Summary
현재 문서 곰팡이 독성 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상 할 수있는 유용한 도구가 될 것입니다 인간 대 식세포와 통성 세포 내 인간의 곰팡이 병원균 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 모델 시스템을 구축 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
세포 배양 모델 계, 호스트 환경 조건 부근 미믹, 미생물 병원체 감염의 특정 단계의 연구를위한 동물 모델 시스템을 저렴하고 재현성 쉽게 처리 가능한 대안이 될 수있는 경우. , 포르 볼 에스테르 치료시, 대 식세포로 분화된다 THP-1 인간 단핵구 세포주는 이전에 결핵균을 포함한 많은 세포 내 병원체의 독성 전략을 연구하기 위해 사용되었다. 여기서, 우리는 시험 관내 세포 배양 모델을 규정하는 프로토콜 토론 호스트 식세포 세포와 기회 주의적 인간의 효모 병원체 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 묘사하는 THP-1 대식 세포를 사용하여 시스템. 이 모델 시스템은 간단하고, 빠르고, 높은 처리량 돌연변이 화면에 순종하고, 더 정교한 장비가 필요하지 않습니다. 전형적인 THP-1 대식 세포 감염 실험 복구 세포를 허용하는 추가 ~ 48 시간으로 약 24 시간 소요식민지 단위 기반의 생존 분석을 형성하기 위해 다양한 매체에 성장 효모. 다른 시험 관내 모델 시스템과 같이,이 접근법의 가능한 제한은 인간 숙주에 존재하는 매우 복잡한 면역 세포 회로에 얻어진 결과를 외삽 곤란하다. 그러나 이것에도 불구하고, 현재의 프로토콜은 곰팡이 병원균 / 회피 항균 응답을 방해 생존, 적응 및 숙주 면역 세포의 영양이 부족한 환경에서 증식하는 데 사용할 수있다 전략을 명료하게하는 것은 매우 유용합니다.
Introduction
칸디다 종은 면역 저하 환자의 1에 생명을 위협하는 침습성 진균 감염의 주요 원인이다. 칸디다 글라 브라, 신흥 병원 내 병원체는 지리적 위치 1-3에 따라 중환자 실 환자에서 두 번째 또는 세 번째 가장 자주 고립 칸디다 종입니다. 계통 발생 학적으로, C. 글라 브라, 반수체 신진 효모, 더 밀접하게 비 병원성 모델 효모 사카로 병원성 칸디다 종보다 사카로 마이 세스 세레 비시에 관련되어 있습니다. C. 포함 알비 칸스 4. 이과 일치, C. 글라 브라는 짝짓기, 분비 단백질 분해 활성과 형태 학적 소성 4-5 등 일부 주요 곰팡이 독성 특성이 부족하다.
비록 C. 글라 브라는 균사를 형성하지 않는, 그것은 생존과 6-8는 고유 발병 메커니즘을 개발했다고 제안 쥐와 인간 대 식세포에 복제 할 수 있습니다. 제한된 정보는 전략에 대해 사용할 수 있는지 C. 글라 브라는 영양이 부족한 세포 대식 세포 환경을 생존과 산화 및 호스트 면역 세포 5 마운트 비산 화성 호스트의 응답을 방해하기 위하여 사용한다. 관련 식세포 모델 시스템은 C.의 상호 작용을 묘사하는 필수 조건이다 기능 유전체 및 단백체 접근 방식을 통해 호스트 식세포 세포와 글라 브라. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를) 및 인간 및 뮤린 기원의 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)는 각각 이전 C.의 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다 숙주 면역 세포 7,9와 글라 브라. 그러나, PBMC를하고 BMDMs를 얻기 어려움, 제한된 수명과 다른 포유 동물의 기증자들 본질적인 변화는 이러한 세포의 활용으로 다양한 모델의 시스템을 제한합니다.
여기에서, 우리는 intracellul을 연구하는 생체 시스템의 구축 방법을 설명합니다C. 아칸소 동작 인간 단핵구 세포주 THP-1에서 파생 된 대 식세포에서 글라 브라 셀. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 쉽게 호스트 곰팡이 병원균 상호 작용의 다양한 측면을 연구하기 위해 조작 할 수있는 간단하고 저렴한, 빠르고, 재생 가능한 세포 배양 모델 시스템을 제정했다.
