Summary
Der aktuelle Artikel beschreibt ein Protokoll, um eine In-vitro-Zellkultur-Modellsystem, um die Interaktion einer fakultativ intrazellulären Humanfunguspathogen Candida glabrata mit menschlichen Makrophagen, die ein nützliches Werkzeug, um unser Wissen von Pilz Virulenzmechanismen voranzubringen studieren zu etablieren.
Abstract
Eine Zellkultur-Modellsystem, wenn ein enger Mimik von Host-Umweltbedingungen können als preiswerte, reproduzierbare und leicht manipulierbare Alternative zu Tiermodellsysteme für die Untersuchung von einem bestimmten Schritt der mikrobielle Erreger der Infektion dienen. Eine menschliche Monozyten-Zelllinie THP-1, welche bei Phorbolester-Behandlung wird in Makrophagen unterscheiden, wurde bereits früher verwendet, um die Virulenz Strategien vieler intrazelluläre Erreger wie Mycobacterium tuberculosis studieren. Hier ein Protokoll, ein in vitro Zellkulturmodell zu erlassen diskutieren wir System mit THP-1 Makrophagen, um die Wechselwirkung eines opportunistischen Pathogens menschlichen Hefe Candida glabrata mit Host phagozytischen Zellen abzugrenzen. Dieses Modellsystem ist einfach, schnell, offen für Hochdurchsatz-Mutante Bildschirme, und erfordert keine hoch entwickelten Geräten. Eine typische THP-1-Makrophagen-Infektionsversuch dauert ca. 24 Stunden mit einer zusätzlichen Stunde 24-48 wiederhergestellt intrazellulären ermöglichenHefe auf reichen Medium für koloniebildende Einheit-basierte Analyse Rentabilität wachsen. Wie andere in-vitro-Modellsysteme, ist eine mögliche Einschränkung dieses Ansatzes Schwierigkeiten bei Extrapolation der zu einer sehr komplexen Immunzellschaltkreis in den menschlichen Wirt vorhandenen erzielten Ergebnisse. Trotz dieser, ist jedoch die aktuelle Protokoll sehr nützlich, um die Strategien, die eine Pilzerreger verwenden kann, zu umgehen / entgegenzuwirken antimikrobielle Reaktion und zu überleben, anzupassen, und vermehren sich in den nährstoffarmen Umfeld von Wirtsimmunzellen aufzuklären.
Introduction
Candida-Spezies sind die führende Ursache von lebensbedrohlichen invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten ein. Candida glabrata, einer aufstrebenden nosokomiale Erreger, ist die zweite oder dritte am häufigsten isolierten Candida-Spezies aus Intensivstation Patienten, abhängig von der geographischen Lage 3.1. Phylogenetisch, C. glabrata, einem haploiden Hefezellen, enger mit den nicht pathogenen Modell Hefe Saccharomyces cerevisiae als pathogene Candida spp. einschließlich C. 4 albicans. In Übereinstimmung damit, C. glabrata fehlen einige Schlüsselpilz Virulenz inklusive Gegen, sekretierten proteolytischen Aktivität und morphologische Plastizität 4-5.
Obwohl C. glabrata bildet keine Hyphen, es zu überleben und zu replizieren in murinen und humanen Makrophagen 6-8 was darauf hindeutet, dass es einzigartig Pathogenese-Mechanismen entwickelt wurden, können. Nur begrenzte Informationen über die Strategien zur Verfügung, die C. glabrata beschäftigt, um zu überleben nährstoffarmen intrazellulären Makrophagen Umwelt und oxidative und nicht-oxidative entgegenzuwirken Wirtsreaktionen von Immunzellen 5 montiert. Ein entsprechendes Modell Makrophagen-System ist eine Voraussetzung, um die Wechselwirkung von C abgrenzen glabrata mit Wirts Phagozyten über funktionelle Genom-und Proteom-Ansätzen. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) des humanen und murinen Ursprungs sind, sind früher verwendet worden, um die Wechselwirkung von C zu studieren glabrata mit Wirtsimmunzellen 7,9. , Schwierigkeiten bei der Beschaffung von PBMCs und BMDMs, ihre begrenzte Lebensdauer und intrinsische Unterschiede zwischen den verschiedenen Säugetier Spender beschränken jedoch die Verwendung dieser Zellen als vielseitige Modellsysteme.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung eines in vitro-System, das intracellul studierenar Verhalten von C. glabrata Zellen in Makrophagen aus menschlichen Monozyten-Zelllinie THP-1 abgeleitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls war es, eine einfache, kostengünstige, schnelle und reproduzierbare Zellkultur-Modellsystem, die leicht manipuliert werden kann, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pilz-Pathogen-Interaktion untersuchen zu erlassen.
