Summary
La cooperazione tra l'oncogene attivato, come RAS V12 e le mutazioni nei geni della polarità cellulare come scarabocchiato, causare la crescita del tumore in Drosophila in cui le cellule tumorali mostrano anche comportamenti invasivi. Qui un semplice protocollo per l'induzione e l'osservazione dei tumori benigni e invasivi è presentato.
Abstract
Drosophila ha illuminato la nostra comprensione della base genetica dello sviluppo normale e malattia negli ultimi decenni e oggi si continua a contribuire enormemente alla nostra comprensione di malattie complesse 1-7. Progressione dei tumori da un benigno ad uno stato metastatico è un evento complesso 8 ed è stato modellato in Drosophila per aiutarci a capire meglio la base genetica di questa malattia 9. Qui vi presento un semplice protocollo per indurre geneticamente, osservare e quindi analizzare la progressione dei tumori in Drosophila larve. La tecnica di induzione tumorale si basa sul sistema marcm 10 e sfrutta la cooperazione tra un oncogene attivato, Ras V12 e perdita di geni polarità cellulare (intima, dischi grandi e letale larve gigante) per generare tumori invasivi 9. I dimostrare come questi tumori possono essere visualizzati nelle larve intatto epoi come queste possono essere sezionati per ulteriori analisi. Il protocollo semplificato qui presentato dovrebbe consentire di questa tecnica per essere utilizzato da ricercatori interessati a comprendere il ruolo di un gene in invasione tumorale.
Introduction
Progressione dei tumori da un benigno ad uno stato metastatico è un processo passo saggio che si caratterizza per l'evasione di meccanismi protettivi presenti nel corpo 8. Per esempio le cellule tumorali nel corpo deve essere in grado di eludere l'apoptosi e il sistema immunitario, sfondamento della matrice extracellulare specializzata (ECM) chiamato membrana basale, e superare eventuali controlli sociali imposti dalle cellule circostanti 8. E 'attraverso un saggio passo progressione che le cellule tumorali acquisiscono la capacità di migrare e colonizzare siti distanti in un processo chiamato metastasi. La nostra comprensione di come la cellula tumorale supera le barriere imposte dal corpo è ancora nella sua infanzia, tuttavia, il quadro che emerge dalla ricerca effettuata punti sinora per un uso ripetuto di processi di sviluppo normali e vie di segnalazione da parte delle cellule tumorali 11-13.
La mosca della frutta Drosophila melanogaster ha contribuito enormemente alla nostra understanding del normale sviluppo e della malattia attraverso l'uso di sofisticate tecniche genetiche sviluppate nel corso degli ultimi decenni 14-17. Utilizzo di mutagenesi e gli strumenti iperespressione siamo arrivati ad una migliore comprensione dei diversi oncogeni e geni oncosoppressori 18-22. Tuttavia, la metastasi del tumore è il risultato della cooperazione tra diverse lesioni genetiche che è stato studiato principalmente in modelli di coltura cellulare 23,24 così come i vari modelli di xenotrapianto 25-27. Questi modelli però potente presentano dei limiti per quanto non simulare perfettamente le condizioni trovate in un organismo vivente. Inoltre, i modelli transgenici disponibili nei topi sono ingombranti e non favorevole alla analisi genetica del comportamento invasivo 28,29. Diversi studi hanno cercato di capire invasione delle cellule tumorali in Drosophila 30,31. Queste tecniche utilizzano principalmente trapianto di tumori primari agli host e poi si basano sul monitoraggio del TRAI tumori nsplanted per l'invasione dei tessuti circostanti 32,33. Una tecnica potente chiamato marcm 10 è stato adattato da Pagliarini e Xu modellare l'invasione del tumore in Drosophila 9. Questa elegante modellazione genetica di invasione tumorale sfruttata la cooperazione tra un oncogene attivato e la perdita della polarità cellulare. La potenza di questa modellazione sta nel fatto che i tumori invasivi sono creati in un organismo intatto eludendo così la necessità di trapianti di tessuti. Per realizzare la cooperazione oncogeno, un oncogene attivato come Ras V12 è espresso in cloni di cellule nel disco occhio-antenne larvale. Come risultato della tecnica marcm questi cloni sono contrassegnati con proteina fluorescente verde (GFP) per una facile visualizzazione e sono fatti mutanti omozigoti per polarità cellulare come letale larve gigante, intima, e dischi grandi. Il risultato è GFP etichettato tumori invasivi nella complesso cefalica. In questa relazione hodimostrare come indurre, e visualizzare questi tumori invasivi sia nel contesto di un larve intatta e sezionato fuori complesso cefalica. L'induzione del tumore qui presentato utilizza reagenti sul secondo cromosoma di Drosophila. Nella Tabella 2, fornisco una lista di titoli su X e 3 ° cromosomi che possono essere utilizzati per lo stesso scopo. Credo che questo protocollo semplificato renderà questa tecnica facilmente accessibile ai ricercatori interessati a comprendere le basi molecolari della progressione tumorale.
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Protocol
1. L'induzione di tumori benigni non invasivi
- Utilizzare titoli elencati nella tabella 2 per l'induzione di tumori benigni.
- Preparare una coltura starter per lo stock "tester" del seguente genotipo: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> GAL4, UAS-GFP
- Preparare una coltura starter per lo stock "testata" del seguente genotipo: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO
- Raccogliere dieci vergini femminile dal titolo "tester" e dieci maschi dalla "testata" magazzino.
- Attraversare i maschi e le femmine del "tester" e "controllati" magazzino inserendoli entrambi in un flaconcino con la mosca cibo.
- Mettere la croce in un incubatore a 25 ° C e permettono ai maschi e femmine si accoppiano e depongono le uova per 24-48 ore.
- Controllare le fiale per sufficiente la deposizione delle uova e per la presenza di larve di prima instar fare in modo che la cultura non si asciuga fuori.
- Aggiungere qualche goccia di autoclaveacqua distillata alla cultura per mantenerlo umido (se la cultura sta asciugando out).
- Continuare a monitorare la cultura e ripetere il punto 1.7.1, se necessario.
- Osservare errante terzo instar larve allo stereomicroscopio a fluorescenza, come indicato nella sezione 3.
2. L'induzione di tumori invasivi
- Utilizzare titoli elencati nella tabella 2 per l'induzione di tumori invasivi.
- Utilizzare la coltura starter dal punto 1.2 del seguente genotipo: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> GAL4, UAS-GFP
- Preparare una coltura starter per lo stock "testata" del seguente genotipo: w; LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO
- Raccogliere dieci vergini femminile dal titolo "tester" e dieci maschi dalla "testata" magazzino.
- Attraversare i maschi e le femmine del "tester" e "controllati" magazzino inserendoli entrambi in un flaconcino con la mosca food.
- Mettere la croce in un incubatore a 25 ° C e permettono ai maschi e femmine si accoppiano e depongono le uova per 24-48 ore.
- Controllare le fiale per sufficiente la deposizione delle uova e per la presenza di larve di prima instar fare in modo che la cultura non si asciuga fuori.
- Aggiungere qualche goccia di acqua distillata autoclavato alla cultura per mantenerlo umido (se la cultura sta asciugando out).
- Continuare a monitorare la cultura per la secchezza e ripetere il punto 2.7.1, se necessario.
- Osservare terzo instar larve allo stereomicroscopio a fluorescenza, come indicato nella sezione 3.
3. L'osservazione di tumori benigni e invasive
- Utilizzare terzo instar larve per l'isolamento tumore benigno e visualizzazione.
- Bagnare un pennello in acqua distillata, e utilizzando questo pennello raschiare alcune larve al terzo stadio dalla parete del flaconcino cultura.