THP-1 세포는 이전에 박테리아, 바이러스, 진균 등 10-12 병원균의 광범위한 대 숙주 면역 반응을 해독하는데 사용되어왔다. 단핵구 THP-1 세포는 유지 관리가 용이하고 인간의 단핵구 유래 대 식세포를 모방하고 적절한 대식 세포 마커 (13)를 표현하는 대 식세포에, 포르 볼 에스테르 처리에 따라 차별화 할 수 있습니다. THP-1 대식 모델 시스템의 주요 이점은 사용의 용이성 및 정교한 장비의 요구 사항의 부족이다.
여기에 제시된 프로토콜은 HOS 다른 사람의 곰팡이 병원균의 상호 작용을 연구하기 쉽게 적응할 수있다면역 세포를 톤. 현재의 절차는 또한 고 스루풋 돌연변이 스크린을 사용하여 관심의 병원체에 대한 독성 요소를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 증명의 개념은 인간 대 식세포에서 8 C. 글라 브라의 생존에 필요한 유전자 (56)의 집합을 식별하는 THP-1 배양 모델 시스템의 성공적인 사용에 의해 예시되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
그것은 C.를 수행하는 것이 좋습니다 글라 브라 감염 바이오 안전성 봉쇄 레벨 2와 실험실 실험 (BSL-2).
- THP-1 대식 세포 단일 층의 제조.
- C. 준비 글라 브라 세포 현탁액.
- C.와 THP-1 대식 세포의 감염 글라 브라 셀.
- 콜로니 형성 단위의 분석을 통해 식균 작용의 속도와 세포 내 복제의 측정.
- 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 세포 내 복제의 모니터링.
1. THP-1 대식 세포 단일 층의 제조
- THP-1은 급성 단핵구 백혈병 14 고통받는 1 살짜리 남자 아이의 말초 혈액에서 파생 된 인간의 단핵 세포 라인입니다. THP-1, 현탁 세포주, 일상적으로 10 % FBS (소 태아 혈청)으로 보충 된 RPMI-1640 배지에서 가습 된 5 % CO 2에서 37 ° C로 유지된다. 포르 12 myrista 치료TE 13 - 아세테이트 (PMA, 포르 볼 에스테르) 대 식세포로 THP-1 단핵 세포의 말단 분화 초래한다. 중요한 사실은, PMA 처리는 세포 생존에 영향을주지 않으며 분화 된 세포는 분열하지 않는다.
- 종자 약 1.5 × 10의 100mm 배양 접시에있는 6 THP-1 단핵구 RPMI-1640 완전 배지 (RPMI-1640 배지 10 % 혈청, 2 MM의 글루타민과 1X 항생제로 보충, 10 ㎖ / 요리)와 세포가 37로 증가하자 2 일 동안 5 % CO 2에서 C를 °.
- THP-1 세포를 13 × 105 세포 / ml의 밀도에 도달 세포 배양 층류 후드에 배양 접시를 전송하고 부드럽게 침전 세포를 재현 탁하도록 소용돌이했으면.
- 세포 현탁액을 피펫, 4 분 동안 1,000 rpm으로 (130 XG)에서 15 ㎖의 멸균 튜브와 원심 분리기에 배치합니다. 뜨는을 취소하고 5 ㎖ 신선한, 예비 가온, RPMI-1640 완전한 매체에 THP-1 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
- 혈구와 세포를 열거하고 CEL 희석10 6 세포 / ㎖로 데워진 RPMI-1640 완전한 매체의 최종 밀도 L 서스펜션
- (포르 볼 12 - 미리 스테이트 13 - 아세테이트 용액은 디메틸 설폭 사이드에서 제조) 10 ㎖ THP-1 세포 현탁액 (최종 농도 16 NM)에 160 mM의 PMA 주식 1 μl를 추가하고 잘 섞는다. 24 잘 조직 배양 플레이트의 각 웰에 1 ml의 세포 현탁액을 분배하고 12 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C로 유지 인큐베이터에서 접시를 품어.
