drosophila 30,31 verstehen. Diese Techniken nutzen, vor allem die Transplantation von Primärtumoren, um Hosts und dann auf die Verfolgung der tra verlassennsplanted Tumoren für die Invasion von Nachbargeweben 32,33. Eine leistungsstarke Technik namens MARCM 10 wurde durch Pagliarini und Xu angepasst, um Tumorinvasion in Drosophila 9 modellieren. Dieses elegante genetischen Modellierung der Tumorinvasion nutzte die Zusammenarbeit zwischen einem aktivierten Onkogen und dem Verlust der Zellpolarität. Die Kraft dieser Modellierung besteht darin, dass die invasive Tumoren im intakten Organismus damit umgehen die Notwendigkeit für die Transplantation von Geweben geschaffen. Über die Zusammenarbeit onkogenen bringen, eine aktivierte Onkogen wie Ras V12 in Klonen von Zellen in der larvalen Augenantennenscheibe ausgedrückt. Als Ergebnis der MARCM Technik diese Klone auch mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) zur einfachen Visualisierung markiert und homozygot für Zellpolarität wie letalen Mutanten Riesenlarven, scribbled und Scheiben groß gemacht. Das Ergebnis ist GFP markiert invasiven Tumoren in der Kopf komplex. In diesem Bericht, den ichzeigen, wie man zu induzieren, und visualisieren diese invasiven Tumoren sowohl im Kontext eines intakten Larven und in herauspräpariert Kopf komplex. Die hier präsentierten Tumorinduktion verwendet Reagenzien auf dem zweiten Chromosom von Drosophila. In Tabelle 2 I liefert eine Auflistung von Aktien, die an X und 3. Chromosomen, die für den gleichen Zweck verwendet werden können. Ich glaube, dass diese vereinfachte Protokoll wird diese Technik leicht zugänglich für Forscher, die sich für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Tumorprogression zu machen.
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Protocol
1. Induktion von Gutartige Nicht-invasive Tumoren
- Verwenden Bestände in Tabelle 2 aufgelistet für die Induktion von gutartigen Tumoren.
- Bereiten Sie eine Starterkultur für die "Tester" Lager der folgenden Genotyp: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
- Bereiten Sie eine Starterkultur für die "getestet" Lager der folgenden Genotyp: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / Cyo
- Sammeln Sie zehn weibliche Jungfrauen von der "Tester" Lager und zehn Männer von der "geprüft" Lager.
- Überqueren Sie die Männer und Frauen von der "Tester" und die "getestet" Lager, indem sie sowohl in einem Fläschchen mit Fliegen Essen.
- Legen Sie das Kreuz in einem 25 ° C-Inkubator und lassen die Männchen und Weibchen zu paaren und Eier legen für 24-48 Std.
- Überprüfen Sie die Fläschchen für eine ausreichende Eiablage und auf die Anwesenheit von ersten Larvenstadium sicherzustellen, dass die Kultur nicht austrocknen.
- Fügen Sie ein paar Tropfen autoklaviertdestilliertes Wasser zur Kultur, um es feucht zu halten (wenn die Kultur Austrocknung).
- Weiter, um die Kultur zu überwachen und wiederholen Sie Schritt 1.7.1 nach Bedarf.
- Beachten Sie wandern dritten Larvenstadium unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, wie in Kapitel 3 beschrieben.
2. Induktion von invasiven Tumoren
- Verwenden Bestände in Tabelle 2 aufgelistet für die Induktion von invasiven Tumoren.
- Verwenden Sie die Starterkultur aus Schritt 1.2 der folgenden Genotyp: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
- Bereiten Sie eine Starterkultur für die "getestet" Lager der folgenden Genotyp: w; lgl 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / Cyo
- Sammeln Sie zehn weibliche Jungfrauen von der "Tester" Lager und zehn Männer von der "geprüft" Lager.
- Überqueren Sie die Männer und Frauen von der "Tester" und die "getestet" Lager, indem sie sowohl in einem Fläschchen mit Fliegen food.
- Legen Sie das Kreuz in einem 25 ° C-Inkubator und lassen die Männchen und Weibchen zu paaren und Eier legen für 24-48 Std.
- Überprüfen Sie die Fläschchen für eine ausreichende Eiablage und auf die Anwesenheit von ersten Larvenstadium sicherzustellen, dass die Kultur nicht austrocknen.
- Fügen Sie einige Tropfen autoklaviertem destilliertem Wasser auf die Kultur, um es feucht zu halten (wenn die Kultur Austrocknen).