- Mettere larve in una diapositiva depressione con PBS 1X e poi con un pennello bagnato rottamiposta fuori qualsiasi materiale alimentare dall'epidermide larvali.
- Porre le larve in una piastra Petri e lasciare a -20 ° C per 30 min freezer per immobilizzare la larva.
- Metodo alternativo per immobilizzare le larve utilizzando FLYNAP.
- Posizionare una bacchetta FLYNAP immersa nel FLYNAP al flaconcino da 3.1.3.2 e dopo aver collegato il let flaconcino flaconcino collegato con larve riposare per 30-40 minuti.
- Posizionare la larva immobilizzato su un vetrino, aggiungere una goccia di olio halocarbon luce, coprire con un vetro di copertura e osservare allo stereomicroscopio a fluorescenza con la capacità di visualizzare Green Fluorescent Protein (GFP).
- Il tumore benigno cuscinetto larve fluorescenza verde nella regione anteriore dove il complesso cefalica è presente.
- Selezionare il giorno 10 larve (dopo induzione), dalla cultura impostato al punto # 2 per l'osservazione dei tumori invasivi. Giorno 10 larve sono selezionati perché le larve cuscinetto tumore invasivo hanno un l prolungatofase Arval e generalmente non riescono a pupariate.
- Seguire i passaggi da 3.1.1 a 3.1.4 tranne che invece di terzo instar uso larve giorno 10 larve.
- Il giorno 10 cuscinetto tumore invasivo larve fluorescenza verde nella regione anteriore dove il complesso cefalica è presente.
- Se il microscopio fluorescente è dotato di una fotocamera digitale poi fotografare la fluorescenza larve benigno e tumore invasivo cuscinetto.
4. La dissezione della osservazione cefalico Complex e ulteriore di tumori benigni e invasive
L'epidermide traslucide del larva rende difficile osservare il grado di invasione di tumori. Così l'estensione dell'invasione è meglio visualizzata sezionando il complesso cefalica fuori della larva. I seguenti passaggi devono essere utilizzati per sezionare il complesso cefalica.
- Utilizzando un pennello bagnato per selezionare le larve terzo instar (per i tumori benigni) e il giorno 10 larve (per i tumori invasivi) fROM rispettivi flaconi di coltura.
- Mettere larve in un pozzo di un piatto contenente dissezione a freddo PBS 1X. Usa il pennello per togliere eventuali residui di cibo dai epidermide larvali.
- Trasferimento larve pulito per un nuovo bene del piatto dissezione contenente freddo PBS 1X.
- Verificare la presenza di GFP fluorescenza utilizzando uno stereomicroscopio in grado di rilevare la fluorescenza. Scartare non-GFP larve cuscinetto.
- Aggiungere 1,0 ml di PBS 1X freddo per un pozzo fresco sul piatto dissezione e utilizzando un paio di pinze trasferire una larva cuscinetto sia i tumori benigni o invasivi (il protocollo dissezione rimane la stessa per i due tipi di tumori).
- Tenere la larva verso il basso con un paio di pinze circa 2/3rds dalla fine anteriore.
- Utilizzare l'altra coppia di pinze ed elegantemente separare il 1/3rd posteriore della larva e scartarla.
- Lasciate andare anteriore 2/3rds della larva. Quando la pressione all'interno della larva viene rilasciato il contenuto dellarva permette la fuoriuscita della cavità del corpo.
- Utilizzare un paio di pinze per rimuovere l'intestino, grasso corporeo e altri contenuti interni della larva che hanno colava fuori della cavità del corpo.
- Utilizzare un paio di pinze per tenere il gancio bocca del larva e spingerlo nell'epidermide larvali e con l'altra coppia di pinze invertire completamente la larva.
