Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En protokoll for Genetic Induksjon og visualisering av godartede og invasive tumorer i Cephalic Komplekser av Published: September 11, 2013 doi: 10.3791/50624

Summary

Samarbeid mellom en aktivert onkogen som RAS V12 og mutasjoner i celle polaritet gener som skriblet, resultere i tumorvekst i Drosophila hvor kreftceller også vise invasive atferd. Her en enkel protokoll for induksjon og observasjon av de godartede og invasive svulster er presentert.

Abstract

Drosophila har belyst vår forståelse av det genetiske grunnlaget for normal utvikling og sykdom de siste tiårene og i dag fortsetter å bidra umåtelig til vår forståelse av komplekse sykdommer 1-7. Progresjon av svulster fra en godartet til en metastatisk staten er en kompleks hendelse 8 og har blitt modellert i Drosophila å hjelpe oss å bedre forstå det genetiske grunnlaget for denne sykdommen ni. Her vil jeg presentere en enkel protokoll til genetisk indusere, observere og deretter analysere utviklingen av svulster i Drosophila larver. Den tumorinduksjon teknikken er basert på det MARCM systemet 10 og utnytter samarbeidet mellom en aktivert onkogen, Ras V12 og tap av celle polaritet gener (scribbled, plater store og dødelig gigantiske larver) til å generere invasive tumorer 9. Jeg viser hvordan disse svulstene kan visualiseres i intakt larver ogderetter hvordan disse kan bli dissekert ut for videre analyse. Det forenklede protokoll som presenteres her bør gjøre det mulig for denne teknikken for å bli utnyttet av etterforskerne som er interessert i å forstå rollen av et gen i tumor invasjon.

Introduction

Progresjon av svulster fra en godartet til en metastatisk stat er et skritt klok prosess som er preget av unndragelse av beskyttende mekanismer i kroppen åtte. For eksempel kreftceller i kroppen må være i stand til å unngå apoptose og immunsystemet, gjennombrudd spesialisert ekstracellulære matrix (ECM) som heter Basement Membrane, og overvinne eventuelle sosiale kontroller pålagt av de omkringliggende cellene åtte. Det er gjennom et skritt klok progresjon at kreftcellene tilegne seg evnen til å migrere og kolonisere fjerne områder i en prosess som kalles metastasering. Vår forståelse av hvordan svulsten cellen overvinner barrierer pålagt av kroppen er fortsatt i sin spede begynnelse, men den nye bildet fra forskning gjort hittil poeng til en gjentatt bruk av normale utviklingsprosesser og signalveier ved kreftcellene 11-13.

Frukten fly Drosophila melanogaster har bidratt enormt til vår understanding av normal utvikling og sykdom gjennom bruk av avanserte genetiske teknikker utviklet i løpet av de siste tiårene 14-17. Bruke mutagenese og høyekspresjonsystemer verktøy vi har kommet frem til en bedre forståelse av ulike onkogener og tumor suppressor gener 18-22. Men, er tumor metastase et resultat av samarbeid mellom flere genetiske lesjoner som har hovedsakelig blitt undersøkt i cellekultur modeller 23,24 samt ulike xenograft modeller 25-27. Disse modellene skjønt kraftig har sine begrensninger som de ikke etterligne helt de forholdene som finnes i en levende organisme. Videre transgene modeller tilgjengelig i mus er tungvint og ikke bidrar til genetisk analyse av invasiv atferd 28,29. Flere studier har forsøkt å forstå invasjon av tumorceller i Drosophila 30,31. Disse teknikkene primært utnytte transplantasjon av primære svulster til vertene, og deretter stole på sporing av transplanted svulster for invasjonen av nabo vev 32,33. En kraftig teknikk som kalles MARCM 10 ble tilpasset av PAGLIARINI og Xu å modellere tumor invasjon i Drosophila ni. Denne elegante genetisk modellering av tumor invasjon utnyttet samarbeidet mellom en aktivert onkogen og tap av celle polaritet. Kraften av denne modelleringen ligger i det faktum at de invasive tumorer er skapt i et intakt organisme og dermed omgå behovet for transplantasjon av vev. For å få til den onkogene samarbeid, er et aktivert onkogen som Ras V12 uttrykt i kloner av celler i larve øye-antennal plate. Som et resultat av den MARCM teknikken disse kloner er også merket med grønt fluorescerende protein (GFP) for enkel visualisering og er laget homozygote for celle polaritet mutanter som dødelig giant larver, scribbled, og store plater. Resultatet er GFP merket invasive tumorer i cephalic kompleks. I denne rapporten jegvise hvordan å indusere, og visualisere disse invasive tumorer både i sammenheng med en intakt larver og dissekert ut cephalica kompleks. Den tumorinduksjon som presenteres her benytter reagenser på den andre kromosomet til Drosophila. I tabell 2, I gir en oversikt over aksjer på X og 3. kromosomer som kan utnyttes for samme formål. Jeg tror at denne forenklede protokollen vil gjøre denne teknikken lett tilgjengelig for forskere interessert i å forstå det molekylære grunnlaget for tumorprogresjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Induksjon av Benign Ikke-invasive svulster

