Summary
שיתוף פעולה בין אונקוגן הופעל כמו RAS V12 ומוטציות בגנים קוטביות תא כמו שרבטה, לגרום לצמיחת גידול בדרוזופילה שבו תאים סרטניים גם להציג התנהגויות פולשנית. הנה פרוטוקול פשוט לאינדוקציה והתבוננות בגידולים שפירים ופולשנית מוצג.
Abstract
דרוזופילה האירה את ההבנה של הבסיס הגנטי של התפתחות מחלה ורגילה שלנו בעשורים האחרונים, וכיום היא ממשיכה לתרום הרבה מאוד להבנה של מחלות מורכבות 1-7 שלנו. התפתחות של גידולים משפירים למצב גרורתי היא אירוע מורכב 8 וכבר הדגם בדרוזופילה כדי לעזור לנו להבין טוב יותר את הבסיס הגנטי של מחלה זו 9. כאן אני מציג פרוטוקול פשוט כדי לגרום גנטי, להתבונן ולאחר מכן לנתח את ההתפתחות של גידולים בזחלי דרוזופילה. טכניקת האינדוקציה הגידול מבוססת על מערכת MARCM 10 ומנצלת את שיתוף הפעולה בין אונקוגן הופעל, ראס V12 ואובדן של גנים קוטביות תא (שרבט, דיסקי זחלים ענק גדולים וקטלניים) כדי ליצור גידולים פולשניים 9. אני אדגים כיצד ניתן דמיינו גידולים אלה בזחלים ללא פגע ואז איך אלה יכולים להיות גזורים החוצה לניתוח נוסף. הפרוטוקול פשוטים שהוצג כאן צריך לעשות את זה אפשרי עבור טכניקה זו כדי להיות מנוצל על ידי חוקרים מעוניינים בהבנת תפקידו של גן בפלישת גידול.
Introduction
התפתחות של גידולים משפירים למצב גרורתי היא תהליך חכם צעד שמאופיין בהתחמקות ממנגנוני הגנה בגוף נוכחי 8. לדוגמא תאים סרטניים בגוף חייבים להיות מסוגלים להתחמק ממערכת החיסון ואפופטוזיס, פריצת דרך המטריצה תאית מיוחדת (ECM) הנקראת קרום במרתף, ולהתגבר על כל פקדים חברתיים שהוטלו על ידי התאים המקיפים את 8. זוהי דרך התקדמות חכמה צעד שהתאים הסרטניים לרכוש את היכולת להעביר וליישב אתרים מרוחקים בתהליך הנקרא גרורות. ההבנה של אופן שבו התאים הסרטניים מתגבר על החסמים שהוטלו על ידי הגוף שלנו היא עדיין בחיתוליו, לעומת זאת, התמונה המצטיירת ממחקר שנעשתה עד כה מצביע על שימוש חוזר של תהליכים התפתחותיים נורמלים ומסלולי איתות על ידי התאים הסרטניים 11-13.
זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster תרם מאוד לunderstanding של התפתחות נורמלית ומחלה באמצעות שימוש בטכניקות גנטיות מתוחכמות שפותחו בעשורים האחרונים 14-17. באמצעות mutagenesis וכלי ביטוי יתר שהגענו להבנה טובה יותר של אונקוגנים שונים וגני מדכאי סרטן 18-22. עם זאת, גרורות סרטניים היא תוצאה של שיתוף פעולה בין כמה נגעים גנטיים שנחקר בעיקר במודלים של תרבית תאי 23,24 כמו גם מודלים xenograft שונים 25-27. יש מודלים אלו אם כי עוצמה המגבלות שלהם כמו שהם לא לחקות לחלוטין את התנאים נמצאו בכל יצור חי. יתר על כן, מודלים מהונדסים זמינים בעכברים הם מסורבלים ולא תורם לניתוח גנטי של התנהגות 28,29 פולשנית. מספר מחקרים ניסו להבין פלישה של תאים סרטניים בדרוזופילה 30,31. טכניקות אלו בעיקר לנצל השתלה של גידולים ראשוניים למארחים ולאחר מכן מסתמכות על מעקב טרהnsplanted גידולים לפלישה לרקמות שכנות 32,33. טכניקה רבת עוצמה בשם MARCM 10 הותאמה על ידי Pagliarini ושו למודל פלישת גידול בדרוזופילה 9. דוגמנות גנטית אלגנטית זה של פלישת גידול ניצלה את שיתוף הפעולה בין אונקוגן הופעל ואובדן קוטביות תא. כוחו של דוגמנות זה טמון בעובדה שהגידולים