- Utilizzare le pinze per rimuovere delicatamente e accuratamente il corpo grasso, ghiandole salivari, intestino, il complesso disco ala ed eventuali tubi tracheali. Il complesso cefalica dovrebbe essere visibile attaccato al gancio bocca della larva invertita. Gli emisferi cerebrali e il cordone nervoso ventrale (VNC) sarebbe ancora essere collegati l'epidermide larvali attraverso i nervi provenienti dalla VNC.
- Utilizzare un paio di pinze per rompere delicatamente le connessioni tra i nervi cefaliche e l'epidermide larvali.
- Poiché le connessioni nervose tra il VNC e l'epidermide larvali sono rotti e grasso corporeo in eccesso e altri tessuti rimossi, il co cefalicamplex diventerebbe chiaramente visibili e saranno allegate alla epidermide larvali solo presso i ganci bocca.
- Il complesso cefalica può essere lasciato collegato alla epidermide larvali se il complesso deve essere fissato per applicazioni a valle come colorazione anticorpale o per la visualizzazione successiva.
- Se non altre applicazioni a valle verrebbe eseguita allora il complesso cefalica può essere staccato dall'epidermide larvali e posta in una goccia di un mezzo di montaggio glicerolo base per ulteriore osservazione e di analisi. Utilizzare Vectashield come il mezzo di montaggio.
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Representative Results
Come risultato del protocollo presentato qui l'utente sarà in grado di indurre tumori benigni sovraesprimendo un oncogene attivato nel larvale occhio antennal disco immaginale. L'utente sarà anche in grado di indurre tumori invasivi nel disco antennal occhio sovraesprimendo un oncogene attivato al cloni di cellule mutanti anche per un gene polarità cellulare. I tumori possono essere facilmente visualizzati con l'aiuto di uno stereomicroscopio a fluorescenza come tessuto "fluorescente verde" in tutto larve o in complessi cefaliche che sono stati sezionati dal corpo cavità larvale (Figura 1). I tumori benigni saranno localizzati al complesso disco antennal occhio come cloni di cellule positive per GFP che i tumori invasivi provocheranno massiccia crescita eccessiva di tumori e successiva migrazione dei tumori invasivi GFP positive al VNC e altri organi contigui. In> 10 giorni d'età larve (derivato dal genotipo tumore invasivo) tumori secondari positivi e distaccati GFP floating nella cavità del corpo larvale può anche essere osservato. Inoltre, mentre le larve recanti i tumori benigni pupariate in tempo, quelli che portano i tumori invasivi hanno un periodo larvale esteso e non riescono a pupariate. Questi invasiva del tumore del cuscinetto larve potrebbe facilmente essere osservato come "larve giganti" con un pieno di liquido cavità del corpo.
Figura 1. . Tumori benigni e invasive in Drosophila AB sinistra del pannello: verde fluorescente larva con tumori benigni e invasivi, rispettivamente, AB pannello di destra:. Sezionato complessi cefaliche da larve cuscinetto sia tumori benigni o invasivi, rispettivamente A) I tumori benigni sono localizzate per l'occhio-antenne. disco dove sono indotte. Si noti che il tessuto etichetta GFP non ha migrato ad organi contigui comeil cordone nervoso ventrale (VNC). Confronta questo B. B) cuscinetti tumori invasivi complessi cefalico da una giornata 10 larva. Notare la crescita eccessiva di tessuto tumorale (verde) e anche invasione di organi contigui come il VNC e bocca ganci nel tessuto tumorale (indicato da una freccia rossa). L'invasione degli organi contigui nel tessuto tumorale invasiva è indicata con una freccia. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Uno schema di classificazione per i tumori invasivi basati sulla misura della migrazione sulla VNC. Lo schema del VNC è mostrato con l'estensione della migrazione tumorale raffigurata con riempimento di colore verde. Il numero associato algravità della migrazione è dato al di sopra di ogni schema.
