Abstract
En cellkulturmodell system, om en nära imitatör av värdmiljöförhållanden, kan fungera som en billig, reproducerbara och lätt manövrerbar alternativ till djurmodellsystem för studier av ett specifikt steg av mikrobiell patogen infektion. En human monocytisk cellinje THP-1 som vid forbolester behandling, är differentierad i makrofager, har tidigare använts för att studera virulens strategier för många intracellulära patogener inklusive Mycobacterium tuberculosis. Här diskuterar vi ett protokoll för att anta en cellodling in vitro-modell system med THP-1 makrofager att beskriva interaktionen av en opportunistisk human jäst patogenen Candida glabrata med värd fagocytiska celler. Detta modellsystem är enkelt, snabbt, mottaglig för hög kapacitet mutant skärmar, och kräver ingen avancerad utrustning. En typisk THP-1 makrofag infektion experiment tar ca 24 tim med ytterligare 24-48 timmar för att tillåta återhämtat intracellulärajäst att växa på rikt medium för kolonibildande enhet-baserade lönsamheten analys. Liksom andra in vitro modellsystem, är en möjlig begränsning av detta tillvägagångssätt svårt att extrapolera resultaten som uppnåtts till en mycket komplex immunceller kretsar som finns i den mänskliga värden. Men trots detta är det nuvarande protokollet mycket värdefullt att belysa de strategier som en svamp patogen kan använda för att undvika / motverka antimikrobiell respons och överleva, anpassa sig och föröka sig i den näringsfattiga miljön i värdimmunceller.
Introduction
Candida är den vanligaste orsaken till livshotande invasiva svampinfektioner hos patienter med nedsatt immunförsvar 1. Candida glabrata, en framväxande nosokomial patogen, är andra eller tredje mest isolerade Candida arter från Unit intensivvårdspatienter beroende på geografiskt läge 1-3. Fylogenetiskt C. glabrata, en haploid spirande jäst, är närmare släkt med de icke patogena modell jästen Saccharomyces cerevisiae än till patogena Candida spp. inklusive C. albicans 4. I överensstämmelse med detta, C. glabrata saknar några viktiga svamp virulens drag inklusive parning, utsöndrat proteolytiska aktiviteten och morfologisk plasticitet 4-5.
Trots att C. glabrata bildar inte hyfer, kan den överleva och replikera i murina och humana makrofager 6-8 tyder på att det har utvecklat unika patogenes mekanismer. Begränsad information finns tillgänglig om de strategier som C. glabrata sysselsätter överleva näringsfattiga intracellulära makrofager miljö och motverka oxidativ och icke-oxidativ värdsvar monteras värdimmunceller 5. En relevant makrofag modellsystem är en förutsättning för att avgränsa interaktionen av C. glabrata med värd fagocytceller via funktionell genomik och proteomik metoder. Perifera mononukleära blodceller (PBMC) och benmärg-härledda makrofager (BMDMs) av humant och murint ursprung, respektive, har tidigare använts för att studera interaktionen av C. glabrata med värdimmunceller 7,9. Men svårt att få PBMC och BMDMs, deras begränsade livslängd och inneboende variation mellan olika givare däggdjurs begränsa utnyttjandet av dessa celler som mångsidiga modellsystem.
Här beskriver vi ett förfarande för etablering av ett in vitro-system för att studera den intracellular beteende C. glabrata celler i makrofager som härstammar från human monocytisk cellinje THP-1. Det övergripande målet för detta protokoll var att anta en enkel, billig, snabb och reproducerbar cellodlingsmodellsystem som lätt kan manipuleras för att studera olika aspekter av värd-svamp patogen interaktion.
THP-1-celler har tidigare använts för att dechiffrera värdens immunsvar mot en rad olika patogener, inbegripet bakterier, virus och svampar 10-12. Monocytisk THP-1 celler är lätta att underhålla och kan differentieras, vid forbolester behandling, till makrofager som efterliknar monocythärledda makrofager av mänsklig och uttrycker lämpliga makrofag markörer 13. De främsta fördelarna med THP-1 makrofag modellsystem är den enkel att använda och bristen på sofistikerade krav på utrustning.
Protokollet presenteras här är lätt att anpassa för att studera interaktionen av andra humana svamppatogener med vät immunceller. Det nuvarande förfarandet kan också användas för att identifiera virulensfaktorer för patogenen av intresse med hjälp av hög genomströmning muterade skärmar. Detta proof-of-concept exemplifierades genom en framgångsrik användning av THP-1 kultur modellsystem för att identifiera en uppsättning av 56 gener som krävs för överlevnad av C. glabrata i humana makrofager 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
References
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
- Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
- Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
- Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
- Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
- Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
- Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
- Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
- Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
- Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
- Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
- Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
- Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
- Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).