פולשניים נוצרים באורגניזם שלם ובכך לעקוף את הצורך בהשתלה של רקמות. כדי להביא לשיתוף פעולה בשעור, אונקוגן הופעל כמו ראס V12 מתבטא בשיבוטים של תאים בדיסק עיניים מחושים הזחל. כתוצאה מטכניקת MARCM שיבוטים אלה גם מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להדמיה קלה ונעשים הומוזיגוטים למוטציות קוטביות תא כמו זחלים קטלניים ענק, שרבט, ודיסקים גדולים. התוצאה היא ה-GFP מתויגת גידולים פולשניים ב מורכב cephalic. בדו"ח זה אניתדגים כיצד לגרום, ולחזות גידולים פולשניים אלה הן בהקשר של זחלים שלמים והמורכב בcephalic גזור החוצה. האינדוקציה הגידול המובאת כאן מנצלת חומרים כימיים בכרומוזום השני של דרוזופילה. בטבלה 2, אני מספק רישום של מניות על כרומוזומים X ו -3 שניתן לנצלם לאותה מטרה. אני מאמין כי פרוטוקול פשוט זו יהפוך את הטכניקה הזו נגישה לחוקרים המעוניינים בהבנת הבסיס המולקולרי של התקדמות גידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אינדוקציה של גידולים לא פולשני שפירים
- השתמש במניות רשומות בטבלה 2 לאינדוקציה של גידולים שפירים.
- הכן את תרבות המתנע עבור המניה "בוחן" של גנוטיפ הבא: y, w, אי-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A;> y Act5C +> Gal4, כטב"מ-GFP
- הכן את תרבות המתנע עבור המניה "נבדקה" של גנוטיפ הבא: w; FRT40A, כטב"מ-V12 ראס / ארגון נוער קתולי
- לאסוף עשר בתולות מהמלאי "הבוחן" ועשרה זכרים מהמלאי "נבדק".
- לחצות את הזכרים ונקבות מ" הבוחן "והמנייה" נבדקה "על ידי הצבת את שניהם בבקבוקון עם אוכל לטוס.
- הנח את הצלב בחממה 25 ° C ולאפשר הזכרים ונקבות להזדווג ולהטיל ביצים ל24-48 שעה.
- בדקו את הבקבוקונים לתצהיר ביצה מספיק ואת הימצאותם של זחלי instar הראשונים ולוודא כי התרבות היא לא להתייבש.
- הוסף כמה טיפות של autoclavedמים מזוקקים לתרבות כדי לשמור אותו הלח (אם התרבות היא התייבשות).
- תמשיך לעקוב אחר התרבות וחזור על שלב 1.7.1 במידת הצורך.
- שים לב נדודי זחלי instar שלישיים תחת סטראו הקרינה כפי שתואר בסעיף 3.
2. אינדוקציה של גידולים פולשניים
- השתמש במניות רשומות בטבלה 2 לאינדוקציה של גידולים פולשניים.
- השתמש בתרבות המתנע מצעד 1.2 לעיל של גנוטיפ הבא: y, w, אי-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C y> +> Gal4, כטב"מ-GFP
- הכן את תרבות המתנע עבור המניה "נבדקה" של גנוטיפ הבא: w;, FRT40A, ראס כטב"מ V12 / ארגון נוער הקתולי LGL 4
- לאסוף עשר בתולות מהמלאי "הבוחן" ועשרה זכרים מהמלאי "נבדק".
- לחצות את הזכרים ונקבות מ" הבוחן "והמנייה" נבדקה "על ידי הצבת את שניהם בבקבוקון עם f זבובood.
- הנח את הצלב בחממה 25 ° C ולאפשר הזכרים ונקבות להזדווג ולהטיל ביצים ל24-48 שעה.
- בדקו את הבקבוקונים לתצהיר ביצה מספיק ואת הימצאותם של זחלי instar הראשונים ולוודא כי התרבות היא לא להתייבש.
- הוסף כמה טיפות של autoclaved מים מזוקקים לתרבות כדי לשמור אותו הלח (אם התרבות היא התייבשות).
- תמשיך לעקוב אחר התרבות לצעד יובש וחזור על 2.7.1 לפי צורך.
- שים לב לזחלי instar שלישיים תחת סטראו הקרינה כפי שתואר בסעיף 3.
3. תצפית של גידולים שפירים ופולשני
- השתמש זחלי instar שלישיים לבידוד גידול שפיר וויזואליזציה.