- Weiter, um die Kultur für Trockenheit und wiederholen Sie Schritt 2.7.1 zu überwachen, wie gebraucht.
- Beachten dritten Larvenstadium unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, wie in Kapitel 3 beschrieben.
3. Beobachtung der benignen und invasiven Tumoren
- Verwenden dritten Larvenstadium der gutartigen Tumor Isolation und Visualisierung.
- Befeuchten Sie einen Pinsel in destilliertem Wasser, und mit diesem Pinsel kratzen ein paar dritten Larvenstadium von der Wand des Kulturfläschchen.
- Zeigen Larven in einer Vertiefung Schlitten mit 1X PBS und dann mit einem nassen Pinsel Schrotte aus alle Lebensmittel Material aus den Larven Epidermis.
- Legen Sie die Larven in einer Petrischale und lassen bei -20 ° C-Gefrierschrank für 30 min, um die Larven zu immobilisieren.
- Alternative Methode, um Larven zu immobilisieren mit FLYNAP.
- Legen Sie einen Zauberstab in der FLYNAP FLYNAP getaucht, um das Fläschchen aus 3.1.3.2 und nach dem Einstecken das Fläschchen gesteckt let Fläschchen mit Larven stehen für 30 bis 40 min.
- Legen Sie die immobilisiert Larve auf einem Glasobjektträger, einen Tropfen Licht Halogenkohlenwasserstofföl, Abdeckung mit einem Deckglas und beobachten unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit der Fähigkeit, Green Fluorescent Protein (GFP) zu visualisieren.
- Die gutartigen Tumor Lager Larven im Frontzahnbereich, wo die Kopf Komplex vorhanden ist grün fluoreszieren.
- Wählen Sie Tag 10 Larven (nach Induktion) aus dem Kultur oben in Schritt 2 zur Beobachtung von invasiven Tumoren gesetzt. Tag 10 Larven werden ausgewählt, weil invasive Tumorlager Larven haben einen erweiterten larval Bühne und in der Regel nicht zu pupariate.
- Folgen Sie den Schritten 3.1.1 bis 3.1.4 außer statt dritten Larvenstadium Verwendung Tag 10 Larven.
- Der Tag 10 invasive Tumorlager Larven im Frontzahnbereich, wo die Kopf Komplex vorhanden ist grün fluoreszieren.
- Wenn die Fluoreszenzmikroskop wird mit einer Digitalkamera ausgestattet, dann nehmen Sie Bilder von der fluoreszierenden gutartigen und invasive Tumorlager Larven.
4. Dissektion der Cephalic Complex und weitere Beobachtung der benignen und invasiven Tumoren
Die durchscheinenden Epidermis der Larve macht es schwierig, das Ausmaß der Invasion von Tumoren zu beobachten. Damit das Ausmaß der Invasion besser durch Zerlegung der komplexen Schädel aus der Larve visualisiert. Die folgenden Schritte sollten genutzt werden, um die komplexen Schädel sezieren.
- Mit einem nassen Pinsel auswählen dritten Larvenstadium (für gutartige Tumoren) und Tag 10 Larven (für invasive Tumoren) fROM Die jeweiligen Kulturfläschchen.
- Zeigen Larven in eine Vertiefung einer Dissektion Kaltschale mit 1X PBS. Verwenden Pinsel abkratzen keine Speisereste aus den Larven Epidermis.
- Übertragen sauber Larven zu einem frischen und der Dissektion Kaltschale mit 1X PBS.
- Prüfen auf das Vorhandensein von GFP-Fluoreszenz mit einem Stereomikroskop zum Aufspüren von Fluoreszenz. Entsorgen nicht-GFP Lager Larven.
- In 1,0 ml kaltem 1X PBS auf eine frische und auf die Zerlegung Gericht und mit einer Pinzette zu übertragen eine Larve tragen entweder die gutartig oder invasiven Tumoren (der Dissektion Protokoll bleibt für diese beiden Arten von Tumoren).
- Halten Sie die Larve nach unten mit einer Pinzette zu 2/3rds vom vorderen Ende.
- Mit der anderen Pinzette und elegant trennen den hinteren 1/3rd der Larve und entsorgen.
- Lassen Sie die vordere 2/3rds der Larve. Da der Druck in der Larve den Inhalt der freiLarve aus der Körperhöhle sickern.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den Darm, Fettkörper und andere Innen Inhalt der Larve, die aus der Körperhöhle sickerte zu entfernen.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den Mund Haken der Larve zu halten und schieben Sie es in den Larven Epidermis und mit der anderen Zange invertieren die Larve vollständig.