  1. Bruk bestander som er oppført i tabell 2 for induksjon av godartede svulster.
  2. Forbered en startkultur for den "tester" lager av følgende genotype: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
  3. Forbered en startkultur for den "testet" lager av følgende genotype: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO
  4. Samle ti kvinnelige jomfruer fra "tester" lager og ti menn fra "testet" lager.
  5. Kryss hanner og hunner fra "tester" og "testet" lager ved å plassere dem begge i et hetteglass med flue mat.
  6. Sett kryss i en 25 ° C inkubator og la hanner og hunner å pare seg og legge egg i 24-48 timer.
  7. Sjekk ampullene for tilstrekkelig egg deponering og for tilstedeværelsen av første stadiums larver å sørge for at kulturen ikke tørker ut.
    1. Tilsett noen dråper autoklaveresdestillert vann til kulturen for å holde det fuktig (hvis kulturen er å tørke ut).
    2. Fortsett å overvåke kultur og gjenta trinn 1.7.1 etter behov.
  8. Observer vandrende tredje stadiums larver under en fluorescens stereo som skissert i § 3.

2. Induksjon av invasive tumorer

  1. Bruk bestander som er oppført i tabell 2 for induksjon av invasive tumorer.
  2. Bruk startkultur fra trinn 1.2 av følgende genotype: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
  3. Forbered en startkultur for den "testet" lager av følgende genotype: w, LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO
  4. Samle ti kvinnelige jomfruer fra "tester" lager og ti menn fra "testet" lager.
  5. Kryss hanner og hunner fra "tester" og "testet" lager ved å plassere dem begge i et hetteglass med flue food.
  6. Sett kryss i en 25 ° C inkubator og la hanner og hunner å pare seg og legge egg i 24-48 timer.
  7. Sjekk ampullene for tilstrekkelig egg deponering og for tilstedeværelsen av første stadiums larver å sørge for at kulturen ikke tørker ut.
    1. Tilsett noen dråper autoklavert destillert vann til kulturen for å holde det fuktig (hvis kulturen er å tørke ut).
    2. Fortsett å overvåke kultur for tørrhet og gjentar trinn 2.7.1 som trengs.
  8. Observer tredje stadiums larver under en fluorescens stereo som skissert i § 3.