- הרטב מברשת צבע במים מזוקקים, ובאמצעות מברשת צבע זה לגרד כמה זחלי instar שלישיים מהקיר של בקבוקון התרבות.
- הנח זחלים בשקופית דיכאון עם 1X PBS ולאחר מכן באמצעות גרוטאות מברשת צבע רטובותדואר את כל חומר מזון מהאפידרמיס הזחל.
- מניחים את הזחלים בצלחת פטרי ולהשאיר במקפיא -20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לשתק את הזחל.
- שיטה חלופית כדי לשתק זחלים באמצעות FLYNAP.
- הנח את שרביט FLYNAP טבול בFLYNAP לבקבוקון מ3.1.3.2 ולאחר חיבור הבקבוקון פקוק בואו בקבוקון עם זחלים לעמוד 30-40 דקות.
- מניחים את הזחל המשותק בשקופית זכוכית, להוסיף טיפה של שמן halocarbon אור, מכסה עם מכסה זכוכית ולהתבונן תחת סטראו הקרינה עם היכולת לדמיין חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP).
- זחלי נושאות גידול השפירים יהיו לזרוח ירוקים באזור הקדמי שבו מורכב cephalic הוא הווה.
- בחר יום 10 זחלים (אחרי גיוס) מהתרבות שנקבעה בשלב המס '2 לעיל לתצפית של גידולים פולשניים. יום 10 זחלים נבחרו בגלל שיש לי זחלי נושאות גידול פולשני l מורחבשלב Arval ובאופן כללי לא מצליח pupariate.
- עקוב 3.1.1 צעדים ל3.1.4 אלא שבמקום יום שימוש זחלי instar השלישי 10 זחלים.
- זחלי נושאות גידול פולשני יום 10 יהיו לזרוח ירוקים באזור הקדמי שבו מורכב cephalic הוא הווה.
- אם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה דיגיטלית ואז לקחת תמונות של זחלי נושאות גידול השפירים ופולשנית fluorescing.
4. Dissection של התצפית מורכבת ונוספת מסוג cephalic של גידולים שפירים ופולשני
האפידרמיס השקוף של הזחל מקשה לשמור על המידה של פלישה של גידולים. כך המידה של פלישה היא מדמיין טוב יותר על ידי ביתור מורכב cephalic מהזחל. צריכים להיות מנוצלים בשלבים הבאים כדי לנתח מורכב cephalic.
- בעזרת מברשת צבע רטובה בחר זחלים שלישיים instar (לגידולים שפירים) ויום 10 זחלים (עבור גידולים פולשניים) from צלוחיות התרבות, בהתאמה.
- הנח זחלים בטוב של צלחת לנתיחה המכילה קר 1X PBS. השתמש במברשת צבע כדי לגרד את כל חלקיקי מזון מן האפידרמיס הזחל.
- העבר את הזחלים נקיים גם טרי של הצלחת לנתיחה המכילה קר 1X PBS.
- בדוק לנוכחות של הקרינה ה-GFP באמצעות סטראו מסוגל לאתר הקרינה. בטל זחלים אינן נושאים ה-GFP.
- הוספת 1.0ml של קר 1X PBS ולטרי על הצלחת לנתיחה ובאמצעות זוג המלקחיים להעביר זחל נושאת או גידולים שפירים או פולשני (פרוטוקול הנתיחה נשאר זהה לאלה שני סוגים של גידולים).
- החזק את הזחל מטה בעזרת זוג מלקחיים על 2/3rds מהקצה הקדמי.
- השתמש זוג מלקחיים האחר וזריזות להפריד 1/3rd האחורי של הזחל וזורקים אותו.
- עזוב את 2/3rds הקדמי של הזחל. ככל שהלחץ בתוך הזחל משתחרר תוכןזחל יהיה לטפטף מתוך חלל הגוף.
- השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את הבטן, שומן גוף ואת התוכן פנימי אחר של הזחל שניגר מתוך חלל הגוף.
- השתמש זוג המלקחיים להחזיק את הקרס בפה של הזחל ולדחוף אותו לתוך האפידרמיס הזחל ובאמצעות זוג מלקחיים האחר להפוך את הזחל לחלוטין.
- השתמש במלקחיים בעדינות ובזהירות כדי להסיר את השומן בגוף, בלוטות רוק, מעיים, מורכבת דיסק כנף וכל צינורות לקנה הנשימה. מורכב cephalic צריך להיות גלוי כעת מחובר לקרס הפה של הזחל ההפוך. אונות המוח ואת חוט עצב הגחון (VNC) עדיין תהיינה מחוברים לאפידרמיס הזחל דרך העצבים הנובעים מVNC.