- Verwenden Sie die Zange, um sanft und vorsichtig die Fettkörper, der Speicheldrüsen, Darm, die Flügelscheibe komplex und keine Trachealtuben. Die Kopf komplexe sollte jetzt von der Mündung des umgekehrten Hakenlarve befestigt sein. Die Gehirnhälften und das Bauchmark (VNC) wäre immer noch zu den Larven Epidermis durch die Nerven von der VNC ausgeh angeschlossen werden.
- Verwenden Sie eine Pinzette vorsichtig brechen die Verbindungen zwischen den Nerven und den Kopflarven Epidermis.
- Da die Nervenverbindungen zwischen dem VNC und den Larven Epidermis sind gebrochen und überschüssiges Fett und andere Körpergewebe entfernt, die Kopf Complex würde deutlich sichtbar geworden und wird zu den Larven Epidermis nur an den Mundhaken befestigt werden.
- Zu den Larven Epidermis befestigt werden Die Kopf komplexen gelassen werden, wenn die Anlage muss für nachgelagerte Anwendungen wie Antikörperfärbung oder zur späteren Visualisierung fixiert werden.
- Wenn keine weiteren Downstream-Anwendungen würden dann durchgeführt werden, die Kopf Komplex kann von den Larven Epidermis gelöst und in einem Tropfen Glycerin auf Basis einer Montage Medien zur weiteren Beobachtung und Analyse gelegt werden. Verwenden Vectashield als Montage Medien.
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Representative Results
Als ein Ergebnis der hier vorgestellten Protokoll der Benutzer in der Lage, gutartigen Tumoren durch Überexpression eines aktivierten Onkogens im Larven Auge Antennen Imaginalscheibe induzieren. Der Benutzer wird auch in der Lage, invasiven Tumoren am Auge Antennenscheibe durch Überexpression eines aktivierten Onkogens in Klonen von Zellen induzieren auch eine Zellpolarität Gen-Mutante. Die Tumoren können leicht mit Hilfe eines Stereomikroskops, wie fluoreszierende "green fluorescent" Gewebe im ganzen Larven oder in Kopf Komplexe, die aus der Larvenkörperhöhle (1) präpariert wurden, visualisiert werden. Die gutartigen Tumoren am Auge Antennenscheibe komplexer als Klone von GFP-positiven Zellen lokalisiert werden, während die invasiven Tumoren wird in massiver übermäßiges Wachstum von Tumoren und anschließende Migration von GFP-positiven invasiven Tumoren mit dem VNC und anderen angrenzenden Organen führen. In> 10 Tage alten Larven (abgeleitet von der invasiven Tumor Genotyp) GFP-positiven und freistehende Sekundärtumoren floating im Larvenkörperhöhle kann auch beobachtet werden. Darüber hinaus, während die Larven tragen die gutartigen Tumoren pupariate auf Zeit, die, die tragen die invasiven Tumoren haben einen erweiterten Larvenzeit und nicht zu pupariate. Diese invasive Tumorlager Larven könnte leicht als "Riesenlarven" mit einem Fluid gefüllt Körperhöhle beobachtet werden.
Fig. 1 ist. . Gutartige Tumoren und Invasive in Drosophila AB linke Tafel: Grün fluoreszierende Larve mit gutartigen Tumoren und invasiven bzw. AB rechte Fenster. Dissected Kopf Komplexe aus Larven tragen entweder gutartig oder invasive Tumoren bzw. A) Gutartige Tumoren sind für das Auge-anten lokalisiert. Scheibe, wo sie induziert werden. Beachten Sie, dass die GFP-markierten Gewebe nicht um zusammenhängende Organe wie migriertdas Bauchmark (VNC). Vergleichen Sie dies mit B. B) Cephalic komplexe Lager invasive Tumoren, die von einem Tag 10-Larve. Beachten Sie die übermäßiges Wachstum von Tumorgewebe (grün) und auch Invasion von benachbarten Organen wie VNC und Mundhaken vom Tumorgewebe (mit einem roten Pfeil angedeutet). Die Invasion der angrenzenden Organe durch die invasive Tumorgewebe ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
2. Ein Klassifikationsschema für invasive Tumoren, basierend auf dem Ausmaß der Migration über das VNC. Die schematische Darstellung des VNC wird mit dem Ausmaß der Tumor Migration mit grünen Farbfüllung dargestellt gezeigt. Die Nummer mit der damit verbundenenSchwere Migration über jedem Schalt gegeben.
