Summary
Het huidige artikel schetst een protocol bij een in vitro celcultuur model systeem om de interactie van een facultatief intracellulaire menselijke pathogene schimmel Candida glabrata met menselijke macrofagen, die een nuttig instrument om onze kennis van schimmel virulentiemechanismen vooruit zal bestuderen vestigen.
Abstract
Celkweek modelsysteem het, om nabootser host omgevingsomstandigheden, kan dienen als een goedkope, reproduceerbare en gemakkelijk manipuleerbaar alternatief diermodellen voor de studie van een specifieke stap van microbiële pathogeen infectie. Een cellijn van menselijke monocyten THP-1, die na forbolester behandeling, is onderverdeeld in macrofagen, is eerder gebruikt om virulentie strategieën van vele intracellulaire pathogenen zoals Mycobacterium tuberculosis bestuderen. Hier bespreken we een protocol bij een in vitro celkweek model vaardigen systeem met THP-1 macrofagen de interactie van een opportunistische pathogeen humaan gist Candida glabrata met menselijke fagocyten bakenen. Dit model is eenvoudig, snel, ontvankelijk voor hoog-mutant schermen, en vereist geen geavanceerde apparatuur. Een typische THP-1 macrofaag infectie experiment duurt ongeveer 24 uur met een extra 24-48 uur tot herstelde intracellulaire toestaangist om te groeien op rijk medium voor kolonievormende eenheden gebaseerd levensvatbaarheid. Als andere in vitro modelsystemen, een mogelijke beperking van deze benadering moeilijk extrapolatie van de verkregen zeer complex immuuncel circuits die in de menselijke gastheer resultaten. Echter, ondanks dit, het huidige protocol is zeer nuttig om de strategieën die een pathogene schimmel kan gebruiken om te ontwijken / tegen antimicrobiële respons en te overleven, aan te passen, en zich vermenigvuldigen in de voedselarme omgeving van gastheer immune cellen op te helderen.
Introduction
Candida-soorten zijn de belangrijkste oorzaak van levensbedreigende invasieve schimmelinfecties bij immuungecompromitteerde patiënten 1. Candida glabrata, een opkomende nosocomiale pathogeen, is de tweede of derde meest frequent geïsoleerd Candida-soorten uit patiënten Intensive Care Unit, afhankelijk van de geografische ligging 1-3. Fylogenetisch, C. glabrata, een haploïde gist, is nauwer verwant aan de niet-pathogene model gist Saccharomyces cerevisiae dan pathogene Candida spp. waaronder C. albicans 4. Consistent hiermee C. glabrata mist een aantal belangrijke schimmels virulentie eigenschappen, waaronder de paring, uitgescheiden proteolytische activiteit en morfologische plasticiteit 4-5.
Hoewel C. glabrata vormt geen schimmeldraden, het kan overleven en repliceren in muis en mens macrofagen 6-8 suggereert dat het unieke pathogenese mechanismen heeft ontwikkeld. Beperkte informatie beschikbaar is over de strategieën die C. glabrata telt overleven voedselarme intracellulaire macrofaag milieu en het tegengaan van oxidatieve en nonoxidative gastheer responsen bevestigd door gastheer immuuncellen 5. Een pertinente macrofaag modelsysteem is een voorwaarde om de interactie van C. af te bakenen glabrata met gastheer fagocytcellen via functionele genomics en proteomics aanpak. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) en beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) van humane en muriene oorsprong respectievelijk zijn eerder gebruikt om de interactie van C. bestuderen glabrata met gastheer immuuncellen 7,9. Echter, moeilijkheden bij het verkrijgen PBMCs en BMDMs, hun beperkte levensduur en intrinsieke variatie tussen verschillende donoren zoogdieren beperken het gebruik van deze cellen zo veelzijdig modelsystemen.
Hier beschrijven we een methode voor het opstellen van een in vitro systeem om de intracellul studerenar gedrag van C. glabrata cellen macrofagen afkomstig van menselijke monocytische cellijn THP-1. De algemene doelstelling van dit protocol was om een eenvoudige, goedkope, snelle en reproduceerbare celcultuurmodel systeem dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om verschillende aspecten van gastheer-pathogene schimmel interactie te bestuderen vaardigen.
THP-1-cellen zijn eerder gebruikt om de immuunrespons tegen een groot aantal pathogenen zoals bacteriën, virussen en schimmels 10-12 ontcijferen. Monocytische THP-1 cellen zijn gemakkelijk te onderhouden en kunnen worden onderscheiden, op forbolester behandeling, tot macrofagen die-monocyten afgeleide macrofagen van de menselijke na te bootsen en te uiten passende macrofaag markers 13. De belangrijkste voordelen van THP-1 macrofagen modelsysteem zijn het gemak-of-gebruik en het ontbreken van geavanceerde apparatuur vereiste.