- 오래된 매체를 제거, 1 ml의 RPMI-1640 완전한 매체를 데워진 추가하고 세포가 5 % CO 2에서 37 ° C에서 12 시간 동안 복구 할 수 있습니다.
- 현탁액이 타원형 모양의 THP-1 단핵구 세포가 평평 모양의 스핀들 및 식세포로 분화 졌음을 보장하기 위하여 거꾸로 현미경으로 세포를 관찰합니다. 이 분화 된 세포는 지금 C.을 수행 할 준비가 된 것입니다 글라 브라 감염 연구.
2. C. 준비 글라 브라 & #(160), 세포 현탁액
C. 글라 브라 야생형 균주 BG2는 THP-1 대식 세포를 감염시키기 위해 사용된다. C. 글라 브라 셀 액체 YPD (효모 추출물 (1 %), 펩톤 (2 %), 덱 스트로스 (2 %)) 배지에서 일상적으로 배양 하였다. 단단한 YPD 배지는 배지 고압 증기 멸균 전에 2 %의 한천을 첨가함으로써 제조된다.
- C.의 문화를 준비하려면 글라 브라가, 멸균, 일회용 루프 한천 플레이트에서 하나의 식민지을 주워와 10 ㎖ YPD 액체 배지에 접종하고 30 ℃에서 (200 rpm)으로 진탕 14 ~ 16 시간 동안 배양
- 테이블 위에 마이크로 원심에서 5 분 4,000 RPM (1,800 XG)에서 원심 분리기이 문화 (1 ㎖), 멸균 PBS (인산염 완충 식염수, 산도 7.4)와 세 번 세포를 세척하고 1 ㎖의 PBS에 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
- C.의 OD 600을 측정 글라 브라 세포 현탁액 및 2 × 106 세포 / ml의 밀도를 얻기 위해 멸균 PBS의 적절한 부피로 희석 (OD 600= 0.1). 대안 적으로, 원하는 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 효모 세포를 카운트함으로써 달성 될 수있다.
3. C.와 THP-1 식세포의 감염 글라 브라 셀
- 50 μL의 C. 추가 THP-1 식세포 (10 6 세포를 24 웰 배양 플레이트의 웰 당 시드) 0.1의 MOI (감염의 다중성)를 얻어 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 부화에 글라 브라 세포 현탁액.
- 가능한 효모 수를 결정하기 위해 50 μL C를 희석 글라 브라 세포 현탁액 멸균 PBS의 100 배와 YPD 고체 배지에 100 μl를 접시. 30 ° C에서 접시를 품어 수동 1-2일 후 나타나는 효모 콜로니의 수를 계산합니다. 이 숫자는, 이제부터는, 0 시간의 C.로 언급 될 것이다 글라 브라 CFUs (콜로니 형성 단위).
- C.와 THP-1 세포의 2 시간의 공동 배양 한 후 24 - 웰 조직 배양 플레이트를 반전시킴으로써 글라 브라 셀 폐기 배지 INA 저수지 및 nonphagocytosed 세포 C.를 제거하는 예비 가온 멸균 PBS로 가볍게 세 번 씻어 글라 브라 셀. PBS와 부드러운 세척은 THP-1 대식 세포 단일 층에 손상을 초래하지 않고 모든 세포 효모의 완전한 제거를 달성하기 위해 절대적으로 필수적이다.
4. 식민지가 단위 분석을 형성을 통해 식균 작용 속도 및 세포 내 복제의 측정
- 를 Lyse C. 글라 브라 2 O 2 분 동안 잘로부터 대식 파편을 제거하고 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 용 해물을 수집 가볍게 긁어 1 ㎖ 무균 H에서 THP-1 마크로파지를 감염. 전체 대식 세포 용해 현미경 검증은 모든 내면화 효모의 복구를 위해 필수적이다.
- 멸균 PBS에 용해 액의 100 배 희석액을 준비 YPD 고체 배지에 100 μl를 접시 30 ° C에서 접시를 품어
- 1~2일 후, C.의 수를 수동으로 계산 글라 브라는 AP를 식민지YPD 매체에 peared는 희석 계수 (2 시간의 CFUs)에 거는와 C의 비율을 의미한다 식균 작용의 속도를 계산 다음과 같은 공식을 사용하여 2 시간의 coincubation 후 THP-1 식세포에 의해 섭취되는 글라 브라 셀.