| Chromosom # | Tester-Stamm Genotyp | Getestet Stamm Genotyp | Referenz | |
| Gutartige Tumoren | Invasive Tumoren | |||
| 1 | w, Tub-Gal80, FRT19A; ey-FLP5, Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP | w, FRT19A; UAS-Ras-V12 | dlg m52, FRT19A/FM7C; UAS-Ras-V12 | Pagliarini und Xu, 2003 |
| 2 | y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP | w; FRT40A, UAS-Ras V12 / Cyo | w; lgl 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / Cyo | Pagliarini und Xu, 2003 |
| 3 | y, w, ey-FLP1; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP;FRT82B, Tub-Gal80 | w; UAS-Ras V12; FRT82B | w; UAS-Ras V12; FRT82B, Scrib 1 / TM6Tb | Pagliarini und Xu, 2003 |
Tabelle 2. Der Genotyp der Bestände notwendig, um die gut-und invasiven Tumoren induzieren. Alle Aktien wurden in der angegebenen Referenz beschrieben. Aktien sollten aus dem Labor von Tian Xu angefordert werden.
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Discussion
Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die mit heute ein viel besseres Verständnis als in der Vergangenheit. Allerdings bleibt noch viel zu lernen und erklärt, bevor wir ein vollständiges Bild der zugrunde liegenden Mechanismen werden. Die hier vorgestellten einfaches Protokoll ist es möglich, genetisch induzieren benigne und invasiven Tumoren in einem ganzen Organismus zu untersuchen und dann die Biologie mit der Progression von Tumoren in diesem Modell zugeordnet sind. Die meisten der bestehenden Techniken in Drosophila und anderen Organismen verwenden entweder ein Zellkultursystem basierend auf der Tumorentstehung und Metastasierung oder ein System, das die Transplantation von primären Tumorgeweben 23-27 beschäftigt zu erwachsenen Hosts zu verstehen. Sowohl die Zellbasis und Transplantationstechniken haben ihre Grenzen. Zum Beispiel ist die Transplantationstechnik umständlich und zeitraubend und kann in der Transplantation von Nicht-Tumorgewebe in den Wirt führen. Dies könnte in der Produktion von experimentellen Artefakten führen. Außerdem Zellkulture-basierte Systeme sind nur annähernd der realen Umgebung, die in einem ganzen Organismus vorhanden ist. Diese Einschränkung macht es schwer, die sehr wichtige Tumor-und die Mikro-Umwelt-Interaktion, die eine kritische Rolle bei der Tumorprogression und Metastasierung 34 spielt imitieren. Das hier vorgestellte Verfahren wurde erfolgreich von mehreren Forschungsgruppen verwendet, um die genetische und molekulare Basis der Tumorprogression in Drosophila zu untersuchen. Beispielsweise unter Verwendung dieser Technik wurde gezeigt, dass der JNK-Signalweg ist sowohl in invasiven Tumoren hochreguliert und ist auch für das Fortschreiten von Tumoren 35,36 erforderlich. In einer anderen Studie wurde in diesem genetischen Modell 12,37 die Rolle der Matrix-Metalloprotease der Tumorprogression gezeigt.
Die kritischen Schritte mit dem hier vorgestellten Protokoll verbunden beginnen mit der richtigen Genotyp von Aktien für die Induktion von gutartigen und invasiven Tumoren eingesetzt. Es sollte darauf geachtet werden, dass dieseAktien sind nicht "brechen". Die Aktien können regelmäßig auf das Vorhandensein von Gelb überprüft werden (y -) fliegt das ein Hinweis auf eine Aktien Ausfall hätte. Dies würde darauf hinweisen, dass die FLP-Out-Kassette in der MARCM Tester Lager hat spontan umgedreht und wäre somit konstitutiv exprimieren, werden Gal4. Dies kann durch in Fläschchen und bei 18 ° C zu halten doppelte Bestände Auch, wie die Tumoren induziert werden, verhindert werden kann, ist auch der Tag, an dem die Larven sollten bei gutartigen und invasiven Tumoren überprüft werden kritisch. Während gutartiger Tumor Lager Larven folgen einem Entwicklungszeitleiste, die sehr ähnlich zu Wildtyp-Larven ist, ist die Geschichte mit Larven Lager invasiven Tumoren unterschiedlich. Die invasive Tumorlager Larven Display erweitert Larvenstadium und einige nicht, pupariate. Denn diese Eigenschaft der Puparium Vergleich gescheitert Puparium wurde als Maß für invasive Tumorunterdrückung durch Menut et al. 38. Wegen der längeren Larven genutzt wordenBühne in der invasiven Tumorlager Larven ist es wichtig zu invasiven Tumoren um 8-10 Tage nach Induktion für beste Ergebnisse zu beobachten. An Tag 8-10 genügend Tumor Migration auf der VNC passiert, so dass es leicht zu beobachten ist unter einem Stereomikroskop. Über 10 Tage, während der Tumor beobachtet werden kann, beginnt es vollständig verschlingen die VNC macht es schwierig, die Kopf Komplex in Dissektate orientieren. Ein weiterer wichtiger Schritt bei Visualisierung von Tumoren ganz Larven zugeordnet ist, die Fähigkeit, die Larven zu immobilisieren. Sowohl FlyNap und verringerten Temperaturen verwendet werden, um die Larven zu immobilisieren, wie in der detaillierten Protokoll skizziert. Schließlich, wenn die Kopf seziert Komplexe müssen mit einem Antikörper gefärbt werden dann die Sektionen sollte auf Eis durchgeführt werden und Komplexe sollte innerhalb 30 Minuten behoben werden.