- השתמש זוג מלקחיים כדי לשבור בעדינות את הקשרים בין עצבי cephalic והאפידרמיס הזחל.
- , שיתוף cephalic כמו חיבורי העצב בין VNC והאפידרמיס הזחל שבורים וגוף עודף שומן ורקמות אחרות הוסרוmplex יהיה ברור לעין ויצורף האפידרמיס הזחל רק בווי הפה.
- מורכב cephalic ניתן להשאיר מצורף האפידרמיס הזחל אם מורכב צריך להיות קבוע עבור יישומים במורד הזרם כמו מכתים נוגדן או להדמיה מאוחר יותר.
- אם אין יישומים נוספים במורד הזרם הייתי להתבצע לאחר מכן מורכב cephalic יכול להיות מנותק מן האפידרמיס הזחל והניח בטיפת גליצרול תקשורת הרכבה המבוסס על התבוננות וניתוח נוספים. השתמש Vectashield כתקשורת הרכבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כתוצאה מהפרוטוקול מובאת כאן המשתמש יהיה מסוגל לגרום לגידולים שפירים על ידי overexpressing אונקוגן הופעל בדיסק דמותי מחושים עיני הזחל. משתמש גם תוכל לגרום לגידולים פולשניים בדיסק המחושים העין על ידי overexpressing אונקוגן הופעל בשיבוטים של תאים גם למוטציה גנטית קוטביות תא. הגידולים יכולים להיות דמיינו בקלות בעזרת סטראו ניאון כרקמת "ניאון ירוק" בכל הזחלים או במתחמי cephalic כי כבר גזורים מתוך חלל גוף הזחל (איור 1). גידולים שפירים יהיו מקומיים למתחם דיסק המחושים עין כשיבוטים של תאי GFP חיוביים ואילו הגידולים פולשניים יגרמו לצמיחת יתר המסיבית של גידולים והגירה עוקבת של גידולים פולשניים חיוביים GFP לVNC ואיברים רציפים אחרים. בזחלים ישנים> 10 יום (הנגזר מהגנוטיפ הגידול פולשניים) גידולים משניים חיוביים ומנותקים GFP floaטינג בחלל גוף הזחל יכול גם להיות שנצפה. יתר על כן, בעוד שהזחלים הנושאים את הגידולים שפירים pupariate בזמן, יש את אלו הנושאים את הגידולים פולשניים תקופת זחל ארוכה ולא מצליחים pupariate. זחלי נושאים אלה פולשנית גידול יכולים להיבחן בקלות כמו "זחלים ענק" עם חלל גוף מלא נוזל.
איור 1. . גידולים שפירים ופולשני בדרוזופילה AB עזב פנל: זחל ירוק fluorescing עם גידולים שפירים ופולשני, בהתאמה פנל ימני AB:. מתחמי cephalic גזורים מן זחלי נושאות או גידולים שפירים או פולשנית בהתאמה) גידולים שפירים הם נקודתיים לעיני המחושים. דיסק שבו הם מושרה. שים לב שרקמת GFP שכותרתו לא נדדה לאיברים רציפים כמוחוט עצב הגחון (VNC). ישוו את זה ל-B. ב ') נושאות גידולים מורכבים מסוג cephalic פולשנית מיום 10 זחל. שים לב לצמיחת יתר של רקמת גידול (ירוק) וגם פלישה לאיברים רציפים כמו VNC ופה ווים על ידי רקמת הגידול (מסומנת בחץ אדום). הפלישה לאיברים רציפים על ידי רקמת הגידול פולשני מסומנת בחץ. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 2. תכנית סיווג עבור גידולים פולשניים המבוססים על יותר VNC היקף ההגירה. סכמטי של VNC מוצג עם מתואר עם מילוי צבע ירוק היקף הגירת גידול. המספר הקשוריםחומרה של הגירה היא נתון מעל כל סכמטי.
