Summary
多电极膜片钳记录构成一个复杂的任务。这里,我们显示了如何通过许多的实验步骤的自动化,因此能够加速导致质的提高的性能和记录的数目的过程。
Abstract
膜片钳技术是目前最行之有效的方法,用于记录电活动从单个神经元或他们的亚细胞区室。然而,实现稳定的记录,即使从单个细胞,仍具有相当复杂耗时的过程。在与高效率的信息显示结合多步骤的自动化可以极大地帮助实验者与更高的可靠性进行录音的数量较多,并在更短的时间。为了实现大规模的录音,我们得出的结论是最有效的方法是不完全使自动化过程,但为了简化实验步骤和减少人为错误的可能性,同时有效地掺入实验者的经验和视觉反馈。考虑到这些目标,我们开发了其中集中了所有必要的控制的多电极膜片钳实验中的单个接口,COMMERC计算机辅助系统ially可用的无线游戏手柄,在电脑屏幕上显示实验相关的信息和指导线索。在这里,我们描述系统使我们能够减少用于实现记录配置的时间,大幅增加成功记录大量的神经元同步的机会的不同组成部分。
Introduction
与微米精确记录和刺激多个站点的能力是通过实验获得更好地了解神经系统非常有用。许多技术已被开发,为此,但没有允许通过膜片钳技术,对于研究的亚阈值的活性和个体的突触后电位所必需的submillivolt分辨率实现的。这里我们介绍一个12 - 电极计算机辅助膜片钳系统旨在同时记录和刺激大量单个细胞以足够的精度对神经元连接的研究的发展。而许多其它应用中,可以设想这样一个系统,它本身特别好到的突触连接的研究考虑到在一组神经元的可能的连接的数量成比例地增大到所讨论的神经元的数量的平方。因此,在具有三个电极的系统允许测试发生多达六个连接和最经常记录单1,记录12的神经元可以检测多达132连接的发生,经常观察超过一打( 图1)。几十个连接的观测同时使得能够分析小型网络的组织和推断出网络结构的统计特性不能被探测否则为1。此外,许多细胞的精确刺激也允许招募突触后细胞2的定量。
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Protocol
1。设备准备
- 从电脑控制机械手
- 通过串口(RS-232)每个微操作控制盒连接到电脑。
- 实施命令进行定位,查询和调整设置通过串口发送。考虑到速度和硬件兼容性问题的C / C + +被推荐为编程语言。
- 标准化的操纵器的基准系统,以使零是相对于所述电动机和积极运动从马达引导离开最接近的可能位置。
- 定位显微镜在其中央位置2毫米以上的标本焦平面(坐标[0,0,2000])。
- 存储,每个操纵器,该局部坐标系,使在视显微镜领域的中心到被观察的移液管的尖端。这是对每个电极的初始参考点。
- Visua丽泽电极的位置。能够在实验中要跟踪的每个电极的位置是非常有用的。图形表示是解决这个问题的最直观的方法。为此各电极和参考的系统,在显微镜的必须匹配。做到这一点的简单方法是:
- 把一个电极的前端到所述视场的中心。
- 存储在机械手的各轴的位置和显微镜的各轴。
- 执行与该机械手相对大的运动(1毫米)的x轴。
- 找到一次只移动显微镜的尖端。
- 计算在显微镜位置的差异,因为它是最后一次测量。这些都是在电极轴运动到显微镜轴上的投影。
- 为Y和电极操纵器的Z轴上2.5 - 重复步骤2.3。这使得投影矩阵到显微镜轴来确定(<STRONG>图2),也称为余弦矩阵:
- 反转这个矩阵,使其能够计算运动,在三维空间中,以达到在显微镜坐标系统中的给定位置所必需的电极操纵器:
- 使用初始基准点和余弦矩阵确定在显微镜各电极的位置坐标。
- 显示图形的基础上,在显微镜坐标,每个电极的定期的位置。我们选择使用的C / C + +的绘图库(GDI +)来绘制电极位置每隔40毫秒。
- 重复步骤1.2.1 - 1.2.7每个机械手的角度被改变,或者如果需要几毫米的位置变化时,例如,当电极的类型而改变。
- 使存储positio的相关特征纳秒的组织,如细胞或解剖参考点,在显微镜坐标。
- 获取视频和覆盖相关的信息。
- 机械地对准显微镜的运动的x-轴与显微镜照相机的水平轴。
- 在计算机上安装有视频直播和覆盖能力和软件开发工具包(SDK)图像采集卡。
- 实施实时视频显示操作的SDK。
- 转换显微镜的坐标系统到摄像机参考系统通过适当的平移和缩放。
- 绘制有关的功能中的实时视频所产生的图像以大约40毫秒( 图3)定期照相机坐标和覆盖。
- 控制放大器。
- 使用放大器的软件来控制从接口放大器设置。
- 合作ntrol示波器。
- 使用串行端口的示波器连接到PC。
- 确定示波器规模,耦合和时间分辨率在电压钳的不同步骤的膜片钳程序( 如电极的浴室,封口平整,全细胞配置)和电流钳。
- 发送相应的示波器设置命令时放大器的命令是从接口发出。
- 控制吸管的压力。
- 根据图4的组合的压力控制系统。
- 使用12 V / 5 V电源适当地供给各电子元件。
- 一膜泵的输出连接到正压缓冲液(100毫升的容器)。
- 一个膜泵的输入端连接到负压缓冲液(100毫升容器)。
- 移液器支架管连接在pressu压力传感器重新控制系统和气动阀连接到主压力舱。
- 各压力缓冲器的连接连接到主压力室的阀。
- 连接主压力室与大气之间的阀。
- 压力传感器连接到主压力舱。
- 压力传感器连接到每个缓冲区。
- 压力控制系统连接到数据采集板。
- 每个压力传感器连接到一个模拟输入。
- 每个阀门连接到数字输出。
- 去除大气压力打开所有阀门除了那些连接到隔膜泵和减去测得的压力来自所有传感器的偏移。
- 实现压力控制
- 在接口定义控件激活或去激活每个移液器正压控制。
- 定义吸管最小正压的S约70毫巴。
- 定期(每0.5秒)检测时主动下压控制在吸液管压力低于设定的阈值。
- 当阈值交叉打开正压缓冲到主压舱和车厢这对有问题的吸管在短暂的周期(20毫秒),直到吸液管压力高于阈值。关闭所有其它阀门。
- 去激活更多的压力控制,对目标细胞的最终办法启动。
- 应用负压密封形成
- 关闭所有阀门,并打开向主压舱和车厢这对吸管有问题的实验者需要通过保持按下按钮期间负压缓冲阀。
- 根据图4的组合的压力控制系统。
- 命令集中到一个人机接口设备。
- 连接市售wireleSS手柄到PC。
- 实施操纵杆状态读数。例如,使用DirectX库的C / C + +来进行读数,每5毫秒。
- 与以前的状态比较当前状态,以检测哪些按钮已被按下,释放或保持按下自最后一次一步。
- 在手柄的功能分配到每个按钮。这种映射的一个例子示于图5。
2。膜片钳程序
- 制备所关注的区域的脑切片。
- 放置的兴趣的脑切片,用在显微镜的位移范围的中心感兴趣区域。
- 小区选择
- 通过浏览与显微镜识别感兴趣的细胞。存储单元的基础上,显微镜坐标系的位置与右上关注单元的顶部的实况视频显示器上的鼠标点击。 图形化界面将显示选定的单元格,以及将微量的全球概览和软件将添加一个标记上,将要在图像上叠加的单元格位置。此外,该单元的图像在文件'细胞#。JPG“捕获以供将来参考。
- 选择感兴趣的细胞后,分配哪些吸管将记录每一个细胞。图形化界面提供了应设置的分配控制。通过选择复选框“显示最终位置”可视化的最终配置的预览。
- 选择它的最终位置预览期望或检查的“全选”复选框,每个吸管。如果需要禁用当前位置显示为更好的显示效果。
- 填写移液器(6 - 8MΩ通常是最好的,如果很多移液器使用)无线TH细胞内的解决方案并将它们加载到其持有人。放置的探头在他们的注视,但不滑动他们前进,避免接触浴枪头。
- 使正压控制和选择所有移液管,以确保提示将保持清洁。轻轻滑入到位每个探头。
- 显微镜定位与聚焦3毫米薄片按按钮R2固定按钮“A”,而上面的中心位置。使用相应的位置上的每个机械手按下按钮,L2为存储从以前的实验中同时按住按钮A。
注:在这一点上应该有一个吸管鉴于无论是独特的阴影或沿吸管的轴的小运动应该足以观察它在大多数情况下。补偿在吸管的形状略有不同,必须手动执行。 - 把枪头成焦点。将吸头在视频显示的红色圆点中央,而无需移动显微镜(它应该仍然是在位置[0,0,2000])。
- 通知移液器是在显示器的中心按下按钮z按住按钮C之后每个移液器吸头所在的软件,发送吸管向后,使下面的人能够同时按住按钮A位于按L1键
- 一旦所有的枪头已精确定位,每个吸管被归结为一个单元格,自动定位接近各自细胞的移液管。只需右键单击该组细胞的中心,并选择弹出菜单上的选项'集群'。上会出现,选择所有你想要在这个时候定位移液器,点击'去了所有检查移液器'群集选项窗口。重复此操作所关注的细胞的每个集群。
- PE手动rform最后的办法。相对于细胞的吸移管的位置可以被指定不同的,但通常是简单地200μm的距离的移液管和200μm的上方在垂直方向上,这是足以使移液管的尖端的组织以外的轴的小区。等到移液器的定位完成后,按R1键同时按住按钮C移动显微镜对吸管
- 通过随时随地聚焦显微镜在其尖端的视频显示,然后按B键同时按住按钮C.一个正方形网格重新校准每个吸管的位置应该短暂地出现,指示移液管的位置确定。如果位置不正确,定位针尖上的视频显示,然后按下按钮z的中央点的同时按住按钮C。
- 确认的利息为当前移液器细胞是正确的标记。否则,将显微镜的利益与中央红点的单元格相匹配。马克按下按钮Ÿ同时按住按钮C.按L2键同时按住按钮C定位吸管200微米远离其指定单元格的单元格,在显微镜会自动移动到相应的位置。
- 调整吸管位置,它的红点相匹配。调整吸管按R1键同时按住按钮十偏移
- 按L1键同时按住按钮十,慢慢地接近移液器其归因细胞激活测试脉冲。
- 在观察细胞的膜表面上的凹坑的形成施加的负压的简要脉冲通过按下按钮Ÿ同时按住按钮Z到允许所施加的压力,以达到细胞。约-65mV的钳制电位应该在这一点上按下按钮,L2按住按钮成立十
- 一旦一个千兆密封形成为每个小区,开始通过施加负压力破裂的膜。
- 使用刺激/采集系统来执行你的录音。应用脉冲或在一个单独的细胞的脉冲串的时间和观察剩余的细胞反应来映射记录细胞间的连接。
- 一旦录音完成后,退去吸管慢慢地从组织通过右键单击该表单选按钮。选择“退去 - >移液器500μm的'有退去的移液管沿其轴线不远。观察漂移的细胞电位(通过应用一些正压清除提示可帮助)。
- 退去移液器所有回来的路上,设置定位速度,以'快',并重复相同的操作,但选择了“全部”选项。卸下用过的移液器轻轻滑出的探头和旋从人的移液管。为了避免扭曲持有人在各自的插槽中,因为这可能会极大地与枪头位置妨碍它是有用的。
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Representative Results
按照以上描述的方法,我们成功地同时进行多达12神经元的全细胞记录,几乎增加一倍的最大数目的神经元同时膜片钳制迄今。记录大鼠的躯体感觉皮层V层锥体神经元之间的直接的突触连接的网络的例子示于图6。
的连接概率访问,作为对于给定的细胞类型间体的距离的函数的确定为感兴趣的典型的测量,可以有效地与多电极膜片钳系统1来进行。最近的照片刺激开始出现作为一个更有效的方式获得这些数据3,4。重要的,但是,与多电极膜片钳系统获得的数据允许实验者获取所研究的网络的更完整的映射,以及高分辨率的染色用帧内细胞扩散染料。在多电极的膜片钳实验的每一个细胞都可以被记录和刺激,这常常是不与如光刺激或钙成像的其它技术的情况。此功能可让实验者跟踪偏差的连通性,如发生率高相互连接,不能进行测量,否则。通过刺激和记录每一个神经元的研究,我们发现,神经元不仅是偏向被相互连接,也形成集群。我们的录音的规模也使我们观察到一个更高的连接概率存在对神经元共同的邻居, 也就是被两个同时连接到采样网络( 图7a)其他单个神经元之间。此观察显著在50毫米每intersomatic距离斌(从50至250毫米)。我们还观察到对神经元分享许多共同的邻居发生显著更多的10比预期的偶然( 图7b)。此外,我们发现,根据由给定的一对神经元的共同的邻居数量上连接概率的效果。它的股票就越有可能对神经元的较常见的邻居是相互连接( 图7c)。
这种趋势导致了神经元的组被更密集地互连,比平均的形成。有趣的是,神经元的高度互连的基团,不仅表现出更大量的连接,而且,在平均来说,更强的1。这些发现使我们的结论是,新皮层电路不仅在组织层和列,但也到电池组件, 即神经元密集的共享和强大的突触互联作为几十年前推测唐纳德·赫布的群体。
其他感兴趣的结果,可与多个同时膜片钳n为达到eurons包括在不同数目的兴奋性细胞2的抑制超阈值活动招募的量化。抑制在新皮质5的无处不在表格由马丁诺蒂细胞( 图8a和 b,改编自Berger 等 ),其从锥体细胞接受输入,它反过来又影响到集成,具有一定的延迟,其他锥体细胞介导的。我们发现,扣球活动在短短四个锥体细胞的短暂爆发后,每个锥体细胞在局部微电路接收这种形式的抑制( 图8C,c和f)所示 。我们还发现,这些抑制性突触后电位趋于饱和时,八个或更多的锥体细胞同时刺激( 图8E)。
系统组件的概述可以看出,在图9中 。该软件界面和硬件AR示于图9a和 b以及在图9c引导电极对细胞进行根据显微镜的物镜( 图9d)的记录之后,控制器接口ë。
图1。在实验中作为同时记录的神经元的数目的函数观察到的连接数的计算表明一个二次增长。数值计算(顶部)。说明图,其中依次加入同一网络的进一步神经元(底部)。
图2。协调各电极操纵器(黄色)和显微镜(红色)的系统。
图3。吸管的屏幕截图在朝着与叠加方法载体,细胞的位置和比例尺分配单元的方法。
图4。图解气动系统的移液管压力控制。
图5。命令,集中在膜片钳实验中使用控制人机接口设备上。
图6。三个网络的例子映射到单个实验中直接的突触联系
图7。共同邻居效应(一)双神经元同时连接到采样网(蓝色)中的至少一个其他神经元表现出显著增加的相互连接的概率。(二)神经元共享多个通用邻居成对出现往往比预期偶然的采样网络。(三)对神经元的增加作为由一对共同的邻居的数目的函数内的连接的概率。
图8。量化马丁诺蒂细胞的招募。 )(一)图形表示形成突触到马丁诺蒂细胞(蓝色)从而形成突触到第二锥体细胞(黑色)。(二)超临界锥体细胞的刺激(红色)通过促进兴奋性突触后电位的整合导致了招聘马丁诺蒂细胞(蓝色)。本招募马丁诺蒂细胞则抑制了第二锥体细胞(黑色)。(三)图表代表膜片钳制锥体细胞和另一种锥体细胞的影响,越来越多的刺激。从锥体细胞记录(四)一般抑制性突触后电位作为其对刺激的其他邻近锥体细胞的数目的函数。由Berger 等。 图 2(e),其适于disynaptic抑制在本地电路的振幅趋于饱和时,9个或更多锥体细胞是STIMulated指示可能在这一点上达到了马丁诺蒂细胞的最大招募(F)快速接收disynaptic抑制细胞的比例上升到1作为增加锥体细胞受到刺激号码。
图9。说明该系统的合奏。(a)与主窗口,实时视频显示图形用户界面,登录窗口和图形表示。与实验过程控制(二)显微镜和操纵。(三)人机接口设备(D)玻璃在微量记录多个神经元的位置。
图10。二项式probabilit实验使用的视觉反馈由有经验的用户进行的产率之间描述的实验中,成功地记录单元给出了使用12电极的给定数量的比y的分布函数。比较以蓝色显示,并通过在非理想条件下缺乏经验的用户为红色。
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Discussion
一个直接的问题,通常发生关于我们描述的过程的成功率。对于高成功率的准备是必不可少的。移液器必须有尖端的孔,它们足以记录细胞生物。过滤该溶液内,以避免堵塞移液器也是重要的。非常干净的,新鲜的拉移液管是另一种要求。甲二项式分布,可用于理解这些问题如何影响最终产率的最简单的模型。它是合理的期望实验者有经验和适当的设备,以达到80%或以上的记录与视觉反馈的单个神经元中签率。初学者可以有望实现低得多的成功率,特别是如果重要的准备步骤被忽略。如何将这些翻译率在每个实验记录细胞的数量可以看出,在图10中 。同时在补丁蛤的数量进一步增加PED的神经元将可能需要操纵器的小型化和程序,而这又需要大量的关注细节的可靠性提高,而且是完全可行的。
这里介绍了系统的通用性仍在探索和新的应用经常被发现,特别是在细胞外信号和个别神经元活动7之间关系的探索。解剖学因素成为作为记录单元之间的距离增加更重要。然而,这个系统绝对可以让远程和层间连接的地方调查的连接保持不变下的切片过程。
微操作机器人控制
使自动定位与显微操作大大加快多电极膜片钳的过程,并增加它的可靠性,减少的发生人为错误。不同的制造商提供不同的解决方案,以建立从PC到操纵器的连接。一个常见的选择是一个串口或USB口。为了保证快速的通信,我们致力于一个串行端口到每个机械手控制器。自动定位的最有用的功能是可能消除内部的组织,并限制其变形的电极最横向和垂直运动。作为组织内部电极的运动发生几乎完全沿轴向方向,机械干扰被最小化。侧向运动是只需要偶尔避免血液血管和细胞。
可视化电极位置
它是能够在实验中要跟踪的每个电极的位置非常有用。在传统的设置忽视的电极可以快速成为问题。当使用大量的电极是不可以保持所有电极的视场范围内的任何时候。依靠图形表示是最直观的替代,也有助于保持跟踪实验的进展,即刻示出电极已经被定位在其最后的配置,以及哪些没有。
视频采集和覆盖
在应用程序窗口从视场显微镜显示实时视频的能力是非常有用的。显示窗口被编程到鼠标点击可实现存储的权益(细胞胞体)的位置,以及显微镜和电极去除累积的错误时,他们之间出现的相对位置快速更新回应。我们还实施了现场视频,如运动轨迹的方法对每个电极对选择的单元格或这些细胞的标记( 图3)的实用信息的叠加。 Ø注册F特点和辅助图像,如从解剖图谱数据的叠加也被实施,以协助那里的感兴趣区域都尚不清楚。
放大器
计算机控制的显微镜放大器可允许控制,采取从其他应用程序。这极大地提高了速度和可靠性与多个小区可以同时记录和消除人为误差的主要来源。继电脑辅助定位和吸管压力控制这是产生最明显的收益时间,但收益的可靠性更为重要的一步。
示波器
确保测试信号可以在适当的比例进行可视化的实时和时间分辨率大大增强与实验者可以执行的实验步骤的效率。通过耦合示波器集吊环放大器模式(如电流或电压钳),我们确保被执行和可视化的时间关键步骤不费吹灰之力如实现细胞连接的配置后,立即抱着细胞在适当的膜电位。适当的可视化得到保证由通过串行端口发送适当的缩放和耦合命令在示波器的自己的协议,以适应幅度和示波器屏幕内的试验信号的偏移量。
移液管压力控制
由于在实验中采用的增加电极的数量,从而确保正压力被施加永久地保持玻璃电极的前端的清洁变得更苛刻,以构成一个重要的障碍的程度。足够的正和负压力(几百毫巴)可通过简单的膜泵来产生。以稳定的压力,这些泵被连接到重的大约100ml的开幕式和闭幕式是由气动阀控制,藏的。反过来阀是计算机控制的使用的一个数据采集卡。气动回路的图可以看出,在图4中 。压力控制器进行了重要的作用,不仅确保移液器吸头保持干净,但也允许千兆欧姆密封件的形成很快,当凹坑在细胞膜上观察作为移液器触摸细胞,进一步加速该过程。
该人机接口设备
大多数实验设置有实验设备广泛分布在大面积的控件。我们集中在最常用的控件在单个无线手柄( 图5),大大降低了记录每个细胞,但最重要的是所需要的时间和精力,消除人为错误的来源而这往往带来较大的实验,以过早ëND。
程序设计语言
我们只有很少的选择,在编程语言这个应用程序方面,因为这支持集成所需的全部设备的唯一语言是C / C + +。 C / C + +的一大优势是由多核心处理器所允许的性能改进实现多个处理线程,充分利润的可能性。
电数据采集
我们描述的系统中留下的电生理记录的软件和数据采集系统最多实验者的选择。交易所数据采集软件和我们的应用程序之间的通信可以发生在串行端口或通过在网络套接字通信。
未来展望
超过30年以来索克曼和内尔的开创性实验中,膜片钳技术是STIL升单独提供的数据与信号的分辨率和采样频率所必需的各种各样的实验,特别是特定的组合是那些涉及个人突触后电流或电势的检测。通过开发电脑辅助系统,能够记录许多神经元同时我们旨在扩大膜片钳技术的实验的可行性。与近期发展实验神经科学8-13这样的新的可能性的组合可以打开对以前所未有的速度和细节的神经回路的更深刻的理解方式。
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Disclosures
作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们要感谢吉拉德西尔伯贝格,米歇尔皮尼亚泰利,托马斯·K.伯杰,卢卡Gambazzi,和索尼娅·加西亚就改善了膜片钳过程自动化宝贵意见。我们感谢Rajnish兰詹的宝贵意见,并与软件实施援助。这项工作是由欧盟Synapse项目和部分由人类前沿科学计划提供部分资金。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
Manipulators | Luigs Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
Membrane pump | Schego | Optimal |
References
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