Die hier vorgestellte Technik kann von den Forschern genutzt, um den Beitrag der Gene im Verdacht, eine Rolle bei der Tumorprogression zu spielen verstehen.Mit dieser genetischen Modell bis Regulierung eines Gens kann in situ durch Antikörperfärbung Techniken oder durch den Einsatz von RT-PCR untersucht werden. Man kann auch versuchen, zu verstehen, ob ein Gen, das notwendig ist für die Tumorprogression unter Verwendung dieses Modells in Kombination mit Mutanten des Gens oder RNAi-Reagenzien. Zum Beispiel kann ein Reagens für RNAi eines Gens für Tumorsuppression prüfenden vorliegende am 3. Chromosoms sein könnte. In diesem Fall könnte der Tester und getestet Lager-Kombination für Chromosom 2 verwendet werden (Tabelle 2) erst nach der RNAi Lager 3. Chromosom in die getestet Lager überschritten. Sobald dies erreicht ist, erfolgt der Tester und getestet Lager für Chromosom 2 können überquert werden und die Unterdrückung von invasiven Tumoren untersucht. Eine Unterdrückung der invasiven Tumor-Phänotyp würde Beteiligung eines Gens in der invasiven Verfahren vorschlagen. Jedoch kann die Unterdrückung des invasiven Phänotyps nicht vollständig penetrant, und es ist aus diesem Grund, dass ichstellen ein Klassifikationsschema für invasive Tumore auf Basis des Ausmaßes der Migration der Tumoren über die VNC (Abbildung 2). Unter Verwendung dieses Klassifikationsschema kann man leicht zu invasiven Tumoren, in denen ein Gen im Verdacht, in Invasion beteiligt ist abgerissen worden vergleichen invasiven Tumoren. Analyse von mehreren Schädel Komplexe können einen besseren Einblick in das Ausmaß der Unterdrückung invasive Verhalten zu geben.
Während die hier vorgestellten Protokoll kann in Kombination mit Zuschlags von ein oder zwei Gene, die Gene "-Effekt auf die Tumorprogression zu untersuchen verwendet werden, würde die gleichzeitige Niederschlägen von mehr als zwei Gene, technisch schwierig zu erreichen. Schließlich wurde eine Modifikation dieser Technik, die von Wu et al. 39 verwendet, um die Effekte der Nebeneinander aktivierten Onkogen-exprimierenden Zellen gegenüber Zellen, die Mutante für Zellpolarität Gene zu verstehen. Das Verfahren von Wu et al. War eine Modifikation auf der Ebene der genetischen Reagenzien however das Experiment genutzt Dissektion der Kopf Komplexe für die Visualisierung von Tumoren. So ist die Methode, um Kopf Komplexe hier vorge sezieren könnte auch nützlich für die Wissenschaftler versuchen, die modifizierte Technik von Wu et al nutzen können..
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Disclosures
Ich habe nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Forschung in meinem Labor wird von der WKU Fachbereich Biologie Startfonds, WKU Research Foundation RCAP-I gewähren # 11-8032 und von einem KBRIN-AREA Zuschuss durch einen Elternteil Zuschuss von der National Institute of General Medical Sciences der National Institutes finanziert Gesundheits unter Verleihungsnummer 5P20GM103436-13. Ich möchte auch Dr. Tian Xu in dessen Labor wurde ich in dieser Technik und Dr. Raymond Pagliarini, die diese Technik in der ersten Xu Labor etabliert eingeführt bestätigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. | |||
References
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
- Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
- Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
- Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
- Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
- Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genetics. 154, 695-712 (2000).
- Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetics. 156, 1231-1242 (2000).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
- Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
- Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
- Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
- Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
- Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
- Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genetics. 177, 1667-1677 (2007).
- Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).