| Cromosoma # | Ceppo Tester genotipo | Testato genotipo ceppo | Riferimento | |
| I tumori benigni | Tumori invasivi | |||
| 1 | w, Tub-Gal80, FRT19A; ey-FLP5, Act5C> y +> GAL4, UAS-GFP | w, FRT19A; UAS-Ras V12 | dlg M52, FRT19A/FM7C; UAS-Ras V12 | Pagliarini e Xu 2003 |
| 2 | y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> GAL4, UAS-GFP | w, FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO | w, LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO | Pagliarini e Xu 2003 |
| 3 | y, w, ey-FLP1; Act5C> y +> GAL4, UAS-GFP;FRT82B, Tub-Gal80 | w; UAS-Ras V12; FRT82B | w; UAS-Ras V12; FRT82B, Scrib 1 / TM6Tb | Pagliarini e Xu 2003 |
Tabella 2. Il genotipo di scorte necessarie per indurre i tumori benigni e invasivi. Tutte le azioni sono state descritte nel riferimento indicato. Le scorte devono essere richiesti dal laboratorio di Tian Xu.
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Discussion
Il cancro è una malattia complessa con una comprensione molto migliore oggi rispetto al passato. Tuttavia, resta ancora molto da imparare e spiegato prima abbiamo un quadro completo dei meccanismi alla base. Il semplice protocollo qui presentato permette di indurre geneticamente tumori benigni e invasivi in un intero organismo e poi studiare la biologia associata alla progressione dei tumori in questo modello. La maggior parte delle tecniche esistenti in Drosophila e altri organismi o utilizzano un sistema di coltura cellulare basato capire tumorigenesi e metastasi o un sistema che utilizza il trapianto di tessuti tumorali primari in host adulti 23-27. Sia la cella in base e le tecniche di trapianto hanno i loro limiti. Ad esempio, la tecnica di trapianto è ingombrante e richiede tempo e può portare a trapianto di tessuti non tumorali nell'ospite. Ciò può comportare la produzione di artefatti sperimentali. Inoltre, cult cellularesistemi basati ure sono solo approssimazioni dell'ambiente reale che esiste in un intero organismo. Questa limitazione rende difficile imitare il tumore molto importante e l'interazione microambiente che gioca un ruolo critico nella progressione tumorale e metastasi 34. La tecnica qui presentata è stata impiegata con successo da diversi gruppi di ricerca per studiare le basi genetiche e molecolari della progressione tumorale in Drosophila. Ad esempio, utilizzando questa tecnica è stato dimostrato che la via di JNK è sia upregulated in tumori invasivi ed è anche necessario per la progressione dei tumori 35,36. In un altro studio è stato dimostrato il ruolo di Matrix metalloproteasi nella progressione tumorale in questo modello genetico 12,37.
I passaggi critici associati al protocollo presentato qui iniziano con la corretta genotipo di supporti utilizzati per l'induzione di tumori benigni e invasivi. Si deve prestare attenzione a garantire che questile scorte non sono "crollando". Le scorte possono essere controllati periodicamente per la presenza di giallo (Y -) mosche che sarebbe indicativo di una crisi di magazzino. Ciò indicherebbe che la cassetta FLP-Out in marcm tester titolo ha spontaneamente capovolto fuori e sarebbe quindi esprimere Gal4 costitutivamente. Ciò può essere evitato mantenendo scorte duplicati in fiale ed a 18 ° C. Inoltre, i tumori sono indotte, il giorno in cui le larve dovrebbe essere controllato per tumori benigni e invasivi è anche critico. Mentre le larve cuscinetto tumore benigno seguire una linea temporale di sviluppo che è molto simile al tipo selvaggio larve, la storia con tumori invasivi cuscinetti larve è diverso. Il cuscinetto tumore del display larve invasivo esteso stadio larvale e alcuni non riescono a pupariate. Infatti questa struttura di pupariation contro pupariation guasto è stato utilizzato come misura di soppressione del tumore invasivo da Menut et al. 38 A causa della larvale estesafase invasiva larve cuscinetto tumore è fondamentale osservare tumori invasivi intorno al giorno 8-10 dopo induzione per i migliori risultati. Al giorno 8-10 abbastanza migrazione tumore ha successo sul VNC in modo che sia facilmente osservabile al microscopio stereo. Oltre giorno 10, mentre il tumore può essere osservato, esso comincia a fagocitare completamente i VNC rendendo difficile orientare il complesso cefalica in campioni sezionati. Un altro punto critico associato con visualizzazione dei tumori in tutta larve è la possibilità di immobilizzare le larve. Sia FlyNap riducendo le temperature possono essere usati per immobilizzare le larve come descritto nel protocollo dettagliato. Infine, se i complessi cefaliche sezionati devono essere colorato con un anticorpo poi le dissezioni devono essere eseguite su ghiaccio e complessi è necessario fissare entro trenta minuti.