% 식균 작용은 = [(2 시간에서 CFUs) / (0 H에서 CFUs)] X 100 - C.의 세포 복제 속도를 측정하려면 THP-1 식세포에서 글라 브라 세포는 점은 감염의 예를 게시 다른 시간에 세포 내 효모를 수집합니다. 4, 6, 8, 10, 12, 24 시간, 3.3-4.3 단계를 반복함에 따라.
- C.의 배 서바이벌 / 복제를 계산 2 시간 (포식 효모)에 그 어떤 주어진 시점에서 총 CFUs 나누어 THP-1 식세포에서 글라 브라 셀.
5. 공 초점 라스를 사용하여 세포 내 복제 모니터링어 스캐닝 현미경
- 제 1 절에서 설명하는 단계에 따라 2 ~ 4 잘 챔버 슬라이드의 각 웰에있는 PMA 처리 된 5 × 5 THP-1 세포를 배정하고 12 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다.
- 데워진 RPMI-1640 완전 배지와 오래 된 매체를 교체하고 세포를 12 시간 동안 PMA 처리를 복구 할 수 있습니다.
- GFP를 준비 (녹색 형광 단백질) C.에게 - 태그 글라 브라 세포 현탁액 2 항에서 기술과 1의 MOI에 THP-1 대식 세포에 감염으로. 만약 C. GFP를 표현하는 FITC (플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트)으로 표시 효모 세포는 초기 이벤트가 감염 즉 게시 모니터링하는 데 사용할 수있는 사용할 수없는 글라 브라는 변종. 식균 작용의 속도와 2 시간에 phagolysosomal 성숙.
- , 5 % CO 2와 37 ° C에서 2 시간 동안 슬라이드를 품어 매체를 삭제하고 무균으로 배를 씻어 신중하게 반전, PBS는 데워진.
- 500 μL는 RPMI-1640 완전한 메디 데워진 추가음 하나의 슬라이드의 각 실에 22 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 그것을 품어.
- 2 시간의 C.를 해결하려면 글라 브라에 감염된 THP-1 식세포, 다른 슬라이드의 각 실에 (PBS에서 준비) 3.7 %의 포름 알데히드 500 μl를 추가하고 어둠 속에서 20 분 동안 실온에서 그것을 품어.
- 워시, PBS로 세 번 슬라이드 500 μL 트리톤-X (0.7 %)를 추가하고, 어둠 속에서 5 분 실온에서 알을 품다.
- PBS로 세척 슬라이드 배는, 문화의 슬라이드에서 챔버를 제거하고 공기 어둠 속에서 3 ~ 5 분 동안 건조.
- 정중 기포 형성을 회피 슬라이드 DAPI를 포함 Vectashield 장착 매체 (4 ',6-diamidino-2-페닐 인돌)를 사용하여 커버 슬립을 장착. 부드럽게 킴 와이프로 물기를 제거하고 손톱 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. 4 ° C에서 사용할 때까지의 어둠에 보관 슬라이드.
- 반복 THP-1 세포에게 24 시간 후 감염을 처리하기 위해 5.4 5.6-5.9 단계를 반복합니다.
- 레이저 스캐닝 confo를 이용한 이미지 셀칼 현미경 (60X 기름 침지 목표, DAPI 및 GFP의 얼룩에 대한 405 nm의 및 488 nm에서 여기, 각각).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
감염 C.와 PMA 처리 THP-1 대식 세포의 분석 글라 브라 야생형 (중량) 세포는 중량 세포가 2 시간의 coincubation 후 55-65%의 속도로 대 식세포에 의해 포식 것으로 나타났다. 또한, C. 글라 브라 세포는 THP-1 식세포에 의해 살해를 저항 할 수 있었고, 적당한 5을 시행 - THP-1 식세포 8 공동 배양 24 시간 후 CFUs의 7 배 증가. THP-1 식세포에서 GFP-발현 플라스미드로 형질 전환 된 야생형 세포의 세포 복제는 THP-1 식세포 당 세포 효모 세포의 수가 걸쳐 7-12에 하나 또는 두 증가 상기 공 초점 형광 현미경으로 확인 하였다 24 시간의 (그림 1).
