Overview
Purificación del gel se utiliza para recuperar los fragmentos de ADN después de la separación electroforética. Recuperación de ADN de un gel de agarosa incluye tres pasos básicos: encuadernación, lavado y liberador de una columna de sílice. ADN se cree que se unen a la sílice en presencia de sal alta a través de un puente de sal. Siguiendo el enlace, ADN es lavado de impurezas y eluyen condiciones bajo sal interrumpir esta interacción.
Este video va a través de un procedimiento generalizado, paso a paso de cortar una banda de gel, gel de solubilización, purificación mediante el enlace a una columna de sílice y la elución de DNA purificado. Además, la presentación discute varios consejos para asegurar la purificación del gel de éxito, incluyendo la importancia de correr un gel de agarosa con un marcador o una escalera que tiene ADN de tamaño conocido.
Procedure
Gel-purificación es un procedimiento estándar para recuperar deseados fragmentos de ADN de geles de agarosa después de la separación electroforética. Después de disolver el fragmento de gel y ejecutar a través de un filtro especializado, este procedimiento produce ADN liberado de impurezas tales como sales, nucleótidos libres y las enzimas, convenientes para los usos aguas abajo.
El principio básico detrás de recuperación de la DNA del gel de agarosa consiste en una secuencia de bind, lave y eluir pasos. Una vez que el gel es en tampón de solubilización, se aplica en una "columna de spin", que, tras centrifugación, permite que las moléculas de ADN se unen selectivamente a un filtro de sílice mientras las impurezas fluyen a través de un tubo de recogida.
El ADN es capaz de enlazar a gracias a una alta concentración de sal en el tampón de solubilización de gel de sílice. Este buffer se cree que alteran la estructura de hidratación alrededor del filtro y crear un puente de sal de catión entre las fuertes cargas negativas en el filtro y cargas negativas en el DNA. Impurezas residuales se eliminan por lavado con etanol.
Agua tampón salino bajo se agrega a la columna y será "responsables" o libre, el ADN, probablemente interrumpiendo el puente de catión. Ahora se purifica el ADN del gel.
El primer paso en el procedimiento de purificación del gel supone echando el gel de agarosa y la realización de electroforesis de las muestras de ADN. Una vez finalizado el plazo de gel, fragmentos de ADN deseados se visualizaron contra la luz UV y fragmentos se seleccionan después de comparar contra un estándar de peso molecular.
Si el gel es sin mancha, la ubicación de la banda puede ser determinada aproximadamente basado en una comparación a la escalera de ADN. Mientras corta el gel con una cuchilla de afeitar, uno debe tener cuidado para recuperar tanto ADN como posible con agarosa poco como sea posible.
Cuando manejo de bromuro de etidio manchados geles y trabajo frente a la luz UV, deben usarse guantes y gafas protectoras. Después de cortar el ADN deseado del gel, eliminar el buffer gel y funcionando correctamente, en cumplimiento de protocolos de seguridad institucional.
Una vez aislado, el trozo de gel se coloca en un tubo de microcentrífuga y pesó en una balanza. Utilizando la aproximación que 100 mg de gel ocupa 100 l, un volumen de buffer de solublilization que es 4 X que el peso del gel se añade a la pieza de gel. Después de ser colocados en buffer, la pieza de gel se incuba en alrededor de 50 ° C para fundir la agarosa.
Una vez derretido, se añade el gel solubilizado en una columna de spin y la solución se centrifugó, que hará que todo el ADN y otras partículas para pegarse al filtro.
A continuación, se lava el ADN dependiente mediante la adición de etanol al 70%, seguido por centrifugación, que eliminará las impurezas residuales del filtro del filtro. Flujo a través es descartado, y este paso de lavado generalmente entonces se repite hasta tres veces. El filtro de vacío se hace girar otra vez para eliminar el etanol residual, y el filtro de sílice se deja secar a temperatura ambiente. Agua o elución de búfer se añade al filtro, y con otra ronda de centrifugación, el ADN purificado se recoge en la parte inferior del tubo.
El método que has visto sólo se aplica a gel de purificación con filtros de sílice spin columna. Existen otros métodos que hacen uso de los mismos principios básicos de unión del ADN a sílice seguido de pasos de lavado y elución. Por ejemplo, sílice se puede mezclar con ADN en suspensión llamada "glassmilk", que puede ser peleteado y lavado y eluyen más adelante. También, puede utilizarse succión ADN a través de filtros de sílice y, posteriormente, procederá a la elución lo. Asegúrese de entender procesos de purificación de gel de su laboratorio.
Ahora que usted ha aprendido cómo recuperar ADN de geles de agarosa, examinemos algunas aplicaciones posteriores que utilizan DNA obtenida de la purificación del gel.
Por ejemplo, la purificación del gel es un paso intermedio en la inmunoprecipitación de cromatina, una técnica que pretende aislar las proteínas reguladoras que paquete de ADN genómico, con el fin de identificar que las secuencias están siendo reguladas. Los fragmentos aislados son gel purificado y secuenciado, con el fin de asignar a las regiones de cromosomas individuales.
Subcloning - el proceso de mover un gen en un vector a otro - puede implicar la purificación del gel. Por ejemplo, las secuencias del gene de un vector pueden ser digeridas de una construcción y montadas en secuencias quiméricas vía PCR, después de lo cual son gel purificado y en otras construcciones.
Quizás la aplicación más simple de purificación del gel es su uso después de almacenamiento a largo plazo en el ° c-80 de ADN suprimido las bandas después de electroforesis.
Ahora han aprendido a extraer ADN fragmentos de gel de agarosa, las variaciones de bind, lavar y eluir los procedimientos seguidos según la preferencia de usuario individual y finalmente algunas de las posibles aplicaciones posteriores de este método. Como siempre, gracias por ver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