Tre. Observasjon av godartede og invasive tumorer

  1. Bruk tredje stadiums larver for godartet svulst isolasjon og visualisering.
    1. Fukt en pensel i destillert vann, og ved hjelp av denne pensel skrape noen tredje instar-larver fra veggen av ampullen kultur.
    2. Plasser larver i en depresjon lysbilde med 1X PBS og deretter med en våt pensel skrape av noe mat materiale fra larvehuden.
    3. Plasser larver i en Petri-plate og la ved -20 ° C fryser i 30 minutter for å immobilisere larven.
      1. Alternativ metode for å immobilisere larver ved hjelp FLYNAP.
      2. Plasser en FLYNAP wand dyppet i FLYNAP til hetteglasset fra 3.1.3.2 og etter å plugge hetteglasset la plugget hetteglass med larver stå for 30 til 40 min.
    4. Plasser immobilisert larve på et glass lysbilde, tilsett en dråpe lys halokarbon olje, dekk med et dekkglass og observere under en fluorescens stereo med evne til å visualisere grønt fluorescerende protein (GFP).
    5. Den godartet svulst bærende larver vil fluoresce grønt i fremre regionen hvor cephalic komplekset er til stede.
  2. Velg dag 10 larver (etter induksjon) fra kulturen satt i trinn 2 ovenfor for observasjon av invasive svulster. Dag 10 larver er valgt fordi invasiv svulst bærende larver har en utvidet lArval scenen og generelt klarer å pupariate.
  3. Følg trinn 3.1.1 til 3.1.4, unntatt i stedet for tredje stadiums larver bruk dag 10 larver.
    1. Dagen 10 invasiv svulst bærende larver vil fluoresce grønt i fremre regionen hvor cephalic komplekset er til stede.
  4. Hvis den fluorescerende mikroskop er utstyrt med et digitalt kamera og ta bilder av den fluorescerende godartet og invasiv svulst bærende larver.

4. Disseksjon av Cephalic Complex og videre observasjon av godartede og invasive tumorer

Den gjennomskinnelige epidermis av larven gjør det vanskelig å observere graden av invasjonen av tumorer. Således omfanget av invasjonen er bedre visualisert ved å dissekere cephalica kompleks av larven. Følgende tiltak bør utnyttes til å dissekere cephalic kompleks.

  1. Ved hjelp av en våt pensel velger tredje stadiums larver (for godartede svulster) og dag 10 larver (for invasive svulster) fROM de respektive kultur ampuller.
  2. Plasser larver i en brønn i en disseksjon skål med kaldt 1X PBS. Bruk pensel til å skrape av eventuelle matrester fra larvehuden.
    1. Overfør ren larver til en frisk kilde med disseksjon Skål inneholdende kald 1X PBS.
    2. Sjekk for tilstedeværelse av GFP fluorescens ved hjelp av en stereo stand til å oppdage fluorescens. Kast ikke-GFP bærende larver.
  3. Legg 1,0 ml av kald 1X PBS til en fersk godt på disseksjon fatet og ved hjelp av en pinsett overføre en larve peiling enten godartede eller invasive svulster (disseksjon protokollen forblir den samme for disse to typer svulster).
  4. Hold larven ned ved hjelp av en pinsett ca 2/3-deler fra den fremre enden.
    1. Bruk den andre pinsett og smart skille posterior 1/3rd av larven og kast den.
    2. La gå av fremre 2/3-deler av larven. Ettersom trykket inne i larven slippes innholdet ilarve vil sive ut av kroppshulen.
    3. Bruk en pinsett for å fjerne tarmen, fett kroppen og andre indre innholdet i larven som har sivet ut av kroppshulen.
    4. Bruk en pinsett til å holde munnen krok av larven og skyv den inn i larvehuden og bruke den andre pinsett invertere larven helt.
    5. Bruk pinsett til forsiktig og nøye fjerne fettet kroppen, spyttkjertlene, gut, vingen plate kompleks og eventuelle trakealtubers. Den cephalica komplekset skal nå vises festet til munningen kroken på den inverterte larve. De hjernehalvdelene og ventrale nerve ledningen (VNC) vil fortsatt være koblet til larvehuden gjennom nerver som kommer fra VNC.
    6. Bruk en pinsett til å forsiktig bryte forbindelsene mellom cephalica nerver og larvehuden.
    7. Som de nerveforbindelsene mellom VNC og larvehuden er brutt og overflødig fett kroppen og annet vev fjernet, cephalic complex vil bli godt synlig og vil være knyttet til de larvehuden bare ved munningen kroker.
    8. Den cephalic kompleks kan stå festet til larvehuden hvis komplekset må fikses for nedstrøms programmer som antistoffarging eller for senere visualisering.
    9. Hvis ingen ytterligere nedstrøms applikasjoner vil bli utført så cephalic kompleks kan være løsrevet fra larvehuden og plassert i en dråpe av en glyserol basert montering media for videre observasjon og analyse. Bruk VECTASHIELD som festemateriale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et resultat av den protokoll som presenteres her vil brukeren være i stand til å indusere godartede svulster ved overekspresjon av en aktivert onkogen i larvenes øyet antennal imaginal plate. Brukeren vil også være i stand til å indusere invasive tumorer i øynene antennal platen ved overekspresjon av en aktivert onkogen i kloner av celler også mutant for en celle polaritet genet. Tumorene kan lett visualiseres ved hjelp av en fluorescerende stereomikroskop som "grønne fluorescerende" vev i hele larver eller cephalica komplekser som er blitt dissekert ut av larvekroppshulrom (figur 1). De godartede svulster vil bli lokalisert til øyet antennal plate kompleks som kloner av GFP positive celler mens de invasive svulster vil resultere i massiv overvekst av svulster og påfølgende migrasjon av GFP positive invasive svulster til VNC og andre tilstøtende organer. I> 10 dagers gamle larver (avledet fra invasiv svulst genotype) GFP positive og frittliggende sekundære svulster Floating i larve kroppens hulrom kan også observeres. Videre, mens larvene bærer godartede svulster pupariate på gang, de som bærer de invasive svulster har en lengre larve periode og ikke klarer å pupariate. Disse invasiv svulst bærende larver kan lett observeres som "giant larver" med en væske fylt kroppens hulrom.