그림 1. 고정 된 포름 알데히드의 공 초점 이미지, GFP - 태그 C. . 핵은 각각 2 시간과 24 시간에 1-2 및 5-8 효모를 숨겨 THP-1 세포와 세포 내 복제를 표시 글라 브라에 감염된 THP-1 식세포는 DAPI로 염색된다. 바 = 10 μm의.
그림 2. C.의 도식 표현 서명 태그 돌연변이 유발을 통해 THP-1 식세포에서 변경된 생존의 프로필을위한 글라 브라 돌연변이 체 라이브러리 화면 (STM) 방식. 빨강과 하이브리드 막에 녹색 원이 감소 나타 내기 및 입력 샘플에 비해 출력 샘플에 각각 태그의 높은 표현입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
선천성 면역계는 편의적 진균 감염의 조절에 중요한 역할을한다. 대 식세포는 섭취와 곰팡이 병원균의 파괴에 의해 방어 항진균제에 기여한다. 따라서, 생존 및 / 또는 대 식세포의 항균 기능을 반작용에 필요한 요인의 해명은 곰팡이 독성 전략에 대한 우리의 이해를 진행합니다. 이러한 상황에서, 우리는 인간 편의적 진균 병원체 C.의 상호 작용을 특성화하기 위해 인간 단구 세포주 THP-1 유래의 대 식세포를 사용하여 시험 관내 세포 배양 모델 시스템을 설립 호스트 식세포 세포와 글라 브라. 이 THP-1 대식 모델 시스템이 성공적 C.를 식별하는 데 사용되었지만 칸디다 8의 쥐 모델에서 감쇠 독성을 표시 감소 생존 글라 브라 돌연변이,이 시스템의 그럴듯한 제한, 따라서, 얻어진 결과는 고립 된 상황이고하지 않을 수 있습니다항상 복잡한 포유 동물 숙주의 면역 시스템에 적용 가능. 또한,이 시스템은 살아있는 세포 이미징 방법과는 달리, 하나 THP1 - 대 식세포에 의해 흡수 또는 식균 작용 동안 사망하지 않는 효모 세포를 설명 할 수 없습니다.
이 프로토콜의 의미는 단순, 재현성 및 확장에있다. 이 방법은 96 - 웰 플레이트에 축소 및 150 ㎠의 조직 문화 플라스크에까지 확장 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 접시 당 100 ~ 200 효모 식민지를 얻기 위해 적절한 해물 희석 세포 복제 및 도금을 최소화하기 위해 적절한 MOI 광범위한 PBS 세척의 선택입니다. 0.1의 MOI 이상적 세포 효모 세포의 수가 C.과 THP-1 식세포의 공동 배양이 장기간 동안 유지되는 최소 24 시간의 기간 동안 세포 복제를 모니터링하도록 적응된다 글라 브라 셀. 또한, 1.0의 MOI가의 최대 수를 시각화하기에 최적입니다
특히 세포 생존 / 복제를 열거하려면 CFU 비교 2 시간 이상 시간이 지점에서 그에서 내면화 효모의 수 사이에해야한다. 초기 부착 및 탐식 요금은 다른 균주에 대해 서로 다른 경우 0 시간의 CFUs과의 비교는 결과가 왜곡됩니다. 이는 감염 기간 동안 세포 내 효모 세포의 개수는 또한 유동 세포 계측법 및 공 초점 / 생균 촬상 현미경 방법에 의해 측정 될 수 있음을 여기에 주목할 만하다.
또한, 세포 내 효모 recove상이한 시점에서 적색이 프로토콜을 이용하여 감염 현미경, 반응성 산소 종 (ROS)의 축적, 염색질 추출하고, RNA 및 단백질 분리 후성을 분별하는, 전사, 및 C. 글라 브라 세포의 대사 반응 등 여러 분석에 사용될 수 남기 대식 세포 내부 환경에. 그것은 완전히 식세포 내면화 효모에 모든 생화학 적 분석을 수행하기 전에 세포, 효모 및 대식 세포 파편을 제거하는 것이 중요하다.
이 체외 세포 배양 모델 시스템의 다른 응용 프로그램은 개별적으로 또는 서명 태그 돌연변이 (STM) 접근 방식을 통해 96 계통의 풀 다중화, 변경된 생존의 프로필을위한 화면 돌연변이에의 적응성이다. STM 전략의 장점은 하나의 실험에서 돌연변이 수백 병렬 스크리닝이다. 이 접근법은 최근 C. 스크린하는 데 사용되었다 글라 브라 돌연변이 리18350 랜덤 테네시 7 삽입 돌연변이로 구성하고 각 풀 96 고유 올리고-태그 변이체 13 '(15)로 구성되는 것을 특징으로 192 풀 전체에 조립 brary는. 2 도식적 세 이루어져 STM 화면 방법론의 개요를 도시하는데,도 주요 단계. 첫째, 96 C.의 하룻밤 자란 풀 글라 브라 돌연변이 풍부한 배지 (입력) 또는 24 - 웰 조직 배양 접시에 THP-1 식세포에 감염된 배양 중 하나이다. 2 시간 감염 후 세포 효모 세포는 PBS 세척에 의해 제거하고 감염된 THP-1 세포를 37 ℃에서 배양 24 시간 후 감염, 세포 내 효모 세포 (출력) THP-1 세포의 osmolysis에 의해 회수된다. 두 번째 단계는 프림을 사용 32 P-표지 된 dCTP 독특한 서명 태그 증폭 하였다 입력 및 출력 샘플로부터 게놈 DNA의 추출을 포함ERS 각각의 고유 한 올리고 뉴클레오티드의 순서를 측면에서는 불변 영역을 보완. 셋째, 입력 및 출력 풀에서 방사성 동위 원소 표지 된 태그는 96 플라스미드 고유 한 서명 태그를 들고 각을 포함하는 하이 본드 - 나일론 막에 하이브리드된다. 독특한 올리고 뉴클레오티드 시퀀스에 대한 하이브리드 신호는 96 돌연변이의 수영장에서, 특정 태그를 들고 돌연변이 균주의 풍요 로움을 반영한다. 각 태그에 대한 입력 (IP) 비 출력 (OP)가 입력 신호의 강도에서의 출력 신호 강도를 나누어 계산된다. 표시 돌연변이는 적어도 높은 6 배 낮은 생존 (그림 각각 '업'으로 간주 (OP / IP = 6.0, 생존을 증가)와 '아래'(OP / IP = 0.1, 감소 생존) 돌연변이 수 10 배 2). 대안 적으로, 형광 표지 된 프로브 - 의존 DNA 마이크로 어레이는 세포 내 난연성 거울 입력의 태그 및 출력 샘플의 신호 세기에서 임의의 변화를 결정하는데 사용될 수있다돌연변이의 IOR.
이 방법은 ROS 및 사이토 카인 반응과 곰팡이 병원균 감염시 식세포의 phagolysosomal 산성화을 연구하기 위해 사용될 수있다. 마지막으로, 모두에이 절차의 적응성 때문에, 일차 전지뿐만 아니라 진균 등 다양한 면역 세포의 종류,이 프로토콜은 호스트 곰팡이의 상호 작용의 여러 측면을 해결하기에 적합하다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은, 생명 공학, 인도, DNA 지문 및 진단을위한 센터의 핵심 자금의 정부 부서의 혁신적인 젊은 Biotechnologist 상 BT/BI/12/040/2005 및 BT/PR13289/BRB/10/745/2009 보조금에 의해 지원되었다 하이 데 라 바드. MNR 및 GB는 주니어와 마니 팔 대학의 박사 학위의 추구를 향한 과학 산업 연구위원회의 선임 연구 장학금의 수혜자입니다. SB는 마니 팔 대학의 박사 학위를 추구으로 주니어 공학학과의 수석 연구 활동의받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
References
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
- Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
- Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
- Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
- Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
- Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
- Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
- Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
- Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
- Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
- Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
- Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
- Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
- Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).