La tecnica qui presentata può essere utilizzato dai ricercatori per capire il contributo dei geni sospettati di avere un ruolo nella progressione tumorale.Utilizzando questo modello genetico regolamento up di un gene può essere studiato in-situ mediante tecniche di colorazione anticorpale o mediante l'uso di RT-PCR. Si può anche tentare di capire se un gene è necessario per la progressione del tumore utilizzando questo modello in combinazione con mutanti per il gene in questione o reagenti RNAi. Ad esempio, un reagente RNAi per un gene da testare per la soppressione tumorale potrebbe essere presente sul cromosoma 3 °. In questo caso il tester e la combinazione di azione testata per cromosoma 2 potrebbero essere utilizzati (Tabella 2) solo dopo l'RNAi cuscinetto 3 ° cromosoma è stato attraversato nel brodo testata. Una volta che questo è stato raggiunto poi il tester e testato stock cromosoma 2 possono essere attraversati e la soppressione dei tumori invasivi dosati. Una soppressione di invasivo fenotipo tumorale suggerisce il coinvolgimento di un gene nel processo invasivo. Tuttavia, la soppressione del fenotipo invasivo non può essere completamente penetrante ed è per questa ragione chepresentare uno schema di classificazione per tumori invasivi basati sulla misura della migrazione dei tumori sul VNC (Figura 2). Utilizzando questo schema di classificazione si può facilmente confrontare i tumori invasivi per tumori invasivi in cui un gene sospettato di essere coinvolto in invasione è stato abbattuto. Analisi dei diversi complessi cefaliche può dare una migliore comprensione della portata della soppressione comportamento invasivo.
Mentre il protocollo qui presentato può essere utilizzato in combinazione con knockdown di uno o due geni per studiare l'effetto dei geni sulla progressione del tumore, abbattimenti simultanei di più di due geni sarebbe tecnicamente difficile da raggiungere. Infine, una modifica di questa tecnica è stata utilizzata da Wu et al. 39 per capire gli effetti di giustapporre oncogene attivato cellule che esprimono contro le cellule che erano mutanti per i geni di polarità cellulare. La tecnica da Wu et al. Era una modifica a livello di reagenti genetiche huttavia l'esperimento utilizzata dissezione di complessi cefaliche per la visualizzazione dei tumori. Pertanto, il metodo per analizzare i complessi cefaliche presentati qui potrebbe essere utile per gli scienziati che cercano di utilizzare la tecnica modificata presentato da Wu et al. Pure.
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Disclosures
Non ho nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca nel mio laboratorio è sostenuto dal Dipartimento WKU dei fondi di avvio Biologia, WKU Research Foundation RCAP-I concedere # 11-8032 e da una sovvenzione KBRIN-AREA finanziata attraverso una sovvenzione genitore dall'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali della Salute con il numero award 5P20GM103436-13. Vorrei inoltre ringraziare il dottor Tian Xu nel cui laboratorio sono stato presentato a questa tecnica e il dottor Raymond Pagliarini che per primo ha stabilito questa tecnica in laboratorio Xu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. | |||
References
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