Summary
הקלטות תיקון מהדק Multi-אלקטרודה מהוות משימה מורכבת. כאן אנו מראים כיצד, על ידי אוטומציה של רבים מהשלבים הניסיוניים, זה אפשרי כדי להאיץ את התהליך מוביל לשיפור איכותי בביצועים ומספר ההקלטות.
Abstract
טכניקת התיקון-clamp היא כיום השיטה הכי המבוססת היטב להקלטת פעילות חשמלית מנוירונים בודדים או תאי subcellular שלהם. עם זאת, להשגת הקלטות יציבה, גם מהתאים בודדים, נותר הליך מורכב למדי זמן רב. אוטומציה של שלבים רבים בשילוב עם תצוגת מידע יעילה יכולה מאוד לסייע experimentalists בביצוע מספר רב יותר של הקלטות עם אמינות גבוהה יותר ובפחות זמן. על מנת להשיג את הקלטות בקנה מידה גדולה שסכמנו את הגישה היעילה ביותר היא לא automatize באופן מלא בתהליך, אבל כדי לפשט את הצעדים הניסיוניים ולהפחית את הסיכוי לטעויות אנוש תוך שילוב ניסיונו של הנסיין ומשוב חזותי ביעילות. עם מטרות אלה בחשבון שפיתחנו מערכת ממוחשבת המרכזת את כל הבקרות הנדרשות לניסוי רב האלקטרודה תיקון מהדק בממשק יחיד, commercgamepad האלחוטי זמין ially, תוך הצגה ברמזי מידע והדרכה ניסוי קשורות במסך המחשב. כאן אנו מתארים את המרכיבים השונים של המערכת שאפשרה לנו להפחית את הזמן הנדרש להשגת את תצורת ההקלטה ולהגדיל באופן משמעותי את הסיכוי להקלטה בהצלחה מספר גדול של תאי עצב בו זמנית.
Introduction
היכולת להקליט ולעורר מספר אתרים עם דיוק מיקרומטר היא מאוד שימושית עבור ניסוי השגת הבנה טובה יותר של מערכות עצביות. טכניקות רבות פותחו למטרה זו אבל אף מאפשרות הרזולוציה submillivolt מושגת על ידי טכניקת תיקון מהדק, חיונית ללימוד פעילות התת ופוטנציאלי postsynaptic בודדים. כאן אנו מכסים את פיתוחה של מערכת התיקון-clamp שנתי עשר האלקטרודה בעזרת מחשב שמטרתה הקלטה בו זמנית ומגרה מספר רב של תאים בודדים בדייקנות מספיק ללימוד קישוריות עצבית. אמנם יכולים להיות יזום יישומים רבים אחרים למערכת כזו, זה משאיל את עצמו במיוחד גם ללימוד קישוריות הסינפטית בהתחשב בעובדה שמספר חיבורים אפשריים בתוך קבוצה של נוירונים גדל באופן פרופורציונלי לריבוע מספר הנוירונים בשאלה. לכן, בזמן שמערכת עם שלוש אלקטרודות מאפשרת בדיקהמופע של עד שישה חיבורים ולרוב הקלטה אחת, הקלטת עשרה נוירונים מאפשר בדיקת ההתרחשות של עד 132 קשרים ולעתים קרובות התבוננות למעלה מתריסר (איור 1). התצפית של עשרות חיבורים בו זמנית מאפשרת לנתח את הארגון של רשתות קטנות ולהסיק מאפיינים סטטיסטיים של מבנה הרשת שלא יכול להיות נחקר אחר 1. יתר על כן, גירוי מדויק של תאים רבים גם מאפשר כימות של גיוס של תאי postsynaptic 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ציוד
- מניפולטורים שליטה ממחשב
- חברו כל תיבת בקר micromanipulator למחשב באמצעות יציאות טוריות (RS-232).
- ליישם את הפקודות למיצוב, ביצוע שאילתות ולהתאים את הגדרות לשליחה באמצעות היציאה טורית. בעיות מהירות ותאימות חומרה לאור C / C + + מומלצת כשפת תכנות.
- סטנדרטיזציה של מערכת ההתייחסות של מניפולטורים כך שאפס הוא המיקום הקרוב ביותר האפשרי ביחס למנועים והתנועה חיובית מופנה הרחק מהמנועים.
- מקם את המיקרוסקופ במיקום המרכזי שלו 2 מ"מ מעל מישור מוקד הדגימה (קואורדינטות [0, 0, 2000]).
- חנות, לכל מניפולטור, הקואורדינטות המקומיות המאפשרות את קצה פיפטה להיות שנצפה במרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ. זוהי נקודת ההתייחסות הראשונית לכל אלקטרודה.
- Visuaעמדות אלקטרודה ליזה. זה מאוד שימושי כדי להיות מסוגל לעקוב אחר המיקום של כל אלקטרודה במהלך ניסוי. ייצוג גרפי הוא הדרך האינטואיטיבית ביותר להשיג זאת. לשם כך מערכות ההתייחסות של כל אלקטרודה וזו של המיקרוסקופ חייבת להיות מתאים. דרך פשוטה לבצע זאת היא:
- להביא את הקצה של אלקטרודה למרכז שדה הראייה.
- אחסן את העמדה בכל ציר של מניפולטור וכל ציר של המיקרוסקופ.
- Execute עם ציר ה-x של מניפולטור תנועה גדולה יחסית (1 מ"מ).
- אתר את הקצה פעם נוספת נע רק במיקרוסקופ.
- חישוב ההפרש בעמדת מיקרוסקופ שכן הוא נמדד אחרון. אלו הן התחזיות של תנועת ציר האלקטרודה על גבי צירי מיקרוסקופ.
- חזור על שלבים 2.3-2.5 עבור Y ו-Z צירים של מניפולטור האלקטרודה. זה מאפשר מטריצה של תחזיות על מיקרוסקופ גרזנים שייקבע (<strong> איור 2) המכונה גם מטריצת קוסינוס:
- הפוך את המטריצה הזאת כדי להפוך אותו ניתן לחשב את התנועות, בשלושת ממדים, הנדרשות על ידי מניפולטור האלקטרודה להגיע למיקום נתון במיקרוסקופ מערכת קואורדינטות:
- שימוש בנקודת ההתייחסות הראשונית ומטריצת קוסינוס לקבוע את המיקום של כל אלקטרודה במיקרוסקופ קואורדינטות.
- להציג באופן גרפי, המבוסס על מיקרוסקופ קואורדינטות, את עמדתו של כל אלקטרודה במרווחי זמן קבוע. אנחנו בחרנו להשתמש C / C + + וספריות ציור (GDI +) לצייר עמדות אלקטרודה כל 40 msec.
- חזור על השלבים 1.2.1 - 1.2.7 בכל פעם שזוויות מניפולטור משתנות או אם שינויי עמדתו של מספר מילימטרים יש צורך, למשל, כאשר הסוג של אלקטרודה הוא שונה.
- לאפשר אחסון positioNS של תכונות רלוונטיות ברקמה, כגון תאים או נקודות התייחסות אנטומיים, במיקרוסקופ קואורדינטות.
- לרכוש וידאו ותצוגת מידע רלוונטי.
- מכאני ליישר את ציר x של תנועה של מיקרוסקופ עם הציר האופקי של המצלמה מיקרוסקופ.
- התקן במחשב framegrabber עם וידאו חי ויכולת כיסוי וערכת פיתוח תוכנה (SDK).
- ליישם פעולת תצוגת וידאו חי עם SDK.
- המרת מיקרוסקופ מערכת קואורדינטות למערכת התייחסות מצלמה על ידי התרגום ואת קנה המידה המתאים.
- צייר את התכונות הרלוונטיות בקואורדינטות מצלמה וכיסוי על הווידאו החי התמונה הנוצרת במרווחי זמן קבועים של כ -40 אלפיות שניים (איור 3).
- מגברי שליטה.
- השתמש בתוכנת המגבר לשלוט בהגדרות המגבר מהממשק.
- שיתוףntrol oscilloscopes.
- חבר את אוסצילוסקופ למחשב באמצעות יציאות טוריות.
- לקבוע את קנה המידה אוסצילוסקופ, צימוד והחלטה זמנית לשלבים השונים של הליך תיקון מהדק במתח-clamp (למשל האלקטרודה באמבטיה, היווצרות חותם, תצורת כל התא) ונוכחי מהדק.
- שלח את פקודות הגדרת אוסצילוסקופ המתאימות בכל פעם שפקודות מגבר מונפקות מהממשק.
- לחץ פיפטה שליטה.
- להרכיב מערכת בקרת לחץ פי איור 4.
- השתמש בספק כוח 12 V / 5 V כדי לספק לכל רכיב אלקטרוני כראוי.
- חברו את היציאה של משאבת קרום אחד למאגר החיובי לחץ (מיכל מיליליטר 100).
- חבר את ההזנה של משאבת קרום אחד למאגר השלילי לחץ (מיכל מיליליטר 100).
- חבר את צינורות בעל פיפטה לחיישן לחץ בpressuמחדש מערכת בקרה וסתום פנאומטי המתחבר לתא הלחץ העיקרי.
- חברו כל אחד ממאגרי הלחץ לשסתום המחובר לתא הלחץ העיקרי.
- חבר שסתום בין תא הלחץ העיקרי ואת האווירה.
- חבר חיישן לחץ לתא הלחץ העיקרי.
- חבר חיישן לחץ לכל מאגר.
- חבר את מערכת בקרת לחץ ללוח רכישת נתונים.
- לחבר כל חיישן לחץ לאחד קלט אנלוגי.
- חברו כל שסתום ליציאה דיגיטלית.
- הסר את לחץ אטמוספרי לקזז מכל החיישנים על ידי פתיחת כל השסתומים, למעט אלו מתחברים למשאבות הקרום והפחתת הלחץ שנמדד.
- ליישם שליטה בלחץ
- להגדיר בממשק שליטה להפעלה או ביטול הפעלת שליטת לחץ חיובי עבור כל פיפטה.
- הגדרת לחץ חיובי מינימאלי לפיפטהים של כ -70 mbar.
- מעת לעת (בכל שנייה 0.5) לזהות בכל פעם שהלחץ בטפטפות תחת שליטה בלחץ פעילה יורד מתחת לסף שנקבע.
- עם מעבר סף לפתוח את חיץ לחץ החיובי לתא הראשי לחץ ותא זה לכיוון פיפטה בשאלה במהלך פרקי זמן קצרים (20 אלפיות שנייה) עד שלחץ בטפטפות הוא מעל לסף. סגור את כל שסתומים אחרים.
- De-להפעיל לחץ שליטה נוספת כמו הגישה הסופית לכיוון תא של עניין היא יזמה.
- החל לחץ שלילי להיווצרות חותמת
- סגור את כל השסתומים ולפתוח את שסתום חיץ לחץ השלילי כלפי התא הראשי לחץ ותא זה לכיוון פיפטה בשאלה למשך הנסיין דורש על ידי שמירה על כפתור נלחץ.
- להרכיב מערכת בקרת לחץ פי איור 4.
- רכז את הפקודות על גבי מכשיר ממשק אדם.
- חבר wirele זמין מסחריgamepad ss למחשב.
- ליישם readout מעמד ג'ויסטיק. לדוגמא, השתמש בספריות DirectX עבור C / C + + לבצע קריאות כל 5 אלפיות שניים.
- להשוות את מצב הנוכחי עם מצב קודם כדי לזהות אילו כפתורים כבר נלחצו, שוחררו או שמרו נלחצו מאז צעד בפעם האחרונה.
- להקצות פונקציות לכל כפתור בgamepad. דוגמא למיפוי זה מוצגת באיור 5.
2. נוהל תיקון מהדק
- הכן את פרוסות המוח של האזור של עניין.
- מניחים פרוסת מוח של עניין, עם האזור של עניין במרכז טווח התזוזה של מיקרוסקופ.
- בחירת תא
- לזהות תאים של עניין על ידי גלישה עם מיקרוסקופ. לאחסן את המיקום של התאים בהתבסס על מיקרוסקופ מערכת קואורדינטות עם קליק ימני בעכבר על תצוגת וידאו בשידור החי בחלקו העליון של התא של עניין. הממשק הגרפי יציג את התאים שנבחרו, כמו גם micropipettes לסקירה ותוכנה גלובליות יוסיף סמן על מיקום התא שיהיה מעולף על התמונות. בנוסף תמונה של התא הוא נתפס לשימוש עתידי בקובץ 'תא #. Jpg'.
- ייחוס של תאים לטפטפות
- לאחר בחירת התאים של עניין, להקצות שפיפטה תתעד כל תא. הממשק הגרפי מספק בקרות משימה שצריכה להיות מוגדרת. דמיין תצוגה מקדימה של התצורה הסופית על ידי בחירת 'פוזיציות סופיות הצג "תיבת הסימון.
- בחר כל פיפטה שלתצוגה המקדימה עמדתו הסופית היא רצויה או סמן את התיבה 'בחר הכל'. השבת את תצוגת המיקום הנוכחית להדמיה טובה יותר במידת הצורך.
- הכן את פיפטות
- מלא טפטפות (6 - 8 MΩ הם בדרך כלל הכי טוב אם טפטפות רבים משמשות) wiה פתרון תאית ומעלה אותם לבעליהם. הנח את headstages בקיבעונות שלהם, אבל לא להחליק אותם קדימה כדי להימנע מלגעת באמבטיה עם קצה פיפטה.
- אפשר לשלוט בלחץ החיובי ולבחור את כל טפטפות, כדי להבטיח שהעצות תישאר נקיות. חלק בעדינות כל headstage במקום.
- איתור הטיפים פיפטה
- מקם את המיקרוסקופ למיקום מרכזי עם פוקוס 3 מ"מ מעל הפרוסה על ידי לחיצה על כפתור R2 תוך כדי לחיצה על כפתור 'A'. השתמש במיקום המתאים לכל מניפולטור כפי שהוא מאוחסן מהניסוי הקודם על ידי לחיצה על כפתור L2 תוך כדי לחיצה על כפתור א
הערה: בשלב זה לא אמור להיות או צל ייחודי של פיפטה בתצוגה או תנועה קטנה לאורך הציר של פיפטה צריכה להיות מספיק כדי להתבונן בה ברוב המקרים. פיצויים להבדלים קלים בצורת פיפטה צריכה להתבצע באופן ידני. - להביא את קצה פיפטה אל מוקד. הנח את הקצה בנקודה המרכזית האדומה של תצוגת וידאו מבלי להזיז את המיקרוסקופ (זה עדיין צריך להיות במיקום [0, 0, 2000]).
- ליידע את התוכנה שפיפטה היא במרכז התצוגה על ידי לחיצה על Z כפתור תוך כדי לחיצה על כפתור C. לאחר כל קצה פיפטה ממוקם, לשלוח פיפטה שאחורה, כך שהפעולות הבאות יכול להיות ממוקם על ידי לחיצה על כפתור L1 אחד תוך כדי לחיצה על כפתור א
- מקם את המיקרוסקופ למיקום מרכזי עם פוקוס 3 מ"מ מעל הפרוסה על ידי לחיצה על כפתור R2 תוך כדי לחיצה על כפתור 'A'. השתמש במיקום המתאים לכל מניפולטור כפי שהוא מאוחסן מהניסוי הקודם על ידי לחיצה על כפתור L2 תוך כדי לחיצה על כפתור א
- מתקרב לתאים
- ברגע שכל הטיפים פיפטה אותרו במדויק וכל פיפטה מיוחסת לתא, באופן אוטומטי למקם טפטפות הקרובה לתאים שלהם. פשוט לחץ לחיצה ימנית במרכז הקבוצה של תאים ובחר את 'האשכול' האפשרות בתפריט הקופץ. בחלון אפשרויות אשכול שיופיע, בחר את כל טפטפות שברצונך למקם בשלב זה ולחץ על "לכו עם כל טפטפות בדקה '. חזור על פעולה זו עבור כל מקבץ של תאים של עניין.
- פrform הגישה הסופית באופן ידני. עמדתו של טפטפות ביחס לתאים יכולה להיות מוגדרת באופן שונה, אך בדרך כלל היא פשוט 200 מיקרומטר הרחק מהתא בציר של פיפטה ו200 מיקרומטר מעליו בכיוון האנכי, וזה מספיק כדי לשמור על הקצה של פיפטה מחוץ לרקמה . חכה עד שהמיצוב של טפטפות הוא סיים ולהעביר את המיקרוסקופ כלפי טפטפת על ידי לחיצה על כפתור R1 תוך החזקת הכפתור C.
- לכייל מחדש כל עמדת פיפטה על ידי התמקדות מיקרוסקופ על קצהו בכל מקום בתצוגת הווידאו ולחיצה על כפתור B תוך החזקת הכפתור ג רשת רבועה אמור להופיע לזמן קצר המציין את המיקום המזוהה של טפטפת. אם המיקום אינו נכון, למקם את הקצה בנקודה של Z תצוגת וידאו ולחץ על הלחצן המרכזי תוך כדי לחיצה על כפתור C.
- לקבוע את התצורה המצורפת התא
- ודא שהתא של עניין לפיפטה הנוכחית הוא בצורה נכונהמסומן. אחרת להזיז את המיקרוסקופ כך שיתאים לתא של עניין עם הנקודה האדומה המרכזית. מארק התא על ידי לחיצה על כפתור Y תוך כדי לחיצה על כפתור C. לחץ על כפתור L2 תוך החזקת C כפתור למצב את פיפטה 200 מיקרומטר הרחק מהתא שהוקצה לו, את המיקרוסקופ באופן אוטומטי לעבור למיקום המתאים.
- התאם את מיקום פיפטה כך שיתאים לנקודה האדומה. התאם את פיפטה קוזזה על ידי לחיצה על כפתור R1 תוך כדי לחיצה על כפתור X.
- הפעל את דופק הבדיקה על ידי לחיצה על כפתור L1 תוך כדי לחיצה על כפתור X. לאט לאט מתקרב לפיפטה לתא המיוחס שלו.
- לאחר התבוננות ביצירת גומה על פני הממברנה של התא להחיל דופק קצר של לחץ שלילי על ידי לחיצה על כפתור Y תוך כדי לחיצה על כפתור Z כדי לאפשר ללחץ מופעל כדי להגיע לתא. פוטנציאל החזקה של כ-65mV צריך שהוקם בשלב זה על ידי לחיצה על כפתור L2 תוך כדי לחיצה על כפתור X.
- תצורת כל התא
- ברגע Giga-חותם נוצר עבור כל תא, להתחיל פקיעת הקרומים על ידי הפעלת לחץ שלילי.
- לבצע הקלטות
- השתמש במערכת גירוי / הרכישה לבצע ההקלטות שלך. החל פולסים או רכבות של פולסים בתא אחד בודד בכל פעם ולבחון את תגובות בתאים שנותרו למפה קישוריות בין התאים המוקלטים.
- נסוגים טפטפות
- ברגע שהקלטות שתסיים, נסוגים טפטפות לאט מהרקמות על ידי לחיצה ימנית ברדיו בלחיצת הכפתור בלוח. בחר 'מיקרומטר לסגת-> פיפטות 500' יש טפטפות לסגת מרחק קצר לאורך הצירים שלהם. שים לב להיסחף בפוטנציאל של התאים (ניקוי הטיפים על ידי יישום כמה לחץ חיובי עשויים לעזור).
- לסגת טפטפות כל הדרך חזרה, לקבוע את מהירות מיצוב ל'מהיר 'ולחזור על אותה הפעולה, אבל לבחור את' הכול '. הסר את השימושטפטפות בעדינות על ידי הזזה את headstages ופותח את טפטפות מהמחזיקים. זה שימושי כדי למנוע מסובב את המחזיקים בארובות שלהם מאז זה יכול מאוד להפריע לעמדת קצה פיפטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות השיטות שתוארו לעיל הצלחנו בביצוע הקלטת כל התא של עד שנים עשר נוירונים בו זמנית, כמעט ואכפיל את המספר הגדול ביותר של תאי עצב בו זמנית ובכך מרחיק הידק התיקון. דוגמאות לרשתות של קשרים סינפטיים ישירים בין פירמידת נוירונים נרשמו בשכבת V של הקליפה החושית של חולדות מוצגות באיור 6.
קביעת פרופילי הסתברות חיבור כפונקציה של מרחק בין גופני לתאים מסוג מסוים היא מדידה אופיינית של עניין שניתן לבצע ביעילות עם מערכת תיקון מהדק רבת האלקטרודה 1. לאחרונה צילום גירוי החל להופיע כיעיל עוד יותר אמצעי להשגת 3,4 נתונים כאלה. חשוב לציין, עם זאת, הנתונים שנרכשו עם מערכות תיקון מהדק רבת אלקטרודה מאפשר הנסיינים לקבל מיפוי מלא יותר של הרשת תחת מחקר, כמו גם כתמים ברזולוציה גבוהה עם פניםסלולארי מתפזר צבעים. בניסויי תיקון מהדק רב האלקטרודה כל תא יכול להיות מוקלט ומגורה, שהוא לעתים קרובות לא המקרה עם טכניקות אחרות כגון צילום גירוי או הדמיה סידן. תכונה זו מאפשרת הנסיינים כדי לעקוב אחר הטיות בקישוריות, כגון שכיחות הגבוהה של קשרי גומלין, שלא ניתן למדוד בדרך אחרת. על ידי גירוי ולהקליט כל נוירון למד שהראינו כי תאי עצב אינם רק מוטה כלפי להיות מחובר באופן הדדי, אלא גם בצורת אשכולות. בקנה מידה של ההקלטות שלנו גם מאפשרת לנו לצפות כי הסתברות חיבור גבוהה יותר קיימת בקרב זוגות של נוירונים שמשותפים שכנים משותפים, כלומר שניהם מחוברים בו זמנית לנוירונים בודדים אחרים ברשת שנדגמו (איור 7 א). תצפית זו הייתה משמעותית בכל intersomatic בן מרחק של 50 מ"מ (50-250 מ"מ). אנו הבחנו גם זוגות של נוירונים שיתוף רבים שכנים משותפים התרחשו יותר באופן משמעותי שלעשר מהצפוי במקרה (7b איור). יתר על כן, זיהינו השפעה על הסתברות חיבור בהתאם למספר השכנים המשותפים של זוג נתון של נוירונים. השכנים נפוצים יותר שהיא חולקת את סיכוי הגבוה יותר זוג נוירונים הוא להיות מקושרים (7 ג איור).
נטייה זו מביאה להיווצרות של קבוצות של נוירונים שיותר בצפיפות מחוברות יותר מממוצע. מעניין לציין, כי קבוצות מחוברות מאוד של נוירונים הציגו לא רק קשרים רבים יותר, אלא גם, באלה בממוצע, חזקים יותר 1. ממצאים אלה הובילו אותנו למסקנה שהמעגלים שמוח מאורגן לא רק בשכבות ועמודות, אלא גם למכלולי תא, כלומר קבוצות של נוירונים שיתוף קישוריות הסינפטית צפופה וחזקה כמו הניח על ידי דונלד הב לפני כמה עשורים.
תוצאות אחרות של עניין שניתן להשיג עם n בו זמנית תיקון-הדק מרובהeurons כולל כימות של הגיוס של עיכוב על ידי פעילות הנ"ל סף במספרים שונים של תאים מעוררים 2. צורה נפוצה של עיכוב בקליפת המוח 5 מתווכת על ידי תאי Martinotti (8 א דמויות ו-B, שהותאמו מברגר ואח'.) אשר מקבלים קלט מתאי פירמידה ולשלב אותה בתורו משפיע, עם כמה חביון, תאי פירמידה אחרים. הראינו כי, לאחר פרצים קצרים של יוצרות עלייה חדה של פעילות בכמה כמו ארבעה תאים פירמידליים, כל תא פירמידה בmicrocircuit מקומי מקבל צורה זו של עיכוב (8C דמויות, ג, ו). אנחנו גם הראו כי פוטנציאל postsynaptic המעכב אלה נוטים להרוות כאשר שמונה או יותר תאים פירמידליים הם גירוי בו זמנית (איור 8E).
סקירה כללית של רכיבי המערכת ניתן לראות באיור 9. Ar הממשק וחומרת התוכנה דואר שמוצג באיור 9 א 'וב', כמו גם ממשק בקר באיור 9c מנחה את האלקטרודות לתאים להקלטה תחת מיקרוסקופ מטרה (9d איור).
איור 1. חישוב של מספר החיבורים שנצפו בניסוי כפונקציה של מספר הנוירונים נרשמו בו זמנית מציג צמיחה ריבועית. חישובים מספריים (למעלה). תרשים להמחשה בו נוירונים נוספים של אותה הרשת מתווספים ברציפות (תחתונה).
איור 2. מערכות קואורדינטות של כל מניפולטור אלקטרודה (צהוב) ומיקרוסקופ (אדום).
ithin-page = "תמיד"> 
איור 3. לכידת מסך של פיפטה גישה כלפי תא שהוקצה עם וקטור מעולף גישה, עמדות תא וסרגל קנה מידה ב.
איור 4. דיאגרמה המתארת מערכת פנאומטי לשליטה בלחץ פיפטה.
איור 5. פקודות במכשיר ממשק האדם המרכז את הפקדים המשמשים במהלך ניסויי תיקון מהדק.
איור 6. דוגמא לשלוש רשתות שלקשרים סינפטיים ישירים הממופים בניסויים נפרדים
איור 7. אפקט השכן משותף. (א) זוגות של נוירונים שבו זמנית להתחבר לתא עצב אחר אחד לפחות ברשת נדגמו (הכחולה) תערוכת הסתברות גדלה באופן משמעותי של להיות מחוברים. (ב) זוגות של נוירונים שיתוף שכנים משותפים מרובים מתרחשים לעתים קרובות יותר מהצפוי במקרה ברשתות שנדגמו. הסתברות חיבור (ג) בתוך זוגות של עליות נוירונים כפונקציה של מספר השכנים המשותפים של הזוג.
איור 8. כימות של הגיוס של תאי Martinotti. (א) ייצוג גרפי של תא פירמידה (אדום) שיוצר סינפסות על תא Martinotti (כחול) אשר בצורות תור סינפסות על תא שני פירמידה (שחורה). (ב) גירוי Supra-סף של תא הפירמידה ( אדום) מוביל לגיוס של תאי Martinotti (הכחול) באמצעות שילוב של הקלת פוטנציאלי postsynaptic מעוררים. תא Martinotti גויס אז מעכב את תא הפירמידה השני (שחורה). (ג) תרשים המייצג את הגירוי של מספר גדל והולך של תאים פירמידליים-הידק תיקון וההשפעות על תא אחר פירמידה. (ד) פוטנציאלי postsynaptic מעכבות ממוצע שנרשמו מתא פירמידה כפונקציה של מספר תאים פירמידליים סמוכים אחרים שהם מגורה. מעובד מתוך ברגר ואח'. 2 (ה) משרעת של עיכוב disynaptic במעגל מקומי נוטה להרוות כאשר 9 או יותר תאים פירמידליים הם Stimulated המציין גיוס מקסימאלי של תאים בMartinotti כנראה הגיע בשלב זה. (ו) החלק היחסי של תאים שקיבלו עיכוב disynaptic מהירות עולה ל 1 כמו מספר גדל והולך של תאים פירמידליים הם מגורה.
איור 9. איור של הרכב של המערכת. (א) ממשק משתמש גרפי עם חלון ראשי, להציג וידאו חי, היכנס חלון וייצוג גרפי. מכשיר ממשק אדם מיקרוסקופ (ב) ומניפולטורים. (ג) עם פקדים להליך ניסיוני. (ד) זכוכית micropipettes בעמדה להקלטת נוירונים מרובים.
איור 10. probabilit הבינומיפונקציות התפלגות y המתארות את החלק היחסי של ניסויים שלהקליט מספר נתון של תאים נתון השימוש עשר אלקטרודות בהצלחה. השוואה בין התשואה של ניסויים בוצעו באמצעות משוב חזותי על ידי משתמשים מנוסים מוצגות בכחול ועל ידי משתמשים מנוסים פחות בתנאים שאינם תנאים אידיאליים באדום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שאלה מיידית שעולה בדרך כלל בדבר שיעור הצלחה של ההליך שתארנו מ. לשיעורי הצלחה גבוהים הכנה היא חיונית. טפטפות חייבת להיות פתחי קצה שנחשבים כמספיקים לאדם התאים שנרשם. סינון הפתרון תאיים, כדי למנוע טפטפות הסתומה הוא גם חשוב. טפטפות מאוד נקייה, טרי משכה הן דרישה אחרת. התפלגות הבינומית היא הדגם הפשוט ביותר שניתן להשתמש בם כדי להבין כיצד נושאים אלה משפיעים על התשואה הסופית. זה סביר לצפות הנסיין עם ניסיון וציוד מתאים כדי להשיג שיעור הצלחה של 80% או יותר בהקלטת נוירונים בודדים עם משוב חזותי. ניתן לצפות למתחילים כדי להשיג שיעורי הצלחה נמוכים בהרבה, במיוחד אם צעדי הכנה חשובים מתעלמים. איך שיעורים אלה לתרגם במספרם של התאים שנרשמו לניסוי שניתן לראות באיור 10. עליות נוספות במספר בו זמנית תיקון-צדפותנוירונים ped הנראה ידרשו מזעור של מניפולטורים ואמינות מוגברת של ההליך, אשר בתורו דורש תשומת לב משמעותית לפרטים, אבל הם ריאלי לחלוטין.
רבגוניותה של המערכת שהוצגה כאן היא עדיין נחקרה ויישומי רומן לעתים קרובות כבר נמצאו, ובמיוחד בחקר הקשר בין אותות תאיים ופעילות הנוירון בודדת 7. השיקולים אנטומיים הפכו חשובים יותר כמו המרחק בין עליות תאים מוקלטות. עם זאת, מערכת זו בהחלט מאפשרת חקירה של ארוך טווח וקישוריות בין שכבה לכל מקום שהקשרים יישארו ללא שינוי בעקבות הליך החיתוך.
שליטת micromanipulator
מה שמאפשר מיקום אוטומטי עם micromanipulators מאוד מאיץ את התהליך של תיקון מהדק רב האלקטרודה ומגביר את האמינות שלה ולהפחית את ההתרחשות שלטעויות אנוש. יצרנים שונים מספקים פתרונות שונים על מנת ליצור חיבור מהמחשב למניפולטורים. אפשרות נפוצה היא סדרתי או יציאת USB. על מנת להבטיח תקשורת מהירה הקדשנו יציאה טורית לכל בקר מניפולטור. התכונה שימושית ביותר של מיקום אוטומטי היא כנראה החיסול של רוב התנועה לרוחב והאנכית של אלקטרודות בתוך הרקמות והגבלת העיוות שלה. כתנועה של אלקטרודות בתוך הרקמה מתרחשת כמעט אך ורק לאורך בכיוון הצירי, ההפרעה מכאנית היא ממוזערת. תנועות לרוחב נחוצות רק כדי להימנע מדי פעם דם כלי דם ותאים.
דמיינו עמדות אלקטרודה
זה שימושי כדי להיות מסוגל לעקוב אחר המיקום של כל אלקטרודה במהלך ניסוי מאוד. בראייה מפסידה הגדרה מסורתית של האלקטרודה יכולה להיות בעייתי במהירות. בעת שימוש במספר רב של אלקטרודות זה לאניתן לשמור את כל אלקטרודות בתוך שדה הראייה בכל העת. בהסתמך על ייצוג גרפי הוא החלופה האינטואיטיבית ביותר וגם מסייע בשמירה על המסלול של התקדמות הניסוי, באופן מיידי מראה שהאלקטרודות כבר שממוקמות בתצורה הסופית שלהם ואלה שאין להם.
רכישת וידאו וכיסוי
היכולת להציג וידאו חי מהשטח מיקרוסקופ מבט על חלון יישום היא מאוד שימושית. חלון הראווה הייתה מתוכנת להגיב ללחיצות עכבר המאפשרות אחסון של עמדות של עניין (somata תא), כמו גם עדכון מהיר של המיקומים יחסי בין מיקרוסקופ ואלקטרודות הסרת שגיאות שהצטברו בכל פעם שהם מופיעים. אנחנו גם יישמנו את השכבה של מידע מעשי על וידאו חי כגון מסלול גישה לכל אלקטרודה כלפי תאים שנבחרו או סימון של תאים אלה (איור 3). o רישוםתכונות f וחפיפה בין תמונות עזר כגון דמויות מאטלסים אנטומיים גם יושמה כדי לסייע בי האזורים של עניין הם לא ברורים מייד.
מגברים
מגברי מיקרוסקופ מבוקר מחשב עשויים לאפשר שליטה להתקיים מיישומים אחרים גם כן. זה מגביר באופן דרסטי את המהירות ואמינות שבה ניתן להקליט תאים מרובים בו זמנית ומבטל את המקור העיקרי לטעויות אנוש. בעקבות שליטה בעזרת מחשב מיצוב ולחץ פיפטה זה הצעד שמייצר את הרווחים הבולטים ביותר בזמן אבל הרווחים באמינות הם אפילו יותר חשוב.
אוסצילוסקופ
להבטיח שאותות הבדיקה ניתן דמיינו בזמן אמת בקנה המידה המתאים ורזולוציה של זמן משפרת באופן משמעותי את היעילות שבי הנסיין יכול לבצע צעדים ניסיוניים. על ידי צימוד סט אוסצילוסקופTings למגבר מצבים (כגון מהדק הנוכחי או מתח) שהבטחנו כי צעדים קריטיים בזמן הוצאו להורג ומדמיינים עם מעט מאמץ כגון מחזיק תאים בפוטנציאל קרום מתאים מייד לאחר השגת התצורה המצורפת התא. ההדמיה פרופר הייתה מובטחת על ידי שליחת פקודות קנה מידה וצימוד המתאימות דרך היציאה טורית בפרוטוקול עצמו אוסצילוסקופ כדי להתאים את המשרעת וקיזוז של אותות הבדיקה בתוך מסך אוסצילוסקופ.
שליטה בלחץ פיפטה
ככל שמספר מועסקים באלקטרודות עליות ניסוי, על מנת להבטיח שלחץ חיובי מיושם באופן קבוע כדי לשמור על הקצה של אלקטרודות הזכוכית נקיות הופך להיות תובעניים יותר, עד כדי שהיווה מכשול חשוב. לחץ מספיק חיובי ושלילי (כמה מאות mbar) יכול להיווצר על ידי משאבות הממברנה פשוטות. על מנת לייצב את הלחץ, משאבות אלה בשילוב מחדשservoirs של כ 100 מיליליטר שפתחו וסגירה נשלט על ידי שסתומים פנאומטיים. השסתומים בתורו היו שימוש בכרטיס רכישת נתונים מבוקר מחשב. התרשים של מעגל פנאומטי שניתן לראות באיור 4. בקר הלחץ מבצע תפקיד חשוב לא רק טיפים פיפטה הבטחה להישאר נקיים, אלא גם מאפשרים היווצרות של חותמות Gigaohm במהירות, עם התצפית של גומות על קרום התא כמו טפטפות לגעת בתאים, מאיצים את ההליך נוסף.
מכשיר ממשק האדם
רוב ההגדרות הניסיוניות הפקדים של ציוד ניסיוני פיזור הגדול על פני שטח גדול. אנחנו מרוכזים פקדים הנפוצים ביותר בgamepad האלחוטי יחיד (איור 5) מקטינים מאוד את הזמן ומאמץ הדרוש כדי להקליט כל תא אבל הכי חשוב, ומבטל מקורות של טעות אנוש שיכול לעתים קרובות להביא ניסויים גדולים לדואר המוקדםnd.
שפת תכנות
היו לנו בחירה מעט מאוד במונחים של שפת תכנות עבור יישום זה מאז השפה היחידה שתמכה באינטגרציה של כל הציוד הנדרש הייתה C / C + +. אחד יתרונות גדולים של C / C + + הוא האפשרות ליישם נושאים שעיבוד מרובים ומלוא רווח משיפור הביצועים המוותר במעבדים מרובות ליבות.
רכישת נתונים אלקטרו
המערכת שתארנו משאירה את הבחירה של מערכת רכישת נתונים תוכנת הקלטת אלקטרו ועד לנסיין. חילופי תקשורת בין תוכנת נתוני רכישה והיישום שלנו יכולים להתקיים על יציאות טוריות או באמצעות תקשורת שקע ברשת.
מבט לעתיד
יותר מ 30 שנים מאז הניסויים המכוננים של Sakmann והנהר, טכניקת התיקון-clamp היא סטילl לבד במתן נתונים עם שילוב מסוים של רזולוציה אות ותדר דגימה הנדרשים למגוון רחב של ניסויים, ובמיוחד אלה הנוגעים לאיתור של זרמים פוסט סינפטי בודדים או פוטנציאלים. על ידי פיתוח מערכת ממוחשבת המאפשרת הקלטה של נוירונים רבים בו זמנית שמטרתן להרחיב את האפשרויות הניסיוניות של טכניקת תיקון מהדק. שילוב של אפשרויות חדשות כגון עם ההתפתחויות האחרונות במדעי המוח הניסיוניים 8-13 יכול לפתוח את הדרך להבנה עמוקה יותר של מעגלים עצביים במהירות ובפירוט חסרי תקדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לגלעד זילברברג, מישל Pignatelli, תומאס ק ברגר, לוקה Gambazzi, וסוניה גרסיה לייעוץ רב ערך על שיפורים לאוטומציה הליך תיקון מהדק. אנו מודים Rajnish ראנג'אן לקבלת ייעוץ וסיוע ביישום תוכנה יקרים. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי האיחוד האירופי בפרויקט סינפסה ובחלקו על ידי התכנית למדע הגבולות האנושי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
References
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
- Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
- Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
- Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
- Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
- Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
- Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).