| # כרומוזום | גנוטיפ מתח בוחן | גנוטיפ זן נבדק | הפניה | |
| גידולים שפירים | גידולים פולשניים | |||
| 1 | w, האמבטיה-Gal80, FRT19A; אי-FLP5, Act5C> y +> Gal4, כטב"מ-GFP | w, FRT19A; כטב"מ-ראס V12 | M52 DLG, FRT19A/FM7C; כטב"מ-ראס V12 | Pagliarini ושו, 2003 |
| 2 | y, w, אי-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C y> +> Gal4, כטב"מ-GFP | w; FRT40A, ראס כטב"מ V12 / ארגון נוער קתולי | w;, FRT40A, כטב"מ-V12 ראס / ארגון נוער קתולי LGL 4 | Pagliarini ושו, 2003 |
| 3 | y, w, אי-FLP1;> y Act5C +> Gal4, כטב"מ-GFP;FRT82B, האמבטיה-Gal80 | FRT82B; w; כטב"מ-ראס V12 | w; כטב"מ-V12 ראס; FRT82B, קשקושים 1 / TM6Tb | Pagliarini ושו, 2003 |
טבלה 2. גנוטיפ של המניות הדרושות כדי לגרום לגידולים שפירים ופולשני. כל המניות תוארו בפנייה מצויינים. יש לבקש ממניות המעבדה של טיאן שו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסרטן הוא מחלה מורכבת עם הבנה הרבה יותר טובה היום מאשר בעבר. עם זאת, הרבה עדיין צריכה ללמוד והסביר לפני שיש לנו תמונה של המנגנונים שלמה. הפרוטוקול פשוט שהוצג כאן מאפשר לגרום גנטי גידולים שפירים ופולשני בהאורגניזם כולו ולאחר מכן ללמוד את הביולוגיה הקשורים להתפתחות של גידולים במודל זה. רוב הטכניקות קיימות בדרוזופילה ואורגניזמים אחרים או לנצל את מערכת תרבות המבוססת תא להבין tumorigenesis וגרורות או מערכת שמעסיקה השתלה של רקמות גידול ראשוניות למארחים מבוגרים 23-27. שניהם מבוסס על התא ויש להם טכניקות השתלת המגבלות שלהם. לדוגמא, טכניקת ההשתלה היא מסורבלת וגוזל זמן ועלולה לגרום להשתלה של רקמות שאינן סרטניים לתוך המארח. זה עלול לגרום לייצור של ממצאי ניסויים. יתר על כן, כת תאמערכות מבוססות יור הן רק קירובים של הסביבה האמיתית שקיים באורגניזם שלם. מגבלה זו הופכת אותו לקשה לחקות את הגידול חשוב מאוד והאינטראקציה מיקרו הסביבה שמשחק תפקיד קריטי בהתפתחות גידול וגרור 34. הטכניקה המוצגת כאן כבר מועסק בהצלחה על ידי מספר קבוצות מחקר כדי לחקור את הבסיס הגנטי ומולקולרי של התקדמות גידול בדרוזופילה. לדוגמא, השימוש בטכניקה זו זה היה הוכיח כי מסלול JNK הוא גם הוגבר בגידולים פולשניים, והוא גם הכרחי להתפתחות של גידולים 35,36. במחקר אחר את התפקיד של מטריקס MetalloProtease בהתקדמות גידול הודגם ב12,37 מודל גנטי זו.
השלבים הקריטיים הקשורים בפרוטוקול המובא כאן יתחילו עם גנוטיפ הנכון של מניות המשמשות לזירוז של גידולים שפירים ופולשני. צריך להקפיד על מנת להבטיח כי אלהמניות אינן "פירוק". המניות ניתן לבדוק מעת לעת את נוכחותם של צהוב (y -) זבובים שיהיה מעיד על התמוטטות בורסה. זה היה מציין כי קלטת FLP-Out במניית בוחן MARCM כבר השתגעה מזה באופן ספונטני והיה וכך יהיה להביע Gal4 constitutively. זה ניתן למנוע על ידי שמירה על מניות כפולות בצלוחיות ב18 ° C. כמו כן, כגידולים מושרה, היום שבו הזחלים צריכים להיבדק לגידולים שפירים וחודרניים הוא גם קריטי. בעוד זחלי נושאות גידול שפיר לעקוב ציר זמן ההתפתחותי שדומה באופן הדוק לזחלים מסוג בר, הסיפור עם גידולים פולשניים נושאות זחלים הוא שונה. תצוגת הזחלים פולשנית גידול נושאות האריכה שלב זחל וחלק לא מצליח pupariate. ואכן תכונה זו של pupariation לעומת pupariation נכשל נוצלה כאמצעי של דיכוי גידולים פולשניים ידי Menut et al. 38 בגלל הזחל המורחבשלב בזחלי נושאות גידול פולשני זה הוא קריטי כדי לבחון גידולים פולשניים סביב יום 8-10 לאחר אינדוקציה לתוצאות הטובות ביותר. ביום 8-10 הגירת גידול מספיק שקרה בVNC, כך שהוא נצפים בקלות תחת מיקרוסקופ סטריאו. מעבר ליום 10, ואילו ניתן לראות את הגידול, הוא מתחיל לבלוע לחלוטין VNC ולכן קשה לכוון מורכב cephalic בדגימות גזורים. עוד צעד קריטי הקשורים להדמיה של גידולים בכל זחלים הוא היכולת לשתק את הזחלים. FlyNap וטמפרטורות מופחתות שניהם יכולים לשמש גם כדי לשתק את הזחלים כפי שתוארו בפרוטוקול מפורט. לבסוף, אם מתחמי cephalic גזורים צריכים להיות מוכתמים עם נוגדן לאחר מכן צריכים להתבצע והניתוחים על קרח ומתחמים צריכים להיות קבועים בתוך שלושים דקות.
הטכניקה המוצגת כאן יכולה להיות מנוצל על ידי חוקרים להבין את התרומה של גנים חשודים לשחק תפקיד בהתקדמות גידול.שימוש במודל זה גנטי הרגולציה עד של גן ניתן ללמוד באתר על ידי טכניקות צביעת נוגדנים או באמצעות RT-PCR. אפשר גם לנסות להבין האם גן הוא הכרחי להתקדמות גידול על ידי ניצול מודל זה בשילוב עם מוטציות לגן מדובר או ריאגנטים RNAi. לדוגמא, מגיב RNAi לגן להיבדק לדיכוי גידול יכול להיות נוכח בכרומוזום 3 rd. במקרה זה בודק ושילוב מניות נבדק על כרומוזום 2 יכולים לשמש (טבלה 2) רק לאחר RNAi נושאת כרומוזום 3 rd נחצה למניות שנבדקו. ברגע שזה הושג לאחר מכן הבוחן והמניות נבדקו על כרומוזום 2 יכולים להיות חצו ודיכוי של גידולים פולשניים assayed. דיכוי פנוטיפ גידול פולשני הייתי מציע מעורבותו של גן בתהליך פולשני. עם זאת, הדיכוי של פנוטיפ פולשני לא יכול להיות penetrant לחלוטין והוא סיבה לכך שאנילהציג את תכנית סיווג עבור גידולים פולשניים המבוססים על היקף ההגירה של הגידולים מעל VNC (איור 2). ניצול תכנית סיווג זה אפשר בקלות להשוות גידולים פולשניים לגידולים פולשניים שבו גן בחשד למעורבות בפלישה כבר הפיל. ניתוח של כמה מתחמי cephalic עשוי לתת תובנות טובות יותר את מידת דיכוי התנהגות פולשנית.
בעוד הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש בשילוב עם מציאה של גן אחד או שניים ללמוד אפקט 'גנים על התקדמות גידול, knockdowns בו זמנית של יותר משני הגנים יהיה קשה מבחינה טכנית להשגה. לבסוף, שינוי של טכניקה זו נוצל על ידי וו et al. 39 כדי להבין את ההשפעות של juxtaposing אונקוגן הופעל לבטא בתאים נגד תאים שהיו מוטציה לגני קוטביות תא. הטכניקה על ידי וו et al. הייתה שינוי ברמה של שעות ריאגנטים גנטייםowever נתיחת הניסוי מנוצל של מתחמי cephalic להדמיה של גידולים. לכן השיטה לנתח מתחמי cephalic מוצגים כאן יכולה להיות שימושית עבור מדענים מנסים לנצל את הטכניקה שונה שהוצגה על ידי אל וו et. גם כן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר במעבדה שלי הוא נתמך על ידי משרד wku של קופות הפעלת ביולוגיה, מחקר wku קרן RCAP-אני מעניק # 11-8032 ועל ידי מענק KBRIN-AREA במימון באמצעות מענק הורה מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליות של המכון הלאומי בריאות תחת מספר הפרסים 5P20GM103436-13. אני רוצה גם להודות ד"ר טיאן שו במעבדה שהכיר לי את הטכניקה הזאת ואת ד"ר ריימונד Pagliarini שהוקמה בטכניקה זו ראשונה במעבדה שו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. | |||
References
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
- Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
- Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
- Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
- Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
- Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genetics. 154, 695-712 (2000).
- Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetics. 156, 1231-1242 (2000).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
- Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
- Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
- Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
- Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
- Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
- Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genetics. 177, 1667-1677 (2007).
- Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).