THP-1-Zellen wurden bereits verwendet, um die Immunantwort gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze 10-12 entziffern. Monozytären THP-1-Zellen sind leicht zu pflegen und kann unterschieden werden, bei Phorbolester-Behandlung, um Makrophagen, Monozyten-Makrophagen der menschlichen Mimik und Express entsprechenden Makrophagen-Marker 13. Die wichtigsten Vorteile der THP-1-Makrophagen-Modellsystem sind die einfache Bedienbarkeit und das Fehlen von hoch entwickelten Geräten Anforderung.
Die hier vorgestellte Protokoll ist leicht anpassbar, um die Interaktion von anderen menschlichen Pilzerreger mit hos studierenT-Immunzellen. Das derzeitige Verfahren kann auch eingesetzt werden, um Virulenzfaktoren für die Krankheitserreger von Interesse mit hohem Durchsatz nach Mutanten zu identifizieren. Diese Proof-of-concept wurde durch die erfolgreiche Anwendung von THP-1-Kulturmodellsystem, um einen Satz von 56 Genen, die für das Überleben von C. glabrata in humanen Makrophagen 8 erforderlich sind beispielhaft zu identifizieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Es wird empfohlen, C auszuführen glabrata Infektionsversuche im Labor mit Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2).
- Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monoschicht.
- Vorbereitung von C. glabrata Zellsuspension.
- Infektion von THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata-Zellen.
- Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über koloniebildende Einheit-Assay.
- Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie.
1. Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monolayer
- THP-1 ist eine menschliche Monozyten-Zelllinie aus dem peripheren Blut eines 1-jährigen männlichen Kind leidet unter akuter Monozytenleukämie 14 abgeleitet. THP-1-Zelllinie wurde eine Suspension, wird routinemäßig bei 37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 in RPMI-1640-Kulturmedium mit 10% FBS (fötales Rinderserum) ergänzt gehalten. Die Behandlung mit Phorbol 12-myristate 13-Acetat (PMA, ein Phorbolester) führt die terminale Differenzierung von THP-1 Monozyten zu Makrophagen. Wichtig ist, dass PMA-Behandlung keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen und differenzierten Zellen nicht teilen.
- Samen ungefähr 1,5 x 10 6 THP-1 Monozyten in 100 mm Kulturschalen in RPMI-1640-Vollmedium (RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% Serum, 2 mM Glutamin und Antibiotika 1x; 10 ml / Schale) und lassen Zellen wachsen bei 37 ° C in 5% CO 2 für 2 Tage.
- Sobald THP-1-Zellen haben eine Dichte von 8 x 10 5 Zellen / ml erreicht, übertragen Sie die Kulturschale zu der Zellkultur Laminarströmungshaube und schwenken Sie es ständiger Zellen resuspendieren.
- Pipettieren Sie die Zellsuspension aus, legen Sie in eine 15 ml sterilen Röhrchen und Zentrifuge bei 1000 rpm (130 xg) für 4 min. Überstand verwerfen und aussetzen THP-1-Zellpellet in 5 ml frisches, vorgewärmt, RPMI-1640-Komplettmedium.
- Auflisten von Zellen mit einer Zählkammer und verdünnt das cell Suspension auf eine endgültige Dichte von 10 6 Zellen / ml mit vorgewärmten RPMI 1640 Komplettmedium
- 1 ul von 160 mM PMA Lager (Phorbol-12-Myristate 13-Acetat-Lösung in Dimethylsulfoxid hergestellt) in 10 ml THP-1-Zellsuspension (Endkonzentration 16 nM) und gut mischen. Verzichten 1 ml Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 12 h gehalten.
- Entfernen Sie alte Medium, 1 ml vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen für 12 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 zu erholen.
- Beachten Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop zu gewährleisten, dass ovale THP-1 Monozyten-Zellen in Suspension wurden in abgeflacht spindelförmige und haftende Makrophagen differenziert. Diese differenzierten Zellen sind nun bereit, C führen glabrata Infektionsstudien.
2. Vorbereitung von C. glabrata & #160; Zellsuspension
C. glabrata Wildtyp-Stamm Bg2 werden zur THP-1-Makrophagen infizieren werden. C glabrata Zellen in flüssigem YPD (Hefeextrakt (1%), Pepton (2%)-Dextrose (2%)) Medium routinemßig kultiviert. Solide YPD-Medium wird durch Zugabe von 2% Agar vor dem Autoklavieren Medium vorbereitet.
- Um eine Kultur von C. vorbereiten glabrata, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus dem Agar-Platte mit einer sterilen Einweg-Schleife und impfen in 10 ml YPD-Flüssigmedium und Inkubation für 14-16 h mit Schütteln (200 rpm) bei 30 ° C
- Zentrifuge dieser Kultur (1 ml) bei 4000 Upm (1800 × g) für 5 min in einer Tischmikrozentrifuge, waschen Sie die Zellen dreimal mit sterilem PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4) und Aussetzung Zellpellet in 1 ml PBS.
- Messung der OD 600 C. glabrata Zellsuspension verdünnt und mit einem geeigneten Volumen an steriler PBS auf eine Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten (OD 600= 0.1). Alternativ kann die gewünschte Zelldichte durch Zählen Hefezellen mit einer Zählkammer erreicht werden.
3. Infektion von THP-1 Makrophagen mit C. glabrata Zellen
- In 50 ul C. glabrata Zellsuspension auf THP-1-Makrophagen (10 6 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte), um ein MOI (Multiplizität der Infektion) von 0,1 zu erhalten, und Inkubieren Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Um lebensfähig Hefe zählt zu bestimmen, verdünnte 50 ul C. glabrata Zellsuspension 100-fach in sterilem PBS und Platte 100 ul auf YPD-Festmedium. Platten bei 30 ° C und zählen die Anzahl der manuell Hefe-Kolonien nach 1-2 Tagen erscheinen. Diese Zahlen werden von nun an, wie hr 0 C bezeichnet werden glabrata KBE (koloniebildende Einheiten).
- Nach 2 h Co-Kultivierung von THP-1-Zellen mit C. glabrata Zellen, Ablagekulturmedium durch Umkehren 24-Loch-Gewebekulturplatte ina Reservoir und vorsichtig waschen dreimal mit sterilem PBS auf vorgewärmten nonphagocytosed extrazellulären C entfernen glabrata-Zellen. Schonwaschschritten mit PBS sind absolut notwendig, um eine vollständige Entfernung aller extrazellulären Hefe, ohne dass Schäden an der THP-1-Makrophagen-Monolage zu erreichen.
4. Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über Kolonie bildende Einheit Assay
- Lyse C. glabrata THP-1-infizierten Makrophagen in 1 ml sterilem H 2 O 2 min, kratzen sanft auf die Makrophagen-Ablagerungen aus dem Bohrloch zu entfernen und sammeln Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mikroskopische Prüfung von kompletten Makrophagen-Lyse ist entscheidend für die Wiederherstellung aller verinnerlicht Hefe.
- Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung des Lysats in sterilem PBS, Platte 100 ul auf YPD-Festmedium Platten und Inkubation bei 30 ° C
- Nach 1-2 Tagen rechnen manuell die Anzahl der C glabrata Kolonien, aperschien auf YPD-Medium, multiplizieren mit Verdünnungsfaktor (2 Std. KBE) und berechnen Phagozytose Geschwindigkeit, die der Prozent der C bezieht sich glabrata Zellen, THP-1 durch Makrophagen nach 2 h Koinkubation aufgenommen unter Verwendung der folgenden Formel.
% Phagozytose = [(KBE bei 2 h) / (CFU bei 0 h)] x 100 - Um die Rate der intrazellulären Replikation von C messen glabrata Zellen in THP-1-Makrophagen, sammeln intrazellulären Hefe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, dh. 4, 6, 8, 10, 12 und 24 h, durch Wiederholen der Schritte von 3,3 bis 4,3.
- Berechnen fach Überleben / Replikation von C. glabrata Zellen THP-1 in Makrophagen durch Division der Gesamtzahl CFUs zu einem bestimmten Zeitpunkt mit den in 2 h (phagozytiert Hefe).
5. Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie
- Nach den in Abschnitt 1 beschriebenen Schritte, Saatgut PMA-behandelten 5 x 10 5 THP-1-Zellen in jeder Vertiefung von zwei vier-und Kammer-Objektträgern und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 12 Stunden.
- Ersetzen Sie alte Medium mit vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen aus PMA-Behandlung für 12 Stunden zu erholen.
- Bereiten GFP (green fluorescent protein)-markierten C glabrata Zellsuspension, wie in Abschnitt 2 beschrieben, und infizieren zu THP-1-Makrophagen zu einer MOI von 1. Wenn C. glabrata GFP-exprimierenden Stämme sind nicht verfügbar, Hefe-Zellen mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markiert ist, kann verwendet werden, um zu überwachen frühen Ereignisse nach der Infektion nämlich. Phagozytose Rate und phagolysosomale Reifung bei 2 Stunden.
- Folien für 2 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2, invertieren sie sorgfältig zu waschen Medium verwerfen und 3x mit sterilem, vorgewärmtes PBS.
- Add 500 ul vorgewärmten RPMI-1640-Komplett mediUM zu jeder Kammer von einer Folie und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 22 Stunden.
- Um dies zu beheben 2 h C glabrata-THP-1-infizierten Makrophagen, 500 ul 3,7% Formaldehyd (in PBS) zu jeder Kammer des anderen Schlitten und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln.
- Wash schieben dreimal mit PBS, 500 ul Triton-X (0,7%), und bei Raumtemperatur für 5 min im Dunkeln.
- Wash Rutsche 3x mit PBS, entfernen Kammer von Kulturträger und Luft trocknen Sie es für 3-5 min im Dunkeln.
- Vorsichtig aufsetzen eines Deckglases mit Vectashield Montage-Medium mit DAPI (4 ',6-Diamino-2-phenylindol) auf Folie Blasenbildung zu vermeiden. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit mit Kimwipe und dichten Deck Ränder mit Nagellack. Schiebespeicher im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Wiederholen Sie die Schritte 5,4 und von 5,6 bis 5,9 zu verarbeiten THP-1-Zellen 24 Stunden nach der Infektion.
- Bildzellen unter Verwendung eines Laser-Scanning-confoMikroskope (60X Ölimmersionsobjektiv, Anregung bei 405 nm und 488 nm für DAPI und GFP-Färbung, beziehungsweise).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Infektion Analysen von PMA-behandelten THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata Wildtyp (wt)-Zellen ergab, dass Gew. Zellen durch Makrophagen mit einer Rate von 55-65% nach 2 h Koinkubation phagozytiert. Weitere, C. glabrata Zellen konnten Tötung von THP-1-Makrophagen wider und unterzog sich einer moderaten 5 - bis 7-fachen Anstieg der KBE nach 24 h Kokultur mit THP-1-Makrophagen 8. Intrazelluläre Replikation von Wildtyp-Zellen, transformiert mit GFP-exprimierenden Plasmid, in THP-1 Makrophagen wurde auch mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, wobei die Anzahl der intrazellulären Hefezellen pro THP-1 Makrophagen erhöht von einem oder zwei sieben bis zwölf über einen Zeitraum verifiziert von 24 h (Fig. 1).
Abbildung 1. Ein konfokales Bild von Formaldehyd fixiert, GFP-markierten C glabrata-THP-1-infizierten Makrophagen Anzeigen intrazelluläre Replikation mit THP-1-Zellen, Hefe 1-2 und 5-8 in 2 h und 24 h auf. Kerne sind mit DAPI gefärbt. Bar = 10 um.
2. Schematische Darstellung des C. glabrata Mutantenbibliothek Bildschirm für veränderte Lebens Profile in THP-1-Makrophagen über Signatur-tagged-Mutagenese (STM)-Ansatz. Rote und grüne Kreise auf hybridisierten Membranen bezeichnen reduziert und erhöhten Darstellung der Tags, bzw. in Ausgangs-Proben im Vergleich zum Eingangs Proben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von opportunistischen Pilzinfektionen. Makrophagen tragen zur Verteidigung durch die Einnahme und Zerstörung der Pilzerreger Antimykotika. Somit wird Aufklärung von Faktoren, die für das Überleben und / oder Bekämpfung der antimikrobiellen Funktionen erforderlich sind Makrophagen unser Verständnis von Pilz Virulenz Strategien voraus. In diesem Zusammenhang haben wir ein in-vitro-Zellkultur-Modellsystem unter Verwendung von Makrophagen aus einem menschlichen Monozyten-Zellinie THP-1 abgeleitet werden, um die Interaktion eines menschlichen opportunistische Pilzerreger C. Charakterisierung fest glabrata mit Wirtsfresszellen. Obwohl diese THP-1-Makrophagen-Modellsystem wurde erfolgreich verwendet, um C zu identifizieren glabrata Mutanten mit verringerter Lebens die abgeschwächte Virulenz in einem Mausmodell der systemischen Candidiasis 8 dargestellt, ist eine plausible Einschränkung dieses System seine isolierten Rahmen und somit erhaltenen Ergebnisse können nichtimmer auf den Komplex Säugerwirtsimmunsystem sein. Weiterhin ist dieses System, im Gegensatz zu lebenden Zellen-bildgebenden Verfahren ist nicht für die Hefe-Zellen, die entweder nicht von THP1-Makrophagen aufgenommen oder während der Phagozytose getötet zu berücksichtigen.
Die Bedeutung dieses Protokolls liegt in seiner Einfachheit, Reproduzierbarkeit und die Skalierbarkeit. Das Verfahren kann auf eine 96-Well-Platte skaliert und bis zu 150 cm 2-Gewebekulturkolben skaliert werden. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die Auswahl eines geeigneten MOI und umfangreichen PBS-Waschungen an extrazelluläre Replikation und Beschichtung von entsprechenden Lysat Verdünnung zu minimieren, um 100-200 Hefe-Kolonien pro Platte zu erhalten. Eine MOI von 0,1 ist ideal geeignet, um die intrazelluläre Replikation über einen Zeitraum von 24 Stunden zu überwachen, wie die Anzahl der extrazellulären Hefezellen minimal bleibt während dieser langen Co-Kultivierung von THP-1-Makrophagen mit C. glabrata-Zellen. Ferner wird eine MOI von 1,0 optimal für die Visualisierung der maximalen Anzahl von
Speziell aufzuzählen intrazelluläres Überleben / Replikation sollte CFU Vergleich zwischen der Anzahl der internalisierten Hefe in 2 h und die zu späteren Zeitpunkten erfolgen. Der Vergleich mit 0 hr KBE wird die Ergebnisse verzerren, wenn anfängliche Bindung und Phagozytose Raten sind für verschiedene Stämme. Es ist hier bemerkenswert, dass die Anzahl der intrazellulären Hefezellen während des Infektionszeitraums kann auch mittels Durchflusszytometrie und konfokaler / Mikroskopie lebender Zellen Ansätze gemessen werden.
Zusätzlich intrazellulären Hefe Recoverot zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion mit diesem Protokoll kann für mehrere Analysen einschließlich Mikroskopie, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Akkumulation, Chromatin-Extraktion und RNA-und Proteinisolierung, um die epigenetischen zu erkennen, Transkriptions-und Stoffwechselreaktion von C. glabrata Zellen verwendet werden auf die Makrophagen innere Milieu. Es ist wichtig, das die extrazelluläre Hefe und die Makrophagen Schmutz vollständig zu eliminieren, bevor jede biochemische Analytik auf Makrophagen internalisiert Hefe.
Eine weitere Anwendung dieser in-vitro Zellkulturmodell Systems ist seine Anpassungsfähigkeit an Bildschirm-Mutanten für veränderte Lebens Profile, entweder einzeln oder in einem Pool von 96 Stämmen mit Signatur-tagged-Mutagenese (STM)-Ansatz gemultiplext. Ein Vorteil der STM-Strategie ist die parallele Screening von Hunderten von Mutanten in einem einzigen Experiment. Dieser Ansatz wurde kürzlich verwendet, um ein C zu screenen glabrata Mutante lithek, die von 18.350 zufällig Tn 7 Insertionsmutanten besteht und in insgesamt 192 Pools, wobei jeder Pool ist von 96 eindeutig Oligonukleotid-markierten Mutanten 8 '15 zusammengebaut. Abbildung 2 veranschaulicht bildhaft die Umrisse des STM-Bildschirm Methodik, die von drei aus Hauptschritte. Zunächst wird eine Nacht wachsenen Pool von 96 C. glabrata Mutanten entweder in Vollmedium (Eingang) oder THP-1-Makrophagen in einer 24-Well-Gewebekulturplatte infiziert kultiviert. Nach 2 Stunden der Infektion werden die extrazellulären Hefezellen durch Waschungen mit PBS entfernt und die infizierten THP-1-Zellen werden bei 37 ° C inkubiert, 24 Stunden nach der Infektion, intrazelluläre Hefezellen (Ausgang) durch Osmolyse von THP-1-Zellen gewonnen. Der zweite Schritt beinhaltet die Extraktion von genomischer DNA aus Eingangs-und Ausgangs-Proben, gefolgt von Amplifikation der einzigartigen Signaturmarkierungen mit 32 P-markiertem dCTP unter Verwendung primten, die komplementär zu der invarianten Region flankieren jede eindeutige Oligonukleotid-Sequenz. Drittens werden radioaktiv markierte Tags aus Eingangs-und Ausgangspools auf eine Hybond-Nylon-Membran, die jede eine einzigartige Signatur-Tag 96 Plasmide enthält, hybridisiert. Hybridisierungssignal für eine einzigartige Oligonukleotid-Sequenz spiegelt die Fülle des Mutantenstammes, die Durchführung, dass insbesondere Tag, in einem Pool von 96 Mutanten. Ausgang (OP) zu Eingang (Ip)-Wert für jede Variable wird durch Teilen der Ausgangssignalintensität durch die Eingangssignalintensität berechnet. Mutanten Anzeigen mindestens 6-fach höher und 10-fach niedrigere Überlebens kann als "hoch" angesehen werden (Op / Ip = 6.0, erhöhte Überlebensrate) und "unten" (Op / Ip = 0,1, reduzierte Überlebensrate) Mutanten, bzw. (Abbildung 2). Alternativ können fluoreszenzmarkierte Sonde-abhängige DNA-Mikroarrays verwendet werden, um eine Variation in der Signalintensität der Markierung in der Eingangs-und der Ausgangsprobe, die die intrazelluläre Spiegel Verhalten bestimmen,ior der Mutante.
Dieses Verfahren kann auch eingesetzt werden, um ROS-und Cytokin-Antwort und phagolysosomalen Ansäuerung phagozytierenden Zellen nach Infektion mit Pilzpathogene zu studieren. Schließlich ist durch die Anpassung dieses Verfahrens an beide, verschiedene Immunzelltypen, einschließlich primärer Zellen und Pilzorganismen ist dieses Protokoll geeignet ist, verschiedene Aspekte der Host-Pilz Adresse Interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Innovative Junge Biotechnologist Auszeichnung BT/BI/12/040/2005 und BT/PR13289/BRB/10/745/2009 Zuschuss von Department für Biotechnologie, Regierung von Indien und Kernfonds, des Zentrums für DNA-Fingerprinting and Diagnostics unterstützt werden, Hyderabad. MNR und GB sind die Empfänger von Junior und Senior Research Fellowships des Rates für Wissenschaftliche und Industrielle Forschung auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University. SB ist der Empfänger von Junior und Senior Research Fellowship des Department für Biotechnologie auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
References
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
- Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
- Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
- Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
- Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
- Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
- Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
- Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
- Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
- Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
- Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
- Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
- Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
- Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).