De hier gepresenteerde protocol gemakkelijk aan de interactie van andere menselijke schimmels met hos bestuderent immuuncellen. De huidige procedure kan ook worden gebruikt om virulentie te identificeren voor het organisme van belang met behulp van high throughput mutant schermen. Deze proof-of-concept werd geïllustreerd door het succesvolle gebruik van THP-1 cultuur modelsysteem om een set van 56 genen die nodig zijn voor de overleving van C. glabrata in menselijke macrofagen 8 identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het wordt aanbevolen om C. te voeren glabrata infectie experimenten in een laboratorium met bioveiligheid inperkingsniveau 2 (BSL-2).
- Bereiding van THP-1 macrofaag monolaag.
- Bereiding van C. glabrata celsuspensie.
- Infectie van THP-1 macrofagen met C. glabrata cellen.
- Meting van fagocytose snelheid en intracellulaire replicatie via kolonievormende eenheid assay.
- Monitoring van de intracellulaire replicatie via confocale laser scanning microscopie.
1. Bereiding van THP-1 macrofaag monolaag
- THP-1 is een cellijn van menselijke monocyten afkomstig uit het perifere bloed van een 1-jarige man kind dat lijdt aan acute monocytische leukemie 14. THP-1, een suspensie cellijn, wordt routinematig gehandhaafd op 37 ° C in bevochtigde 5% CO2 in RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS (foetaal runderserum). Behandeling met forbol 12-myristate 13-acetaat (PMA een forbolester) levert terminale differentiatie van THP-1 monocytische cellen in macrofagen. Belangrijk is dat PMA behandeling geen invloed levensvatbaarheid van de cellen en gedifferentieerde cellen niet delen.
- Zaad ongeveer 1,5 x 10 6 THP-1 monocyten in 100 mm kweekschalen in RPMI-1640 compleet medium (RPMI-1640 medium aangevuld met 10% serum, 2 mM glutamine en antibiotica 1x, 10 ml / schaal) en liet cellen groeien bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 2 dagen.
- Zodra THP-1-cellen een dichtheid van 8 x 10 5 cellen / ml bereikt hebben, de overdracht van de cultuur schotel om de celkweek laminaire stroming kap en draai voorzichtig met het vaste cellen opnieuw in suspensie.
- Pipet de celsuspensie uit, breng het in een 15 ml steriele buis en centrifugeer bij 1000 rpm (130 xg) gedurende 4 minuten. Gooi supernatant en schorten THP-1 cel pellet in 5 ml vers, voorverwarmd, RPMI-1640 compleet medium.
- Opsommen cellen met een hemocytometer en verdun de cell suspensie tot een uiteindelijke dichtheid van 10 6 cellen / ml met voorverwarmd RPMI-1640 compleet medium
- Voeg 1 ul van 160 mM voorraad PMA (forbol 12-myristaat 13-acetaat bereid in dimethylsulfoxide) aan 10 ml THP-1 celsuspensie (eindconcentratie 16 nM) en meng. Breng 1 ml celsuspensie in elk putje van een 24-well weefselkweek plaat en incubeer plaat in de incubator op 37 ° C met 5% CO2 gedurende 12 uur.
- Verwijder oude medium, voeg 1 ml voorverwarmd RPMI-1640 compleet medium en laat cellen herstellen gedurende 12 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
- Let cellen onder een omgekeerde microscoop zodat ovale THP-1 monocytische cellen in suspensie zijn gedifferentieerd in afgeplatte, spoelvormige en hechtende macrofagen. Deze gedifferentieerde cellen zijn nu klaar om C. te voeren glabrata infectie studies.
2. Bereiding van C. glabrata & #160; Cell Suspension
C. glabrata wildtype Lg2 wordt gebruikt om THP-1 macrofagen infecteren. C. glabrata cellen worden routinematig gekweekt in vloeibaar YPD (gistextract (1%)-pepton (2%) dextrose (2%)) medium. Solid YPD medium bereid door 2% agar medium voor autoclaaf.
- Om een cultuur van C. bereiden glabrata, kies een enkele kolonie uit de agarplaat met een steriele wegwerpspuit lus en beënt in 10 ml YPD vloeibaar medium en incubeer 14-16 uur onder schudden (200 rpm) bij 30 ° C.
- Centrifuge deze cultuur (1 ml) bij 4.000 tpm (1.800 x g) gedurende 5 minuten in een tafelmodel microcentrifuge, cellen driemaal wassen met steriele PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7,4) en suspendeer celpellet in 1 ml PBS.
- Meet OD 600 van C. glabrata celsuspensie en verdunnen met een geschikt volume steriel PBS tot een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml te krijgen (OD 600= 0,1). Alternatief kan de gewenste celdichtheid bereikt door optelling gistcellen met behulp van een hemocytometer.
3. Infectie van THP-1 macrofagen met C. glabrata Cellen
- Voeg 50 ul C. glabrata celsuspensie THP-1 macrofagen (10 6 cellen per well van een 24-putjes plaat) een MOI (multipliciteit van infectie) van 0,1 te verkrijgen en incubeer plaat bij 37 ° C met 5% CO2.
- Levensvatbare gist tellingen te bepalen, te verdunnen 50 ul C. glabrata celsuspensie 100-voudig in steriele PBS en de plaat 100 ul op YPD vast medium. Incubeer de platen bij 30 ° C en tel handmatig het aantal gist kolonies verschijnen na 1-2 dagen. Deze aantallen zullen voortaan worden aangeduid als 0 uur C. glabrata CFU (kolonie vormende eenheden).
- Na 2 uur coculturing van THP-1 cellen met C. glabrata cellen, verwerp kweekmedium door het omkeren van 24-well weefselkweek plaat ina reservoir en was voorzichtig driemaal met voorverwarmde steriele PBS te nonphagocytosed extracellulaire C. verwijderen glabrata cellen. Gentle wassen met PBS zijn absoluut noodzakelijk om volledige verwijdering van alle extracellulaire gist bereiken zonder schade aan de THP-1 macrofaag monolaag.
4. Meting van Fagocytose Beoordeel en intracellulaire replicatie via Colony Forming Unit Assay
- Lyse C. glabrata geïnfecteerd THP-1 macrofagen in 1 ml steriele H 2 O 2 min, schraap zachtjes om de macrofaag puin uit de put en vang cellysaat in een microcentrifugebuis. Microscopische verificatie van complete macrofaag lysis is cruciaal voor het herstel van alle geïnternaliseerd gist.
- Bereid een 100-voudige verdunning van lysaat in steriele PBS, 100 ul plaat op vast medium YPD platen en incubeer bij 30 ° C.
- Na 1-2 dagen tellen handmatig het aantal C. glabrata kolonies die apdwenen op YPD medium, te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor (2 uur CFU's) en bereken fagocytose snelheid die verwijst naar het percentage van C. glabrata cellen die worden ingenomen door THP-1 macrofagen na 2 uur co-incubatie met de volgende formule.
Fagocytose% = [(CFU 2 h) / (KVE bij 0 h)] X 100 - Om de snelheid van de intracellulaire replicatie van C. meten glabrata cellen in THP-1 macrofagen verzamelen intracellulaire gist op verschillende tijdstippen na infectie dwz. 4, 6, 8, 10, 12 en 24 uur, door stap 3,3-4,3.
- Bereken vouw survival / replicatie van C. glabrata cellen in THP-1 macrofagen door de totale CFU op een bepaald tijdstip met de 2 uur (gefagocyteerd gist).
5. Monitoring van intracellulaire replicatie via confocale Laser Scanning Microscopie
- De stappen in Deel 1 beschreven zaad PMA behandelde 5 x 10 5 THP-1 cellen in elk putje van twee vier putjes kamer glijbanen en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 12 uur.
- Vervang oude medium met voorverwarmde RPMI-1640 compleet medium en laat de cellen te herstellen van PMA behandeling gedurende 12 uur.
- Bereid GFP (green fluorescent protein)-tagged C. glabrata celsuspensie zoals beschreven in hoofdstuk 2 en infecteren aan THP-1 macrofagen een MOI van 1. Als C. glabrata stammen die GFP beschikbaar zijn, gistcellen gelabeld met FITC (fluoresceïne isothiocyanaat) kan worden gebruikt om na vroege gebeurtenissen na infectie weten. fagocytose tarief en phagolysosomal rijping op 2 uur.
- Incubeer dia's voor 2 uur bij 37 ° C met 5% CO 2, keer ze zorgvuldig tot middelgrote weggooien en was 3x met steriele, voorverwarmde PBS.
- Voeg 500 ul voorverwarmde RPMI-1640 compleet medium aan elke kamer van een dia en incubeer deze bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 22 uur.
- Om 2 uur C. repareren glabrata geïnfecteerde THP-1 macrofagen, voeg 500 ul van 3,7% formaldehyde (bereid in PBS) aan elke kamer van de andere slede en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min in het donker.
- Was schuif driemaal met PBS, voeg 500 pl Triton-X (0,7%), en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten in het donker.
- Wassen dia 3x met PBS, verwijder kamer van cultuur glijbaan en lucht drogen voor 3-5 minuten in het donker.
- Monteer een dekglaasje voorzichtig met Vectashield montage medium met DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenylindool) op dia vermijden van de vorming van luchtbellen. Verwijder voorzichtig de overtollige vloeistof met Kimwipe en afdichting dekglaasje randen met nagellak. WINKEL dia in het donker bij 4 ° C tot gebruik.
- Herhaal de stappen 5.4 en 5,6-5,9 om THP-1-cellen te verwerken 24 uur na infectie.
- Afbeelding cellen met behulp van een laser scanning confosche microscoop (60x olie-immersie objectief, excitatie bij 405 nm en 488 nm voor GFP en DAPI kleuring, respectievelijk).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Infectie analyses van PMA behandelde THP-1 macrofagen met C. glabrata wildtype (wt) cellen onthulde dat wt cellen gefagocyteerd door macrofagen met een snelheid van 55-65% na 2 uur co-incubatie. Verder C. glabrata cellen konden doden weerstaan door THP-1 macrofagen en onderging een matige 5 - tot 7-voudige toename in CFU's na 24 uur van coculturing met THP-1 macrofagen 8. Intracellulaire replicatie van wildtype cellen getransformeerd met GFP expressie plasmide in THP-1 macrofagen werd ook onderzocht met confocale fluorescentiemicroscopie, waarbij het aantal intracellulaire gistcellen per THP-1 macrofaag toe van een of twee 7-12 gedurende van 24 uur (figuur 1).
Figuur 1. Een confocale beeld van formaldehyde vaste, GFP-gelabelde C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen weergeven van intracellulaire replicatie met THP-1 cellen die 1-2 en 5-8 gist in 2 uur en 24 uur, respectievelijk. Kernen zijn gekleurd met DAPI. Bar = 10 urn.
Figuur 2. Schematische weergave van de C. glabrata mutantenbank scherm veranderde overleving profielen THP-1 macrofagen via handtekening gelabeld mutagenese (STM) aanpak. rode en groene cirkels gehybridiseerde membranen duiden verminderd en verhoogde weergave van de markeringen, respectievelijk in uitgangsmonsters opzichte ingangsmonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aangeboren immuunsysteem speelt een belangrijke rol bij de controle van opportunistische schimmelinfecties. Macrofagen bijdragen aan de verdediging antifungale door inname en verwoesting van de pathogene schimmel. Zo zal opheldering van factoren die nodig zijn voor overleving en / of tegengaan van de antimicrobiële functies van macrofagen ons begrip van schimmels virulentie strategieën bevorderen. In deze context hebben we een in vitro celkweek modelsysteem middels macrofagen afgeleid van een humane monocytische cellijn THP-1 om de interactie van een menselijke opportunistische pathogene schimmel C. karakteriseren vastgesteld glabrata met gastheer fagocytcellen. Hoewel THP-1 macrofaag modelsysteem is met succes gebruikt voor identificatie van C. glabrata mutanten met verminderde overleving die verzwakte virulentie in een muismodel van systemische candidiasis 8 weergegeven aannemelijk beperking van dit systeem is de geïsoleerde context en dus verkregen resultaten nietaltijd geschikt voor de complexe zoogdiergastheer immuunsysteem. Verder dit systeem, anders live cell imaging methoden niet in staat om rekening te houden gistcellen die ofwel niet door THP1-macrofagen of gedood tijdens fagocytose.
De betekenis van dit protocol ligt in de eenvoud, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid. De werkwijze kan naar beneden worden aangepast aan een 96-well plaat en geschaald tot 150 cm2 weefselkweek kolf. De kritische stappen in dit protocol zijn de keuze van een geschikte MOI en uitgebreide PBS wast extracellulaire replicatie en plating van passende lysaat verdunning minimaliseren naar 100-200 gistkolonies per plaat te verkrijgen. Een MOI van 0,1 is ideaal bewaken intracellulaire replicatie in een periode van 24 uur als het aantal extracellulaire gistcellen minimaal blijft gedurende deze langdurige coculturing van THP-1 macrofagen met C. glabrata cellen. Verder, een MOI van 1,0 is optimaal voor het visualiseren van de maximale aantal
Specifiek noemen intracellulaire overleving / replicatie moeten CFU vergelijking tussen het aantal geïnternaliseerde gist in 2 uur en die op latere tijdstippen. Vergelijking met 0 uur CFU's zal de resultaten scheeftrekken als eerste gehechtheid en fagocytose tarieven zijn verschillend voor verschillende stammen. Het is opmerkelijk dat hier het aantal intracellulaire gistcellen tijdens het infectieproces periode kan ook worden gemeten met flow cytometrie en confocale / live cell imaging microscopy benaderingen.
Daarnaast intracellulaire gist Recoverood op verschillende tijdstippen na infectie met dit protocol kan worden gebruikt voor diverse analyses zoals microscopie, reactieve zuurstof species (ROS) accumulatie chromatine extractie en RNA en eiwit isolatie de epigenetische onderscheiden, transcriptionele en metabole respons van C. glabrata cellen de macrofaag interne milieu. Het is belangrijk om de extracellulaire gist en macrofaag afval volledig elimineren vóór alle biochemische analyse van macrofagen geïnternaliseerde gist.
Een andere toepassing van deze in vitro celkweek modelsysteem is zijn aanpassingsvermogen aan scherm mutanten voor veranderde overleven profielen, individueel of multiplexen in een pool van 96 stammen met een signature-gelabelde mutagenese (STM) aanpak. Een voordeel van de STM strategie is het parallel screenen van honderden mutanten in een enkel experiment. Deze benadering is onlangs gebruikt voor het screenen van een C. glabrata mutant litheek die bestaat uit 18.350 willekeurige Tn 7 insertiemutanten en gemonteerd in een totaal van 192 pools, waarbij elke pool uit 96 unieke oligonucleotide gelabeld mutanten 8 '15. Figuur 2 illustreert pictorially de omtrek van de methode STM scherm dat uit drie belangrijkste stappen. Eerste, een overnachting-volwassen zwembad van 96 C. glabrata mutanten gekweekt hetzij in rijk medium (input) of geïnfecteerd aan THP-1 macrofagen in een 24-well weefselkweek plaat. Na 2 uur infectie, extracellulaire gistcellen verwijderd door wassen met PBS en geïnfecteerd THP-1-cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C. 24 uur na infectie, intracellulaire gistcellen (output) worden teruggewonnen door osmolysis van THP-1-cellen. De tweede stap omvat extractie van genomisch DNA van input en output monsters gevolgd door amplificatie van unieke signatuur tags met 32P-dCTP gemerkt met primers complementair aan de invariante regio flankerende elke unieke oligonucleotidensequentie. Ten derde, radioactief gemerkt labels van input en output zwembaden zijn gehybridiseerd met een Hybond-Nylon membraan dat 96 plasmiden die elk een unieke handtekening tag bevat. Hybridisatie signaal voor een unieke oligonucleotidensequentie weerspiegelt de overvloed van de mutante stam, dragen die bepaalde tag, in een pool van 96 mutanten. Output (Op) invoeren (Ip) verhouding voor elk label wordt berekend door het uitgangssignaal intensiteit delen door het ingangssignaal intensiteit. Mutanten weergave van minimaal 6 maal hoger en 10-voudig lagere overleving kan worden beschouwd als "omhoog" (Op / Ip = 6,0, verhoogde overleving) en omlaag (Op / Ip = 0,1, verminderde overleving) mutanten, respectievelijk (figuur 2). Alternatief kan fluorescent gelabelde probe-afhankelijke DNA microarrays worden gebruikt om variatie in de signaalintensiteit van de tag in de ingang en de uitgang monster dat het intracellulaire gedrag spiegels bepalenior van de mutant.
Deze methode kan ook worden gebruikt om ROS en cytokine respons en phagolysosomal verzuring van fagocyterende cellen na infectie met schimmels bestuderen. Tenslotte vanwege de flexibiliteit van deze procedure zowel verschillende immune celsoorten waaronder primaire cellen als schimmelorganismen Deze proefopzet is geschikt voor diverse aspecten van gastheer-schimmel interactie pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Innovative Young Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 en BT/PR13289/BRB/10/745/2009 subsidie van de afdeling Biotechnologie, de regering van India en de kern fondsen van Centrum voor DNA-vingerafdrukken en Diagnostics, Hyderabad. MNR en GB zijn de ontvangers van de Junior en Senior Research Fellowships van de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek naar het nastreven van een doctoraat van de Manipal University. SB is de ontvanger van Junior en Senior Research Fellowship van de afdeling Biotechnologie, op het voeren van een doctoraat van de Manipal University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
References
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
- Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
- Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
- Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
- Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
- Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
- Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
- Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
- Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
- Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
- Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
- Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
- Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
- Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).