Figur 1
Figur 1. . Godartede og Invasive svulster i Drosophila AB venstre panel: Grønn fluorescerende larve med godartede og invasive svulster, henholdsvis AB høyre panelet:. Dissekert cephalica komplekser fra larver peiling enten godartede eller invasive svulster henholdsvis A) Godartede svulster er lokalisert til øye-antennal. plate hvor de blir indusert. Legg merke til at GFP merket vev ikke har migrert til sammenhengende organer somventrale nerve ledningen (VNC). Sammenlign dette med B. B) Cephalic komplekse bærende invasive svulster fra en dag 10 larve. Legg merke til overvekst av svulstvev (grønn) og også invasjon av sammenhengende organer som VNC og munn kroker av svulstvevet (angitt med en rød pil). Invasjonen av de sammenhengende organer ved invasiv svulstvev er indikert med en pil. Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. En klassifisering ordning for invasive svulster basert på omfanget av migrasjon over VNC. Den skjematisk på VNC er vist med den grad av tumor migrering avbildet med grønn farge fyll. Tallet assosiert medalvorlighetsgraden av migrasjon er gitt over hver skjematisk.

Kromosom # Tester belastning genotype Testet belastning genotype Referanse
Godartede svulster Invasive svulster
1 w, Tub-Gal80, FRT19A; ey-FLP5, Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP w, FRT19A; UAS-Ras V12 DLG M52, FRT19A/FM7C; UAS-Ras V12 PAGLIARINI og Xu, 2003
2 y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP w, FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO w, LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO PAGLIARINI og Xu, 2003
3 y, w, ey-FLP1; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP;FRT82B, Tub-Gal80 w, UAS-Ras V12; FRT82B w, UAS-Ras V12; FRT82B, SCRIB 1 / TM6Tb PAGLIARINI og Xu, 2003

Tabell 2. Genotypen av bestanden som trengs for å fremkalle de godartede og invasive tumorer. Alle stammer er beskrevet i referansen angitt. Aksjer bør bli bedt om fra laboratoriet for Tian Xu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kreft er en kompleks sykdom med en mye bedre forståelse i dag enn tidligere. Men trenger mye fortsatt må læres og forklares før vi har et komplett bilde av de underliggende mekanismene. Den enkel protokoll er presentert her gjør det mulig å genetisk indusere godartede og invasive tumorer i en hel organisme og deretter studerer biologien i forbindelse med utviklingen av svulster i denne modellen. De fleste av de eksisterende teknikker i Drosophila og andre organismer enten bruke en cellekultur basert system for å forstå tumorigenesis og metastasering eller et system som benytter transplantasjon av primær tumor vev i voksen vertene 23-27. Både cellebasert og transplantasjon teknikker har sine begrensninger. For eksempel er transplantasjon teknikk tungvint og tidskrevende og kan føre til transplantering av ikke-tumorvev i verten. Dette kan resultere i produksjon av eksperimentelle artefakter. Videre celle kulture-baserte systemer er bare omtrentlige av den virkelige miljøet som eksisterer i en hel organisme. Denne begrensningen gjør det vanskelig å etterligne svært viktig svulsten og mikro-miljø interaksjon som spiller en avgjørende rolle i tumor progresjon og metastase 34. Teknikken som presenteres her har blitt ansatt av flere forskningsgrupper for å undersøke den genetiske og molekylære grunnlaget for tumorprogresjon hos Drosophila. For eksempel, ved å benytte denne teknikken ble det demonstrert at JNK veien er både oppregulert i invasive tumorer, og er også nødvendig for utviklingen av tumorer 35,36. I en annen studie rollen matriksmetalloprotease i tumorprogresjon ble demonstrert i denne genetiske modellen 12,37.

De kritiske trinn knyttet til protokoll som presenteres her begynne med riktig genotype av aksjer som brukes for induksjon av godartede og invasive svulster. Forsiktighet bør utvises for å sikre at dissebestandene er ikke "bryte ned". Lagrene kan være periodisk sjekket for tilstedeværelse av gul (y -) fluer som ville være en indikasjon på en lagersvikt. Dette skulle tilsi at FLP-Out kassett i MARCM tester aksjen har spontant venda ut og ville dermed være å uttrykke Gal4 constitutively. Dette kan forhindres ved å holde like lagre i ampuller, og ved 18 ° C. Også, som tumorer ble indusert, er den dag da larvene bør kontrolleres for godartede og invasive tumorer også kritisk. Mens godartet svulst bærende larver følge en utviklings tidslinje som er nært lik vill type larver, er historien med larver bærende invasive svulster annerledes. Den invasive tumorbærende larver skjerm utvidet larvestadiet, og noen klarer å pupariate. Faktisk er denne egenskap ved pupariation versus feilet pupariation har blitt benyttet som et mål for invasiv tumor suppresjon av Menut et al. 38. På grunn av den forlengede larvestadium i invasiv svulst bærende larver er det viktig å observere invasive svulster rundt dag 8-10 etter induksjon for best resultat. På dag 8-10 nok svulst migrasjon har skjedd på VNC slik at det er lett observer under en stereo mikroskop. Utover dagen 10, mens svulsten kan observeres, begynner det å helt sluke VNC gjør det vanskelig å orientere cephalic kompleks i dissekert prøver. Et annet kritisk punkt forbundet med visualisering av tumorer i hele larver er evnen til å immobilisere den larver. Både FlyNap og lavere temperaturer kan benyttes for å immobilisere larvene som beskrevet i den detaljerte protokollen. Til slutt, dersom dissekert cephalica komplekser må være farget med et antistoff deretter dissections bør utføres på is og komplekser bør være løst i løpet av tretti minutter.

Teknikken som er presentert her kan utnyttes av forskere for å forstå bidraget av gener som mistenkes for å spille en rolle ved tumorprogresjon.Ved hjelp av denne genetiske modellen et gen som er opp regulering kan studeres in situ ved antistofffargeteknikker eller ved hjelp av RT-PCR. Man kan også forsøke å forstå om et gen som er nødvendig for tumorprogresjon ved å benytte denne modellen i kombinasjon med mutanter for genet det er snakk om, eller RNAi reagenser. For eksempel kan en RNAi-reagens for et gen som skal testes for tumor suppresjon være tilstede på 3 rd-kromosomet. I dette tilfelle testeren og testes lagerkombinasjon for kromosom 2 kunne brukes (tabell 2) kun etter at RNAi bærende 3. kromosomet er blitt krysset inn i den testede lager. Når dette er oppnådd, og testeren og testet lager for kromosom 2 kan krysses og undertrykkelse av invasive tumorer analysert. En undertrykkelse av invasive tumor fenotype ville foreslå et gen engasjement i invasiv prosess. Imidlertid kan undertrykkelse av invasive fenotype ikke være helt penetrant, og det er av denne grunn at jegpresentere en klassifiseringsordning for invasive tumorer basert på omfanget av migrering av svulstene over VNC (figur 2). Utnytte denne klassifiseringen ordningen kan man enkelt sammenligne invasive svulster til invasive svulster der et gen mistenkt for å være involvert i invasjonen har blitt slått ned. Analyse av flere cephalica komplekser kan gi en bedre innsikt i omfanget av invasiv atferd undertrykkelse.

Mens protokoll er presentert her kan benyttes i kombinasjon med knockdown av en eller to gener for å studere genene 'virkning på tumorprogresjon, ville samtidige knock-out-av mer enn to gener være teknisk vanskelig å oppnå. Til slutt, ble en modifikasjon av denne teknikk benyttes av Wu et al. 39. å forstå virkningene av å sidestille aktivert onkogen som uttrykker celler mot celler som var mutant i cellen polaritet gener. Teknikken av Wu et al. Var en modifikasjon i graden av genetiske reagenser however eksperimentet benyttet disseksjon av cephalica komplekser for visualisering av tumorer. Således ville metoden for å dissekere cephalica komplekser som presenteres her, kan være nyttig for forskere som prøver å benytte den modifiserte teknikk som presenteres av Wu et al. Også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jeg har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning i laboratoriet mitt er støttet av WKU Institutt for Biologi oppstart midler, WKU Research Foundation RCAP-Jeg gir # 11-8032 og etter en KBRIN-AREAL stipend finansiert gjennom en forelder stipend fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes Helse henhold award nummer 5P20GM103436-13. Jeg ønsker også å erkjenne Dr. Tian Xu i hvis laboratorium Jeg ble introdusert til denne teknikken og Dr. Raymond PAGLIARINI som først etablert denne teknikken i Xu laboratoriet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution Invitrogen, Sigma Aldrich Make fresh and refrigerate, can be used up to a week
Flynap Carolina Biologicals Fly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde Needed to fix the dissected cephalic complex
Ice Bucket Several Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tube Various
Glass slides, cover glass Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting media Vector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 Oil Polysciences Inc. or Halocarbon.com Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish Can be found at any general merchandise store Needed to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope Leica and others Needed to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forceps Fine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish Sigma Aldrich
Paint Brush Can be found at any general merchandise store
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
  2. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  3. Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
  4. Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
  5. Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
  6. Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
  7. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  8. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  9. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
  11. Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
  12. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
  13. Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
  14. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  15. Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
  16. Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
  17. Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
  18. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
  19. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
  20. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
  21. Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genetics. 154, 695-712 (2000).
  22. Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetics. 156, 1231-1242 (2000).
  23. Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
  24. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
  25. Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
  26. Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
  27. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  28. McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
  29. Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
  30. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
  31. Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
  32. Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
  33. Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
  34. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  35. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
  36. Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
  37. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
  38. Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genetics. 177, 1667-1677 (2007).
  39. Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).

Tags

Medisin Imaginal plater Drosophila melanogaster Svulst metastaser Drosophila Invasive svulster godartede svulster Cephalic Complex Mosaic Analyse med et Repressible Cell Marker teknikk
En protokoll for Genetic Induksjon og visualisering av godartede og invasive tumorer i Cephalic Komplekser av<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, A. A Protocol forMore

Srivastava, A. A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (79), e50624, doi:10.3791/50624 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter