Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

ניתוח התוכן של חומצות שומן והרכב בMicroalgae

Published: October 1, 2013 doi: 10.3791/50628
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Bioprocess Engineering, Wageningen University and Research Center, 2AlgaePARC, Wageningen University and Research Center, 3Food and Biobased Research, Wageningen University and Research Center

Summary

שיטה לקביעת תכולת חומצות שומן והרכב באצות המבוססות על הפרעה מכאנית של תאים, מיצוי שומנים מבוסס ממס, transesterification, וכימות וזיהוי של חומצות שומן באמצעות גז כרומטוגרפיה מתוארת. תקן פנימי tripentadecanoin משמש כדי לפצות על ההפסדים האפשריים בחילוץ וtransesterification שלם.

Abstract

שיטה כדי לקבוע את התוכן ואת ההרכב של חומצות שומן הכוללת בהווה באצות הוא תאר. חומצות שומן הן מרכיב עיקרי של ביומסה microalgal. חומצות שומן אלו יכולות להיות נוכחים בשיעורי acyl שומנים בדם שונים. בעיקר חומצות השומן קיים בtriacylglycerol (TAG) הן עניין מסחרי, משום שהם יכולים לשמש לייצור דלקים לתחבורה, כימיקלים בצובר, בריאותיים (ω-3 חומצות שומן), ומוצרי מזון. כדי לפתח יישומים מסחריים, שיטות אנליטיות אמינות לכימות של תכולת חומצות שומן והרכב יש צורך. Microalgae הם תאים בודדים מוקף דופן תא נוקשה. שיטת ניתוח חומצת השומן אמורה לספק הפרעה תא מספיק כדי לשחרר את כל שומני acyl והליך המיצוי משמש אמור להיות מסוגל לחלץ את כל כיתות השומנים acyl.

עם השיטה המוצגת כאן את כל חומצות השומן הנוכחיות באצות יכולות להיות מדויקת וreproducibly IDENtified ולכמת באמצעות כמויות קטנות של מדגם (5 מ"ג) עצמאיות באורכם שרשרת, מידת unsaturation, או ברמת השומנים בדם שהם חלק ממנה.

שיטה זו אינה מספקת מידע על השפע היחסי של כיתות שומנים שונות, אבל ניתן להאריך להפריד כיתות שומנים בדם אחד מהשני.

השיטה מבוססת על רצף של הפרעה מכאנית של תאים, מיצוי שומנים מבוסס ממס, transesterification של חומצות שומן לאסטרים מתילים של חומצות שומן (fames), וכימות וזיהוי של fames באמצעות גז כרומטוגרפיה (GC-FID). סטנדרטי TAG פנימי (tripentadecanoin) הוא הוסיף לפני הליך האנליטיות לתיקון להפסדים במהלך החילוץ וtransesterification שלם.

Introduction

חומצות שומן הן אחד המרכיבים העיקריים של ביומסה microalgal ובדרך כלל לפצות בין 5-50% מהמשקל היבש של תאי 1-3. הם בעיקר בהווה בצורה של glycerolipids. glycerolipids אלה בתורם בעיקר מורכב מפוספוליפידים, glycolipids, וtriacylglycerol (TAG). בעיקר חומצות השומן קיים בTAG הן עניין מסחרי, משום שהם יכולים לשמש כמשאב לייצור דלקים לתחבורה, כימיקלים בצובר, בריאותיים (ω-3 חומצות שומן), ומוצרי מזון 3-6. Microalgae יכול לגדול בתקשורת טיפוח על בסיס מים ים, יכול לקבל את הפרודוקטיביות אזוריות גבוהה הרבה יותר מאשר צמחים יבשתיים, ויכול להיות מעובד בphotobioreactors מקומות שאינם מתאימים לחקלאות ב, ואולי אפילו מהחוף. מסיבות אלה, microalgae נחשב לעתים קרובות חלופה מבטיחה לצמחים יבשתיים לייצור של מוצרים בתפזורת אחרים 3-6 ביו דיזל ו. פוטנציאל לא l חקלאיואו מים מתוקים (כשטפח בphotobioreactors הסגור או כאשר משמשים microalgae הימי) נחוץ לייצור שלהם. לכן, דלק ביולוגי הנגזר מmicroalgae נחשב 3 rd דלק ביולוגי מדור.

התוכן הסלולרי הכולל של חומצות שומן (% ממשקל יבש), הרכב ברמת שומנים בדם, כמו גם את אורך חומצות שומן ומידת הרוויה הוא משתנה מאוד בין מיני microalgae. יתר על כן, מאפיינים אלה משתנים עם תנאי גידול, כגון זמינות חומרי מזון, טמפרטורה, pH, ועוצמת אור 1,2. לדוגמא, כאשר הם נחשפים לרעב חנקן, microalgae יכול לצבור כמויות גדולות של TAG. בתנאי גידול אופטימליים TAG בדרך כלל מהווה פחות מ -2% ממשקל יבש, אבל כאשר הם נחשפים לתוכן TAG רעב חנקן יכול להגדיל לעד 40% מהמשקל היבש microalgal 1.

Microalgae בעיקר לייצר חומצות שומן עם אורכי שרשרת 16 ו18אטומי פחמן, אבל כמה מינים יכולים לעשות חומצות שומן של עד 24 אטומי פחמן באורך. שני רוויים כמו גם חומצות שומן בלתי רוויות מאוד מיוצרות על ידי אצות חד. האחרון כולל חומצות שומן עם יתרונות תזונתיים (ω-3 חומצות שומן) כמו C20: 5 (חומצת eicosapentaenoic; EPA) וC22: 6 (docosahexaenoic acid; DHA) שעבורם אין חלופות ירקות קיימות 1,2,4,7. (חלוקת) אורך שרשרת של חומצות שומן ומידת הרוויה גם קובע את התכונות ואיכות של דלק ביולוגי המופקת מאצות ושמן מאכל 4,8.

כדי לפתח יישומים מסחריים של חומצות שומן microalgal נגזר, שיטות אנליטיות אמינות לכימות של תכולת חומצות שומן והרכב יש צורך.

כמו גם ציין ידי Ryckebosch et al. 9, ניתוח של חומצות שומן באצות חד מבדיל את עצמו ממצעים אחרים (למשל שמן צמחי, מוצרי מזון, ברקמות של חיות וכו ') יהיוmicroalgae לגרום 1) הם תאים בודדים מוקפים בקירות תא נוקשה, מסבכים מיצוי שומנים בדם; 2) microalgae מכיל מגוון רחב של שיעורי שומנים וההפצה ברמת שומנים בדם משתנה 7 מאוד. יש כיתות שומנים שונות אלה מגוון רחב במבנה כימי ותכונות כגון קוטביות. כמו כן, שיעורי שומנים אחרים מאשר שומני acyl מיוצרים; 3) microalgae מכיל מגוון רחב של חומצות שומן, הנע 12-24 אטומי פחמן באורך ומכיל הן רווי וכן חומצות שומן בלתי רוויות מאוד. לכן, שיטות שפותחו לניתוח חומצות שומן במצעים אחרים מאשר microalgae, לא יכולות להיות מתאימות כדי לנתח את חומצות שומן באצות.

כפי שנסקר על ידי Ryckebosch et al. 9, ההבדל העיקרי בין הליכי מיצוי שומנים נפוצים הוא בממס המערכות הנמצאים בשימוש. בגלל המגוון הגדול של סוגי שומנים בהווה באצות, כל משתנה בקוטביות, שחולץכמות שומנים תשתנה עם ממסים משמשים 10-12. זה מוביל לחוסר העקביות בתוכן השומנים בדם ובהרכב מובא ב9,10 ספרות. בהתאם למערכת הממס בשימוש, שיטות המבוססות על מיצוי בממסים ללא הפרעה דרך תא, למשל, מכות חרוז או sonication, ייתכן שלא לחלץ את כל השומנים בגלל המבנה הנוקשה של כמה מיני microalgae 9,13. במקרה של מיצוי שומנים שלם, המיצוי יעילות של שומנים בדם הכיתות השונות יכולה להשתנות 14. זה יכול גם להיות השפעה על הרכב חומצות שומן נמדד, כי הרכב חומצות שומן משתנה בין מעמדות שומנים בדם 7.

השיטה שלנו מבוססת על רצף של הפרעה מכאנית של תאים, מיצוי שומנים מבוסס ממס, transesterification של חומצות שומן לאסטרים מתילים של חומצות שומן (fames), וכימות וזיהוי של fames באמצעות כרומטוגרפיה גז בשילוב עם ioniza להבהגלאי tion (GC-FID). תקן פנימי בצורה של triacylglycerol (tripentadecanoin) הוא הוסיף לפני ההליך אנליטית. הפסדים אפשריים במהלך החילוץ וtransesterification שלם אז יכולים להיות מתוקנים ל. השיטה יכולה לשמש כדי לקבוע את התוכן כמו גם את ההרכב של חומצות השומן קיימים ביומסה microalgal. כל חומצות השומן המצויים בסוגים השונים acyl שומנים בדם, כוללים אחסון (TAG), כמו גם שומני קרום תא (glycolipids, פוספוליפידים), מזוהים, שזוהה ולכמת באופן מדויק וreproducibly בשיטה זו משתמשת רק בכמויות קטנות של מדגם (5 מ"ג) . שיטה זו אינה מספקת מידע על השפע היחסי של כיתות שומנים שונות. עם זאת, השיטה יכולה להתארך להפריד כיתות שומנים מכל 1 אחר. הרכב חומצות שומן של הריכוז וכיתות שומנים השונים אז יכול להיות נקבע באופן אינדיבידואלי.

בספרות מספר שיטות אחרות הןתאר לניתוח שומנים באצות. חלק מהשיטות להתמקד ברכיבי lipophilic כולל 15, בעוד שיטות אחרות מתמקדות בחומצות שומן כוללת 9,16. חלופות אלה כוללות קביעת gravimetric של שומני חילוץ בסך הכל, טרנס esterification הישיר של חומצות שומן בשילוב עם כימות באמצעות כרומטוגרפיה, ותאי צביעה עם צבעי ניאון lipophilic.

חלופה נפוצות לכימות של חומצות שומן באמצעות כרומטוגרפיה היא כימות של שומנים באמצעות נחישות gravimetric 17,18. יתרונותיו של נחישות gravimetric הם חוסר דרישות לציוד מתקדם ויקר כמו גז כרומטוגרף; להקל להגדיר את ההליך, בגלל הזמינות של ציוד הסטנדרטי אנליטיים (למשל Soxhlet); ונחישות gravimetric היא פחות מזמן רב כרומטוגרפיה שיטות. מבוססת היתרון העיקרי של שימוש בשיטות כרומטוגרפיה המבוססת על othאה יד היא כי בשיטה כזו רק חומצות השומן נמדדות. בנחישות gravimetric החומצה שאינה שומנית המכילה שומנים, כמו פיגמנטים או סטרואידים, כלולה גם בנחישות. שומני חומצה שאינה מכיל שומן אלו יכולים לפצות על חלק גדול (> 50%) של שומנים בסך הכל. אם מישהו מעוניין רק בתכולת חומצות שומן (לדוגמא ליישומים ביו דיזל), זה יהיה בהערכת, כאשר הוא משמשת נחישות gravimetric. בנוסף, בנחישות gravimetric הדיוק של האיזון האנליטית המשמש לשקילת השומנים חולצו קובע את גודל המדגם שצריך להיות בשימוש. כמות זו היא בדרך כלל הרבה יותר מהסכום הדרוש, כאשר הוא משמש כרומטוגרפיה. לבסוף, יתרון נוסף של שימוש בכרומטוגרפיה על נחישות gravimetric הוא כי כרומטוגרפיה מספקת מידע על הרכב חומצות שומן.

חלופה נוספת לשיטה שהוצגה היא 16,19,20 transesterification ישירים.בשיטה זו שאיבת שומנים בדם וtransesterification של חומצות שומן לfames משולבים בצעד אחד. שיטה זו היא מהירה יותר מאשר שלב חילוץ וtransesterification נפרד, אבל שילוב של צעדים אלה מגביל את הממסים שיכולים לשמש לחילוץ. זה עלול להשפיע לרעה על יעילות שאיבה. יתרון נוסף של צעד נפרד שאיבת שומנים בדם וtransesterification הוא שהיא מאפשרת להפרדה ברמת שומנים בדם נוספת בין שלבי 1 אלה. זה לא אפשרי בעת השימוש transesterification הישיר.

שיטות נפוצות אחרות כדי לקבוע את תוכן השומנים באצות כוללות מכתימות את ביומסה עם כתמי ניאון lipophilic כגון הנילוס אדום או BODIPY ומדידת אותות הקרינה 21,22. יתרון של שיטות אלה הם שהם פחות מייגע יותר מאשר בשיטות אלטרנטיביות. חסרון של שיטות אלה הוא שתגובת הניאון היא, מסיבות שונות, משתנה בין species, תנאי גידול, סוגי שומנים בדם, ונהלים אנליטיים. כדוגמא, כמה וריאציות אלה נגרמים על ידי הבדלים בספיגה של הצבע על ידי microalgae. כיול באמצעות שיטה אחרת, כמותית יש צורך אפוא, שבוצע רצוי לכל תנאי גידול השונים ושלבי צמיחה. לבסוף, שיטה זו אינה מספקת מידע על הרכב חומצות שומן ופחות מדויק ולשעתק מאשר שיטות כרומטוגרפיה מבוססת.

השיטה שהוצגה מבוססת על השיטה שתוארה על ידי למרס et al. 23 וסנטוס et al. 24 וגם יושמה על ידי מחברים שונים אחרים 1,25-27. גם שיטות אחרות זמינות המבוססים על אותם העקרונות ויכולות לספק 9,28 תוצאות דומות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

ישנם שני פרוטוקולים חלופיים עבור מדגם הכנה כלל כצעדי 1.1 ו1.2. שני השיטות מתאימות במידה שווה ולתת תוצאות דומות, אבל אם יש כמות מוגבלת של אצות תרבות נפח זמינה, שיטה 1.1 מומלצת.

הערה: בכל אחת מפרוטוקול, להכין שני צינורות מקצף חרוז נוספים בהתאם לפרוטוקול כולו, אך מבלי להוסיף אצות להם לשמש כריק. בדרך זו, ניתן לזהות פסגות בהכרומתוגרמה GC כתוצאה ממיצוי של רכיבים מחומרים המשמשים לכימות.

1.1. לדוגמא הכנת פרוטוקול אפשרות 1: מומלץ כאשר כמות מוגבלת של אצות תרבות היא זמינה

  1. קבע את ריכוז האצות היבש במשקל (ג / ליטר) במרק התרבות, למשל כפי שתואר על ידי ברויאר et al. 1.
  2. העבר את נפח של מרק התרבות המכיל 5-10 מ"ג אצות משקל יבש לצינור צנטריפוגות זכוכית. לחשב את הסכום המדויק של ביומסה הועבר באמצעות הריכוז ביומסה קבע בשלב 1.1.1.
  3. צנטריפוגה 5 דקות ב1,200 x גרם.
  4. מחק חלק מsupernatant, להשאיר כ 0.25 מיליליטר בצינור.
  5. Re-להשעות את האצות בsupernatant שנותר על ידי pipetting עדין גלולה מעלה ומטה ולהעביר את התא גלולה המלאה לצינור מקצף חרוז באמצעות פיפטה 200 μl.
  6. יש לשטוף את פיפטה צינור צנטריפוגות וזכוכית עם המים ± 0.15 מיליליטר milliQ ולהעביר את הנוזל לצינור אותו מקצף חרוז.
  7. צינורות מקצף חרוז צנטריפוגה למשך דקה אחת בסל"ד המקסימאלי כדי לוודא שאין בועות אוויר להישאר בחלק התחתון של הצינורות. אפשר לאחסן צינורות מקצף חרוז סגורים ב -80 ° C.
  8. Lyophilize צינורות מקצף חרוז המכילים את המדגם. ניתן לאחסן את צינורות מקצף חרוז הסגורים ב -80 ° C.

1.2. אפשרות הכנת פרוטוקול לדוגמא 2

  1. צנטריפוגה נפח לא ידוע של מרק תרבות אצות וזורקים supernatant. אין זה הכרחי כדי לקבוע את הריכוז ביומסה או למדוד את נפח שימוש.
  2. למדוד או לחשב את osmolarity של מדיום התרבות באמצעות הריכוז של מלחים העיקריים כיום במדיום לתרבות.
  3. שטוף את התא גלולה ידי resuspending התא גלולה באותו הנפח, כמו בשימוש בצעד 1.2.1, של פתרון formate אמוניום, המדמה את osmolarity של המדיום לתרבות. פתרון formate אמוניום equiosmolar מונע lyses התא במהלך השטיפה של התאים.

הערה: כביסה התאים יש צורך להסיר מלחים המצויים במדיום לתרבות. זה חשוב במיוחד עבור ניתוח של חומצות שומן באצות ימיות בגלל ריכוזי מלח גבוהים במדיום התרבות שלהם. אם מלחים עדיין יהיו נוכחים, זה עלול לגרום להערכת יתר של כמות המשקל יבש תא שבו תיקבע בהמשך בtהפרוטוקול שלו. formate אמוניום משמש כדי לשטוף תאים משום שפתרון זה יתאדה לחלוטין במהלך lyophilization ולא להשאיר שום שאריות.

  1. השעיה אצות צנטריפוגה supernatant ונזרק.
  2. Lyophilize התא גלולה.
  3. שוקל 5-10 אבקת microalgae lyophilized מ"ג לתוך צינור מקצף חרוז. רשום את המשקל המדויק.

2. שיבוש תא ויפידים הפקה

הערה: סעיף זה מתאר הליך שיבוש תא נרחב. אולי, חלק מהצעדים השיבוש הסלולרי הם מיותרים והפרעה תא פחות נרחבת עשויה להניב את אותן תוצאות לכמה מיני אצות חד או לביומסה נגזרת מתנאי גידול מסוימים. זה היית צריך אימות לכל מצב ספציפי עם זאת. לכן פרוטוקול השיבוש הנרחב המוצע מומלץ כשיטת אוניברסלית מתאימה לכל חומר microalgal.

  1. שוקל כמות מדויקת של tripentadecanoin (TRiacylglycerol המכיל שלוש C15: 0 חומצות שומן) ולהוסיף אותו לסכום בדיוק ידוע של 04:05 v כלורופורם (/ V): מתנול. בדרך זו הריכוז של tripentadecanoin ידוע בדיוק. לשאוף לריכוז של 50 מ"ג / ל ' Tripentadecanoin משמש כתקן לכימות חומצת שומן הפנימי.
  2. הוסף 1 מיליליטר כלורופורם: מתנול 04:05 (V / V) מכיל tripentadecanoin על צינור אחד מכות (שצוין בחומרים הכימיים וציוד שולחן). בדוק שאין חרוזים שנותרו בתוך הכובע של צינור beadbeater, זה יגרום לדליפה של הצינורות. השתמש פיפטה תזוזה חיובית לתוספת מדויקת של ממסים.
  3. חרוז לנצח את צינורות מקצף חרוז 8x ב2,500 סל"ד 60 שניות, בכל פעם עם שניות 120 פנימיות בין כל מכות.
  4. מעביר את הפתרון מצינורות מקצף חרוז לצינור נקי ועמיד בפני חום 15 מיליליטר צנטריפוגות זכוכית עם בורג כובעים להוסיף טפלון. הקפד להעביר את כל חרוזים מצינור מקצף חרוז גם כן.
  5. להיהשעות צינור מקצף חרוז, להוסיף 1 מיליליטר כלורופורם: מתנול 04:05 (V / V) מכיל tripentadecanoin לתוך צינור חרוז המקצף, קרוב הכובע ולערבב, ולהעביר את הפתרון הזה לאותו צינור הזכוכית מצעד 2.4. שטוף את הצינור שלוש פעמים (בסך הכל 4 מיליליטר של כלורופורם: מתנול 04:05 (V / V) tripentadecanoin המכיל משמש לדגימה - 1 מיליליטר הוסיף בשלב 2.2 ו3 מיליליטר ל3 שלבי כביסה).
  6. ורטקס צינורות הזכוכית עבור 5 שניות וsonicate באמבט sonication 10 דקות.
  7. הוסף 2.5 מיליליטר מים MilliQ, המכיל 50 מ"מ 2-אמינו-2-hydroxymethyl-פרופאן-1 ,3-דיאול (טריס) ו1 M NaCl, אשר מוגדר ל-pH 7 באמצעות פתרון HCl. זה יגרום להפרדת פאזות בין כלורופורם ומתנול: מים. 1 M NaCl משמש כדי לשפר את שיווי המשקל של שומנים לקראת שלב כלורופורם.
  8. וורטקס למשך 5 שניות ולאחר מכן sonicate 10 דקות.
  9. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,200 x גרם.
  10. להעביר את כל שלב כלורופורם (שלב תחתון) לשפופרת זכוכית נקייה באמצעות pipett פסטר זכוכיתדואר. ודא שלא להעביר את כל שלבי ביניים או בשלב עליון.
  11. Re-לחלץ את המדגם על ידי הוספת כלורופורם 1 מיליליטר לצינור ישן (המכילה מתנול: פתרון מים).
  12. וורטקס למשך 5 שניות ולאחר מכן sonicate 10 דקות.
  13. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,200 x גרם.
  14. לאסוף את שלב כלורופורם (שלב תחתון) באמצעות פיפטה פסטר זכוכית ובריכה עם בר כלורופורם הראשון מצעד 2.10.
  15. אם קשיים מנוסים באיסוף כל שבריר כלורופורם בשלב הקודם, חזור על שלבים 2.11-2.14. אחרת להמשיך עם צעד 2.16.
  16. להתאדות כלורופורם מהצינור בזרם גז חנקן. לאחר ניתן לאחסן דגימות שלב זה ב -20 מעלות צלזיוס מתחת אווירת גז חנקן.

3. Transesterification לשומן מתיל אסטרים חומצה

  1. הוסף 3 מיליליטר מתנול המכיל 5% (v / v) חומצה גופרתית לצינור המכיל שומנים המיובשים חילוץ (צינור במקור המכיל את שבר כלורופורם) ולסגור את הצינור בחוזקה.
  2. וורטקס למשך 5 שניות.
  3. דגירה דגימות עבור 3 שעות ב 70 מעלות צלזיוס בתנור אבן או אמבט מים. מעת לעת (כל ± 30 דקות) להבטיח כי הדגימות לא רותחים (שנגרם על ידי מכסה סגור בצורה לא נכונה) וצינורות מערבולת. במהלך תגובה זו חומצות שומן מפוגלות לאסטרים חומצת שומן מתיל (fames).
  4. דגימות מצנן לטמפרטורת חדר ולהוסיף 3 מיליליטר MilliQ מים ו3 מיליליטר n-הקסאן.
  5. וורטקס למשך 5 שניות ומערבבים במשך 15 דקות עם מסובב מבחנה.
  6. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,200 x גרם.
  7. לאסוף 2 מיליליטר של שלב הקסאן (למעלה) ולשים בשפופרת זכוכית טריות באמצעות זכוכית פיפטה פסטר.
  8. מוסיף מים 2 מיליליטר MilliQ לשלב הקסאן נאסף כדי לשטוף אותו.
  9. וורטקס למשך 5 שניות ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 x גרם. לאחר שלב זה ניתן לאחסן את הדגימות ב-20 מעלות צלזיוס תחת אווירת חנקן גזים (הפרדת פאזות לא הכרחית).

4. כימות fames Uסינג גז כרומטוגרפיה

  1. מלא בקבוקוני GC עם שלב הקסאן (עליון שלב) באמצעות זכוכית פיפטה פסטר.
  2. מניחים את כובעים על בקבוקוני GC. ודא כובעים אטומים לחלוטין, ולא יכולים להיות מופעל, כדי למנוע אידוי מהבקבוקון.
  3. למלא את הממסים לשטוף GC (הקסאן), רוקן את הבקבוקונים פסולת, ולשים את הבקבוקונים במדגם האוטומטי סמפלר. לפני הפעלת הדגימות בפועל על GC, הריצה ראשונה 2 כדורי סרק המכילים רק הקסאן ב-GC.
  4. הפעל את הדגימות על GC-FID עם עמודת Nukol (30 MX 0.53 מ"מ x 1.0 מיקרומטר). השתמש בטמפרטורת כניסה של 250 ° C ולהשתמש הליום כגז מוביל, לחץ של 81.7 kPa ויחס פיצול של 0.1:1, סך הכל קצב זרימה: 20 מיליליטר / דקה. טמפרטורת גלאי FID של C ° 270 עם H 2 קצב זרימה של 40 מיליליטר / דקה, קצב זרימת האוויר של 400 מיליליטר / דקה והוא קצב זרימה של 9.3 מיליליטר / דקה. הגדרת נפח הזרקה ל1 μl / מדגם. הזרקה לפני ואחרי שטיפה עם n-הקסאן. טמפרטורת תנור ראשונית מוגדרת 90 מעלות צלזיוס במשך 0.5 דקות ולאחר מכן העלתה שנינות20 ° עד טמפרטורת תנור של 200 ° C הוא הגיע C / דקת שעות. טמפרטורת תנור לאחר מכן שמור על C ° 200 ל39 דקות. זמן ריצה כולל הוא 45 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכרומתוגרמה טיפוסית המתקבלת באמצעות תהליך זה מוצגת באיור 1. Fames מופרדים לפי גודל ומידת הרוויה לפי עמודת GC והפרוטוקול המשמש. יש חומצות קצרות שרשרת אורך שומן וחומצות שומן רווי יותר (קשרים כפולים פחות) פעמים שמירה קצרות יותר. עמודת GC משמש ופרוטוקול לא מתכוונים להפריד בין איזומרים של חומצות שומן (אותו אורך שרשרת ומידת הרוויה, אבל עמדות שונות של קשרים כפולים), אבל זה יכול להיות מושגת על ידי שימוש בעמודת GC שונה ופרוטוקול.

ריכוז חומצות שומן וההרכב יכולים להיות מחושבים באמצעות האזור של פסגות GC, הריכוז פנימי סטנדרטי (מ"ג / ליטר) (שלב 2.1), ואת הסכום של ביומסה נוספת למדגם (מ"ג) (שלב 1.1.2 או 1.2. 6, שבמדגם בהתאם פרוטוקול הכנה נבחר).

התוכן של כל חומצת שומן בודדת בביומסה (משקל יבש חומצה / g שומן מ"ג) ניתן לקבוע ב y

משוואת 1
עם שטח של תהילה בודדת כפי שנקבע על ידי שילוב של הכרומתוגרמה GC (איור 1); שטח C15: 0 תהילה כפי שנקבע על ידי שילוב של הכרומתוגרמה GC (איור 1);

משוואה 2
עם [IS] הריכוז של tripentadecanoin בכלורופורם: פתרון מתנול כפי שנקבע בשלב 2.1; MW C15: 0 FA המשקל המולקולרי של C15: חומצת 0 שומן (242.4 g / mol); MW C15: 0 TAG המשקל המולקולרי של tripentadecanoin (765.24 g / mol);

"Src =" ighres.jpg / files/ftp_upload/50628/50628eq3.jpg "/>
כפי שנקבע על ידי הפעלת פתרונות כיול על GC, המהווים מתערובות של C15: 0 תהילה וfames של כל חומצות השומן בודדות צפויות במדגם, עם [C15: 0 FAME בפתרון כיול] הריכוז של C15: 0 FAME ב פתרון כיול (מ"ג / ליטר); [FAME פרט בפתרון כיול] הריכוז של התהילה בודדת בפתרון הכיול (מ"ג / ליטר), והאזורים, כפי שנקבע על ידי שילוב של הכרומתוגרמה GC של פתרון הכיול.

סך הכל תכולת חומצות שומן יכולה להיות מחושבת כסכום של כל חומצות השומן בודדות. השפע היחסי של כל חומצת שומן יכול להיות מחושב על ידי חלוקת הריכוז של כל חומצת שומן בודדת בסך הכל תכולת חומצות שומן.

הרכב חומצות השומן והתוכן של Scenedesmus obliquus UTEX393 (Chlorophyceae) תחת שני גדושים החנקן וימוצה תנאים הואשמוצג באיור 2. הרכב חומצות שומן ותוכן מושפעים מאוד על ידי רעב חנקן. בס obliquus, C16: 0 (חומצה פלמיטית) וC18: 1 (חומצה אולאית) הם שתי חומצות שומן הנפוצים ביותר.

הרכב חומצות השומן והתוכן של Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (diatom) תחת שני גדושים החנקן וימוצה תנאים שמוצגים באיור 3. בדומה לס obliquus, תכולת חומצות השומן וההרכב מושפעים מאוד על ידי רעב חנקן. פ tricornutum גם מייצר כמויות ניכרות של חומצות שומן בלתי רוויות מאוד כגון C20: 5 (חומצת eicosapentaenoic, המשרד לאיכות הסביבה), כמו גם חומצות שומן ארוכות שרשרת מאוד (חומצת יגנוצרית, C24: 0) שניתן לאתרם בשיטה זו.

איור 1 < br /> איור 1. הכרומתוגרמה GC-FID נציג. שימש מדגם נגזר מScenedesmus obliquus נחשף לרעב חנקן. רק 20 דקות הראשונות של הכרומתוגרמה מוצגות. אחרי 20 דקות אין פסגות אותרו במדגם זה.

איור 2
איור 2. הרכב חומצות שומן (שפע יחסי של חומצות שומן) של Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae) תחת שני (פסים השחורים) החנקן מספיקים ותנאי חנקן נשללו טיפוח (פסים לבנים). סך הכל תוכן חומצת השומן היו 8.6 ± 0.5% ו44.7 ± 1.7% ( תנאי גידול נשלל% ממשקל יבש) תחת חנקן מספיק וחנקן, בהתאמה. ברים שגיאה מצביעים הערך הגבוה ביותר והנמוך ביותר של שני משכפל אנליטית.

אוהל "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 3
איור 3. הרכב חומצות שומן (שפע יחסי של חומצות שומן) של tricornutum Phaeodactylum (diatom) תחת שני (פסים השחורים) החנקן מספיקים ותנאי חנקן נשללו טיפוח (פסים לבנים). סך הכל תכולת חומצת השומן היו 11.7 ± 0.9% ו30.5 ± 1.1% (% ממשקל יבש) בתנאי גידול מספיקים וחנקן נשלל חנקן, בהתאמה. ברים שגיאה מצביעים הערך הגבוה ביותר והנמוך ביותר של שני משכפל אנליטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת יכולה לשמש כדי לקבוע את התוכן כמו גם את הרכב חומצות שומן בסך הכל קיימים ביומסה microalgal. חומצות שומן הנגזרות מכל מעמדות השומנים בדם, לרבות אחסון (TAG), כמו גם שומני קרום (פוספוליפידים וglycolipids), מזוהות. ניתן לאתר בכל אורכי חומצת שומן השרשרת והמעלות של רוויה שנמצאות באצות חד ומכובדים. השיטה מבוססת על הפרעה מכאנית של תאים, מיצוי שומנים מבוסס ממס, transesterification של חומצות שומן לfames, וכימות של fames באמצעות כרומטוגרפיה גז בשילוב עם גלאי יינון להבה (GC-FID). שיטה זו דורשת כמויות קטנות של מדגם (5 מ"ג), היא מדויק ולשעתק וניתן להשתמש בם בקרב מגוון רחב של מיני אצות חד. שיטה זו נועדה לשמש למטרות אנליטיות ומותאמת במיוחד לשימוש בגודל מדגם קטן. השיטה לא נועדה להיות מדורגת למעלה ומשמש להפקת גדולהכמויות של חומצות שומן microalgal. מגבלה של שיטה זו היא שזה מייגע וזה יכול לקחת כמה ימים שמיתחילו בהליך לקבלת תוצאות. במיוחד במקרה של ניטור תהליך לייצור חומצת שומן microalgal תעשייה זו עשויה להיחשב הגבלה. אם תוצאות מהירות יותר נדרשות, אפשרויות אחרות, כגון צביעה עם צבעי ניאון lipophilic עשויות להיות מתאימות יותר. ההמלצות הבאות עשויות בכל קשור לביצוע ההליך אנליטיים:

  1. מיצוי והליך transesterification הם טופל באמצעות triacylglycerol (tripentadecanoin) כסטנדרט פנימי. השימוש בתקן פנימי משמש בדרך כלל לכימות של fames בדגימות באמצעות גז כרומטוגרפיה, אבל לרוב סטנדרטי פנימי תהילה הוא בשימוש. מומלץ להשתמש בתקן פנימי TAG ולא סטנדרטי פנימי FAME וכדי להוסיף אותו לפני שיבוש תא ומיצוי בממסים. הפסדים אפשריים במהלך extr שומנים בדםפעולה או transesterification שלם אז יכולה להיות מתוקן ל, שכן הוא צפוי כי הפסדים דומים יתרחשו ברמה הפנימית. יש להשתמש בתקן פנימי שאינו שיתוף elute עם חומצות שומן המיוצרים על ידי אצות חד. בגלל microalgae לייצר רק חומצות שומן עם אפילו מספרי פחמן, TAG המכיל חומצת שומן עם מספר אי זוגי של אטומי פחמן הוא מועמד טוב. מכיוון שעמודת GC והפרוטוקול נפרד לא רק על אורך שרשרת, אלא גם על מידת unsaturation, חומצת שומן רוויה ממוספרת מוזרה יכול באופן היפותטי שיתוף elute עם חומצת שומן בלתי רוויה אפילו ממוספרת. צריך להיות תוקף, כי התקן הפנימי משמש לא שיתוף elute עם חומצות שומן קיימים באופן טבעי במדגם. מהניסיון שלנו עם microalgae השונים, tripentadecanoin (TAG המכיל שלוש C15: 0 חומצות שומן) אינו שיתוף elute עם חומצות שומן קיימים באופן טבעי באצות.
  2. רווי וחומצות שומן בלתי רוויות מאוד לתת תשובות GC-FID שונים (אזורי שיא) בריכוזים זהים. לכן סטנדרטים של fames אמורים לשמש לכיול ונחישות של גורמי תגובה יחסי של חומצות שומן בודדות כפי שתוארו בסעיף תוצאות הנציג. גם סטנדרטים של fames יכולים לשמש כדי לקבוע זמני שמירה של חומצות שומן בודדות. לחלופין, GC-MS יכול לשמש לזיהוי חומצת שומן.
  3. גם זמן השמירה וגורם תגובה יחסי של חומצות שומן בודדות ישתנו עם גיל ציוד GC. כיול תכוף של זמן שמירה וגורם תגובה יחסי ולכן מומלץ.
  4. הפרעה תא מכאנית היא צעד חשוב בשיטה זו. הוא הבין על ידי שילוב של lyophilization, מכות חרוז וsonication. ללא הפרעה תא זה אפשרי, כי לא כל השומנים המחולצים 9,13. אולי, חלק מהצעדים השיבוש הסלולרי הוא הפרעה תא מיותרת ופחות נרחבת (לדוגמא חרוז קצר יותר פעמים מכות) עשוי להניב את אותו מחדשתירררוצים לכמה מיני אצות חד או לביומסה נגזרת מתנאי גידול מסוימים. זה היית צריך אימות לכל מצב ספציפי עם זאת, ולכן פרוטוקול השיבוש הנרחב המוצע מומלץ.
  5. במהלך הליך הניתוח, הממסים המשמשים אולי לחלץ רכיבים מצינורות הפלסטיק וטיפים פיפטה בשימוש. רכיבים המופקים אלה עלולים להפריע לזיהוי של fames באמצעות GC-FID. במיוחד, פעמים רבות חרוז קצבי וטמפרטורה גבוהה במהלך חרוז הכאה יגרמו לזיהום רכיבים. הניסיון שלנו הוא שרכיבים המופקים מצינורות חרוז הכה יגרמו לכמה פסגות נוספות בהכרומתוגרמה GC-FID, שחלקם עם שכבת fames אצות נגזר (בעיקר חומצות שומן הרוויים). כאשר השיטה מבוצעת כפי שהוצע, זה אף פעם לא יותר מ 1-2% מכלל אזור השיא. קירור של צינורות חרוז-המקצף במהלך חרוז הכאה ושימוש בכמויות גדולות יותר של ביומסה לדגימה יפחית את השיא היחסיאזור של פסגות אלה הפלסטיק נגזר. מומלץ להשתמש בטפטפות זכוכית וצינורות זכוכית ככל האפשר לאורך כל הפרוטוקול. יתר על כן, השימוש בכדורי סרק כדי לבדוק ונכון לרכיבים המופקים מפלסטיק, אלא גם כדי לבדוק ולתקן לזיהומים בלמשל הממסים בשימוש, מומלץ.
  6. במהלך תהליך חרוז-המכות, הן חרוז-המקצף וצינורות חרוז-המקצף יהיה לחמם. כאשר חרוז הכאה לזמן ארוך הרבה יותר או סל"ד הרבה יותר גבוה ממוצעים בשיטה זו, וכאשר אין קירור מוחל בין לבין, זה יכול לגרום לרתיחה של הממסים וסופו של דבר לקרע של החצוצרות. זה יגרום לאובדן של מדגם. מניסיוננו, מצב זה מתרחש כאשר חרוז-להכות במשך יותר מ -6 דקות ב 6,000 סל"ד.
  7. Microalgae יכול לייצר חומצות שומן בלתי רוויות מאוד, שיכול להיות מועדים לחמצון. Ryckebosch et al. 9 נצפו כל שינוי בהרכב חומצות שומניות הנגרם על ידי חמצון של f בלתי רוויהחומצות עו"ד במהלך הליכי חילוץ שונים. הוא הציע כי חומרים נוגדי חמצון המתרחשים באופן טבעי באצות חד להגן על חומצות שומן בלתי רוויות אלה מפני התחמצנות. אם הוא חשוד כי חמצון עלול להתרחש, אפשרות תהיה להוסיף נוגד חמצון סינטטי כגון butylhydroxytoluene (BHT) כל עוד נוגדת החמצון אינו שיתוף elute עם fames, וכל עוד את כמות המשמש נוגד חמצון אינה מפריעה כרומטוגרפיה 9. כדי למנוע התחמצנות במהלך אחסון לטווח ארוך, מומלץ לדגימות חנות ב -80 מעלות צלזיוס תחת אווירת גז חנקן.
  8. Lipases הווה באצות עלול hydrolyze שומנים במהלך ההליך אנליטי ולכן משפיע על התוצאות. Ryckebosch et al. 9 מצאו כי lyophilization מנטרלת lipases. יתר על כן, lipases לא לבזות חומצות שומן, אלא רק לנתק אותם מהקבוצה של גליצרול glycerolipids. לפיכך, פעילות lipase לא צריכה להפריע לACI השומן הציגפרוטוקול ד. אנזימים מעורבים במעשה השפלה של חומצות שומן בקואנזים הופעלו חומצות שומן ואת המופע של השפלה כזו בחילוץ ובכך לא נראה סביר. עם זאת, במקרה זה על פי חשד, התמוטטות האנזימטית של חומצות שומן מglycerolipids עשויה להשפיע על תוצאות, אפשרות תהיה להוסיף מעכב lipase, כגון isopropanol, כל עוד המעכב לא מפריע להליך אנליטי עצמו 9.

בשיטה זו ניתן תהיה להרחיב לכמת ולקבוע את הרכב חומצות השומן של שומנים ניטראליים (TAG) ושומנים קוטביים (פוספוליפידים, glycolipids) באמצעות מיצוי מוצק שלב (SPE) צעד הפרדה בין 2 (מיצוי שומנים בדם) צעד ושלב 3 (transesterification ) כפי שתאר למשל ברויאר et al. 1. לחלופין, כרומטוגרפיה בשכבה דקה צעד (TLC) ניתן להשתמש כדי להפריד בין כיתות שומנים קוטביות שונות, למשל כפי שתואר על ידי וואנג ונינג 28.

שיטה זו יכולה להיות מורחבת לשימוש ב, למשל, צמחים, רקמות בעלי החיים ומיקרו אורגניזמים אחרים. בגלל הדגש על הפרעה תא, שיטה זו מתאימה בעיקר לניתוח של חומצות שומן בחומרים שקשים מאוד כדי לחלץ.

חלק החילוץ של השיטה (שלבים 1 ו 2) יכול לשמש להפקת פיגמנטים ורכיבי lipophilic האחרים 23,25. הליך שיבוש התא יכול לשמש להפקה של רכיבים אחרים כגון עמילן או פחמימות באמצעות מערכות ממס אחרות (כוללים מים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש מחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

חלק מהעבודה זו נתמכה כלכלי על ידי המכון לקידום החדשנות באמצעות מדע ומחקר בסיסי-אסטרטגי טכנולוגיה (IWT-SBO) אור שמש פרויקט ותאי BioSolar. אריק בולדר וBackKim נגויין הודו על תרומתם לאופטימיזציה של הליך מכות חרוז.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
  2. Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
  3. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
  4. Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
  5. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
  6. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
  7. Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
  8. Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
  9. Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89 (2), 189-198 (2011).
  10. Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
  11. Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
  12. Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
  13. Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
  14. Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
  15. Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
  16. Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
  18. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  19. Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
  20. Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
  21. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
  22. Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
  23. Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
  24. Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
  25. Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
  26. Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
  27. Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
  28. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).

Tags

מדעי סביבה גיליון 80 טכניקות אנליזה כימית Microalgae חומצות שומן triacylglycerol שומנים בדם גז כרומטוגרפיה שיבוש תא
ניתוח התוכן של חומצות שומן והרכב בMicroalgae
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Breuer, G., Evers, W. A. C., de… More

Breuer, G., Evers, W. A. C., de Vree, J. H., Kleinegris, D. M. M., Martens, D. E., Wijffels, R. H., Lamers, P. P. Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae. J. Vis. Exp. (80), e50628, doi:10.3791/50628 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter