Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

Published: October 18, 2013 doi: 10.3791/50630

Summary

Multi-elektrode patch-clamp vormen een complexe taak. Hier laten we zien hoe, door het automatiseren van veel van de experimentele stappen is het mogelijk om het proces dat tot kwalitatieve verbetering van de prestaties en het aantal opnamen versnellen.

Abstract

De patch-clamp techniek is vandaag de dag de meest bekende methode voor het opnemen van elektrische activiteit van individuele neuronen of de subcellulaire compartimenten. Toch een stabiele opnamen, zelfs individuele cellen, blijft een tijdrovende procedure bijzonder complex. Automatisering van de vele stappen in combinatie met een efficiënte informatiedisplay kan sterk experimentalisten bij het uitvoeren van een groter aantal opnames met grotere betrouwbaarheid en in minder tijd. Om grootschalige opnames realiseren concludeerde we de meest efficiënte aanpak is niet om volledig te automatiseren het proces, maar om de experimentele stappen te vereenvoudigen en verminderen de kans op menselijke fouten tijdens het efficiënt opnemen van de ervaring van de experimentator en visuele feedback. Met deze doelstellingen in het achterhoofd een computerondersteund systeem dat alle noodzakelijke controles centraliseert voor een multi-elektrode patch-clamp experiment in een enkele interface, een commerc ontwikkelden weially beschikbare draadloze gamepad, tijdens het weergeven van experiment gerelateerde informatie en begeleiding aanwijzingen op het computerscherm. Hier beschrijven we de verschillende onderdelen van het systeem die ons toeliet om de tijd die nodig is voor het bereiken van de opname configuratie verlagen en aanzienlijk verhogen de kans op grote aantallen neuronen tegelijk met succes opnemen.

Introduction

Het vermogen opnemen en stimuleren meerdere sites met micrometer precisie is uitermate geschikt voor experimenteel een beter begrip van neuronale systemen. Vele technieken zijn ontwikkeld om dit doel maar niemand kan de submillivolt resolutie bereikt door de patch-clamp techniek, essentieel voor het bestuderen subklinische activiteit en individuele postsynaptische potentialen. Hier bespreken we de ontwikkeling van een twaalf-elektrode computerondersteunde patch-clamp systeem gericht op het gelijktijdig opnemen en stimuleren een groot aantal individuele cellen met voldoende nauwkeurigheid voor de studie van neuronale connectiviteit. Terwijl vele andere toepassingen denkbaar voor een dergelijk systeem leent zich bijzonder goed voor de studie van synaptische connectiviteit aangezien het aantal mogelijke verbindingen binnen een groep van neuronen groeit evenredig met het kwadraat van het aantal neuronen betrokken. Daarom, terwijl een systeem met drie elektroden maakt het testenoptreden van maximaal zes verbindingen en meestal een enkele opname, opname twaalf neuronen kan het testen van de aanwezigheid van maximaal 132 verbindingen en vaak observeren dan een dozijn (figuur 1). De waarneming van tientallen verbindingen tegelijkertijd maakt het mogelijk om de inrichting van kleine netwerken te analyseren en afleiden statistische eigenschappen van de netwerkstructuur die anders 1 kan worden gesondeerd. Bovendien precieze stimulatie van talrijke cellen maakt het ook mogelijk de kwantificering van de aanwerving van postsynaptische cellen 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Uitrusting Voorbereiding

  1. Controle manipulatoren van een computer
    1. Sluit elke micromanipulator controller doos op een computer via de seriële poort (RS-232).
    2. Implementeren van de commando's voor het positioneren, bevragen en instellingen aanpassen via de seriële poort worden gestuurd. Bepaalde snelheid en hardware compatibiliteitsproblemen C / C + + wordt aanbevolen als de programmeertaal.
    3. Standaardisering van het referentiesysteem van de manipulatoren, zodat nul ligt het dichtst mogelijke positie ten opzichte van de motoren en positieve beweging wordt weggeleid van de motoren.
    4. Plaats de microscoop op zijn centrale positie 2 mm boven het monster focal plane (coördinaten [0, 0, 2000]).
    5. Store voor elke manipulator, de lokale coördinaten waarmee de punt van een pipet wordt waargenomen in het midden van het gezichtsveld van de microscoop. Dit is het eerste referentiepunt voor elke elektrode.
  2. Visualize elektrodepositie. Het is erg handig om de positie van elke elektrode volgen tijdens een experiment. Een grafische weergave is de meest intuïtieve manier om dit te verwezenlijken. Daartoe de referentiesystemen van elke elektrode en die van de microscoop moet worden afgestemd. Een eenvoudige manier om dit te bereiken is:
    1. Breng de punt van een elektrode naar het midden van het gezichtsveld.
    2. Sla de positie op elke as van de manipulator en elke as van de microscoop.
    3. Voer de x-as van de manipulator een relatief grote beweging (1 mm).
    4. Zoek de tip eens te meer het verplaatsen van alleen de microscoop.
    5. Bereken het verschil in de microscoop functie sinds het laatst gemeten. Dit zijn de projecties van de elektrode asbeweging op de microscoop assen.
    6. Herhaal stap 2,3-2,5 voor de Y-en Z-assen van de elektrode manipulator. Hierdoor kan een matrix van projecties op de microscoop assen te bepalen (<strong> Figuur 2) ook wel cosinus matrix:
      Vergelijking 1
    7. Inverteer de matrix mogelijk maken de bewegingen in drie dimensies, die door de elektrode manipulator naar een bepaalde positie in de microscoop coördinatensysteem bereikt berekenen:
      Vergelijking 2
    8. De eerste referentiepunt en de cosinus matrix bepaalt de positie van elke elektrode in microscoop coördinaten.
    9. Grafisch weergeven, gebaseerd op de microscoop, de plaats van elke elektrode regelmatig. We kozen voor een C / C + + tekening bibliotheken (GDI +) gebruiken om de elektrode posities elke 40 msec trekken.
    10. Herhaal stap 1.2.1 - 1.2.7 telkens manipulator hoeken wordt gewijzigd of positieveranderingen van enkele millimeters nodig, bijvoorbeeld wanneer het type elektrode wordt veranderd.
  3. Enable opslaan van de positions van relevante kenmerken in het weefsel, zoals cellen of anatomische referentiepunten, microscoop coördinaten.
  4. Verwerven video en overlay relevante informatie.
    1. Mechanisch lijn de x-as van beweging van de microscoop met de horizontale as van de microscoop camera.
    2. Installeren op de computer een framegrabber met live video en overlay mogelijkheden en een software development kit (SDK).
    3. Implementeer live video weergave in bedrijf met de SDK.
    4. Zetten de microscoop assenstelsel met de referentie camerasysteem door de juiste vertaling en scaling.
    5. Teken de relevante kenmerken in camera coördinaten en overlay op de live video het resulterende beeld met regelmatige tussenpozen van ongeveer 40 msec (figuur 3).
  5. Controle Versterkers.
    1. Gebruik de versterker software om de versterker instellingen van de interface.
  6. Control oscilloscopen.
    1. Sluit de oscilloscoop aan op de PC met behulp van seriële poorten.
    2. Bepaal de oscilloscoop schaal, koppeling en temporele resolutie voor de verschillende stappen van de patch-clamp procedure in voltage-clamp (bijv. elektrode in bad, seal vorming, whole-cell configuratie) en de huidige-klem.
    3. Stuur het juiste oscilloscoop instelling commando wanneer versterker opdrachten worden afgegeven vanaf de interface.
  7. Controle pipet druk.
    1. Monteer een drukregelinrichting volgens figuur 4.
      1. Gebruik een 12 V / 5 V voeding aan elke elektronische component op de juiste wijze te leveren.
      2. Verbind de uitgang van een membraan pomp naar de positieve druk buffer (een 100 ml verpakking).
      3. Sluit de ingang van een membraan pomp naar de negatieve druk buffer (een 100 ml verpakking).
      4. Sluit de pipet houder buis een druksensor in het drukniveaure controlesysteem en een pneumatische klep die aansluit op de belangrijkste druk compartiment.
      5. Sluit elk van de drukbuffers een klep aangesloten op het drukruimte.
      6. Sluit een klep tussen de belangrijkste druk compartiment en de sfeer.
      7. Sluit een druksensor naar de belangrijkste druk compartiment.
      8. Sluit een druksensor voor elke buffer.
      9. Sluit de druk controlesysteem om een ​​data-acquisitie board.
      10. Sluit elke druksensor aan een analoge ingang.
      11. Sluit elke klep op een digitale uitgang.
    2. Verwijder luchtdruk opzichte van alle sensoren door het openen alle afsluiters behalve die aansluiten op het membraan pompen en aftrekken van de gemeten druk.
    3. Implementeer drukregeling
      1. Definieer in de interface een controle met betrekking tot positieve drukregeling voor elke pipet activeren of de-activeren.
      2. Definieer een minimale positieve druk de pipets van ongeveer 70 mbar.
      3. Periodiek (om de 0,5 sec) op te sporen wanneer druk in pipetten onder actieve drukregeling onder de ingestelde drempel.
      4. Bij het overschrijden van de drempel open de positieve druk buffer naar de belangrijkste druk compartiment en dit compartiment naar het pipet in kwestie gedurende korte periodes (20 msec) totdat de druk in de pipetten is boven de drempel. Sluit alle andere kleppen.
      5. De-activeren verder drukregeling als de uiteindelijke aanpak van een cel van belang wordt geïnitieerd.
    4. Solliciteer negatieve druk voor afdichting vorming
      1. Sluit alle kleppen en open de negatieve druk bufferklep richting van de belangrijkste druk compartiment en dit compartiment naar het pipet in kwestie voor de duur van de onderzoeker vereist door het houden van een knop ingedrukt.
  8. Centraliseren commando's op een human interface device.
    1. Sluit een in de handel verkrijgbare wireless gamepad op de PC.
    2. Implementeer uitlezing van de joystick-status. Gebruik bijvoorbeeld de DirectX bibliotheken voor C / C + + te readouts elke 5 msec voeren.
    3. Vergelijk huidige status met vorige toestand om te detecteren welke toets wordt ingedrukt, vrijgelaten of ingedrukt gehouden sinds de laatste keer stap.
    4. Functies toewijzen aan elke knop op de gamepad. Een voorbeeld van deze afbeelding is getoond in figuur 5.

2. Patch-clamp Procedure

  1. Bereid de hersenen plakjes van de regio van belang.
  2. Leg een plakje hersenen van belang, met het gebied van belang in het centrum van verplaatsing bereik van de microscoop.
  3. Cell Selection
    1. Identificeer cellen van belang door te bladeren met de microscoop. Bewaar de positie van de cellen op basis van de microscoop assenstelsel met een rechter muisklik op de live video display bovenop de cel van belang. De grafische interface wordt het geselecteerde cellen alsmede de micropipetten voor een globaal overzicht en software weer een marker op de celpositie die worden gevuld op de beelden. Bovendien een beeld van de cel wordt vastgelegd voor toekomstig gebruik in het bestand 'Cell #. Jpg'.
  4. Toewijzing van cellen aan pipetten
    1. Na het selecteren van de cellen van belang, toe te wijzen die pipet elke cel zal opnemen. De grafische interface biedt opdracht controles die moeten worden ingesteld. Visualiseer een voorbeeld van het uiteindelijke configuratie door het selectievakje 'Show Final Positions'.
    2. Selecteer elke pipet, waarvan de definitieve positie voorvertoning gewenst of vink dan de 'Alles selecteren'. Schakel de huidige positie-display voor een betere visualisatie indien nodig.
  5. Bereid de pipetten
    1. Vul de pipetten (6-8 MQ zijn meestal het beste als vele pipetten worden gebruikt) with intracellulaire oplossing en uploaden deze in de houders. Plaats de headstages in hun fixaties, maar ze niet naar voren schuiven om te voorkomen dat het aanraken van het bad met de pipet tip.
    2. De overdruk in te schakelen en selecteren pipetten dat de uiteinden schoon blijft. Schuif elke headstage op zijn plaats.
  6. Het lokaliseren van de pipet tips
    1. Plaats de microscoop naar een centrale positie met focus 3 mm boven het schijfje met de toets R2 terwijl knop 'A'. Gebruik de overeenkomstige positie voor elke manipulator zoals opgeslagen van de vorige experiment door te drukken op de knop L2 terwijl knop A.
      NB: Op dit punt moet er ofwel een onderscheidend schaduw van een pipet in het oog of een kleine beweging langs de as van de pipet is genoeg om het te observeren in de meeste gevallen moeten zijn. Compensatie voor de kleine verschillen in pipet vorm moet handmatig worden uitgevoerd.
    2. Breng de pipet tip in beeld. Plaats de tip op de rode punt in het midden van het beeldscherm, zonder het verplaatsen van de microscoop (het moet nog steeds op positie [0, 0, 2000]).
    3. Informeer de software die de pipet is in het midden van het scherm door op de knop Z terwijl knop C. Na elke pipet tip is gevestigd, stuur die pipet naar achteren zodat de volgende kan worden gelokaliseerd door op L1-toets terwijl u de knop A.
  7. Het naderen van de cellen
    1. Zodra alle pipet tips zijn nauwkeurig gelokaliseerd en elke pipet wordt toegeschreven aan een cel, automatisch de positie van de pipetten dicht bij hun respectievelijke cellen. Klik met de rechtermuisknop in het centrum van de groep cellen en selecteer de optie 'Cluster' in het popup-menu. Op het cluster opties venster dat verschijnt, selecteert u alle pipetten die u wilt positioneren op dit moment en klik op 'Ga door met alle geselecteerde pipetten'. Herhaal deze handeling voor elke cluster van cellen van belang.
    2. Pehandmatig rform de eindnadering. De positie van de pipetten opzichte van de cellen anders gespecificeerd, maar meestal is gewoon 200 urn afstand van de cel in de as van de pipet en 200 micrometer boven het in de verticale richting, wat genoeg is om de punt van de pipet buiten het weefsel behouden . Wacht tot de positionering van de pipetten is afgewerkt en verplaats de microscoop naar een pipet door te drukken op de knop R1 terwijl knop C.
    3. Herijken elke pipet positie door te focussen de microscoop op de punt ergens in het beeldscherm en toets B, terwijl u de knop C. Een vierkant rooster moeten kort de melding dat de vastgestelde positie van de pipet. Als de positie niet juist is, de positie van de tip op het centrale punt van het beeldscherm en druk op de knop Z terwijl knop C.
  8. Bepaal de configuratie-cel bevestigd
    1. Bevestigen dat de cel van belang zijn voor de huidige pipet is correctgemarkeerd. Anders gaan de microscoop om de cel van belang met de centrale rode stip overeenkomen. Markeer de cel door op Y knop terwijl u de knop C. Druk op de knop L2 terwijl u knop C om de pipet 200 urn uit de buurt van haar toegewezen cel te positioneren, wordt de microscoop automatisch naar de corresponderende positie.
    2. Pas de pipet positie, zodat het overeenkomt met de rode stip. Pas de pipet gecompenseerd door op de knop R1 terwijl knop X.
    3. Activeer de test puls door op L1-toets, terwijl u de knop X. Langzaam naderen de pipet om haar toegeschreven cel.
    4. Bij het observeren van de vorming van een kuiltje op het oppervlak van de cel membraan passen een korte puls van negatieve druk door knop Y terwijl knop Z om de toegepaste druk op de cel te bereiken. Een bedrijf potentieel van ongeveer-65mV moet op dit punt vastgesteld door op de knop L2 terwijl knop X.
  9. Whole-cell configuratie
    1. Zodra een Giga-afdichting wordt gevormd voor elke cel, beginnen scheuren de membranen door het toepassen van negatieve druk.
  10. Voer opnames
    1. Gebruik de stimulatie / acquisitie systeem om uw opnamen te voeren. Breng pulsen of reeksen pulsen aan een individuele cel tegelijk en acht reacties van de resterende cellen connectiviteit kaart van de opgenomen cellen.
  11. Achteruitgaan pipetten
    1. Zodra opnames klaar zijn, wijken pipetten langzaam uit het weefsel door rechts te klikken op de Lijst radio-knop. Selecteer 'ebben-> pipetten 500 urn' om de pipetten wijken op korte afstand langs hun assen. Let op de drift in het potentieel van de cellen (het opruimen van de tips door het toepassen van een aantal positieve druk kan helpen).
    2. Om pipetten wijken helemaal terug, zet de positionering snelheid 'Fast' en herhaal dezelfde handeling, maar kiezen voor de 'All' optie. Verwijder de gebruiktepipetten door voorzichtig uitschuiven van het headstages en losschroeven van de pipetten van de houders. Het is nuttig om te voorkomen draaien de houders in hun voeten omdat dit sterk storende pipetpunt positie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na de hierboven beschreven werkwijzen het gelukt uitvoeren whole-cell opname van maximaal twaalf neuronen gelijktijdig bijna verdubbeling van het grootste aantal neuronen tegelijk-patch geklemd tot nu toe. Voorbeelden van netwerken van directe synaptische verbindingen tussen piramidale neuronen die in laag V van de somatosensorische cortex van ratten zijn weergegeven in figuur 6.

De bepaling van de verbinding waarschijnlijkheid profielen als functie van inter-somatische afstand voor een bepaald celtype is een typische meting plaats die efficiënt kan worden uitgevoerd met een multi-elektrode patch-clamp system 1. Onlangs begon foto-stimulatie te verschijnen als een nog meer efficiënte manier van het verkrijgen van deze gegevens 3,4. Belangrijker is echter de verworven met multi-elektrode patch-clamp-systemen gegevens maakt onderzoekers om een ​​vollediger in kaart brengen van het netwerk onder studie en hoge-resolutie kleuren met intra verkrijgencellulaire diffuus kleurstoffen. In multi-elektrode patch-clamp experimenten kan elke cel worden opgenomen en gestimuleerd, die vaak niet bij andere technieken zoals foto-stimulatie of calcium beeldvorming. Met deze functie kunt onderzoekers bij te houden van vooroordelen te houden in connectiviteit, zoals de hoge incidentie van wederkerige verbindingen, die niet anders kan worden gemeten. Door het stimuleren en opslaan van elk bestudeerd neuron we aangetoond dat neuronen niet alleen neigt in de richting die onderling verbonden, maar ook vormen clusters. De omvang van onze opnames stond ons ook toe om te zien dat een hogere verbinding kans bestond tussen paren van neuronen die gemeenschappelijke buurlanden, dwz werden beide tegelijk verbonden met andere individuele neuronen in de bemonsterde netwerk (figuur 7a) gedeeld. Deze waarneming was significant bij elke bin intersomatic afstand van 50 mm (50-250 mm). We hebben ook waargenomen paren neuronen delen vele gemeenschappelijke buren kwamen significant meertien dan verwacht door toeval (figuur 7b). Bovendien effect bij verbinding waarschijnlijkheid gedetecteerd we op basis van het aantal gemeenschappelijke buren gedeeld door een gegeven paar van neuronen. De meest voorkomende buren deelt het waarschijnlijker een paar neuronen wordt verbonden (Figuur 7c).

Deze tendens leidt tot de vorming van groepen neuronen die dichter zijn verbonden dan gemiddeld. Interessant, sterk gekoppelde groepen neuronen niet alleen tentoongesteld talrijker verbindingen, maar ook, in gemiddeld sterkere 1. Deze bevindingen leidden tot de conclusie dat neocorticale circuits in celsamenstellen niet alleen in lagen en kolommen wordt georganiseerd, maar ook, dat wil zeggen groepen neuronen delen dichte en sterke synaptische interconnectiviteit zoals gepostuleerd door Donald Hebb enkele decennia geleden.

Andere resultaten van de rente die kan worden bereikt met meerdere tegelijk patch-geklemd neurons omvatten de kwantificering van de werving van remming door waarneembare activiteit in verschillende aantallen prikkelende cellen 2. Een alomtegenwoordige vorm van remming in de neocortex 5 wordt gemedieerd door Martinotti cellen (figuren 8a en b, aangepast van Berger et al..) Die input van piramidale cellen en integreren beurt die, met enige vertraging, andere pyramidale cellen. We toonden aan dat, na een korte uitbarstingen van stekelige activiteit in slechts vier de piramidale cellen, elk Pyramidal Cell in een lokaal microschakeling ontvangt deze vorm van inhibitie (figuren 8c, c, en f). We toonden ook aan dat deze remmende postsynaptische potentialen hebben de neiging om te verzadigen bij acht of meer de piramidale cellen simultaan gestimuleerd (figuur 8E).

Een overzicht van de systeemcomponenten te zien in figuur 9. De software-interface en hardware are Figuur 9a en b en de controller interface in figuur 9c geleiden van de elektroden naar cellen opnemen onder microscoopobjectief (Figuur 9d).

Figuur 1
Figuur 1. Berekening van het aantal verbindingen waargenomen bij een experiment als functie van het aantal neuronen gelijktijdig opgenomen toont een kwadratische groei. Numerieke berekening (boven). Illustratieve diagram waar verdere neuronen van hetzelfde netwerk achtereenvolgens toegevoegd (onder).

Figuur 2
Figuur 2. Coördinatenstelsels van elke elektrode manipulator (geel) en microscoop (rood).


Figuur 3. Screen capture van een pipet in de aanpak van toegewezen cel met overlappende benadering vector, mobiele posities en schaal bar.

Figuur 4
Figuur 4. Diagram pneumatisch systeem pipet drukregeling.

Figuur 5
Figuur 5. Commando's op de human interface device dat de controles die tijdens patch-clamp experimenten centraliseert.

Figuur 6
Figuur 6. Voorbeeld drie netwerkendirecte synaptische verbindingen in kaart gebracht in individuele experimenten

Figuur 7
Figuur 7. Gemeenschappelijke buur effect. (A) paren van neuronen die tegelijkertijd verbinding met ten minste een ander neuron in de steekproef netwerk (blauw) vertonen een significant verhoogde kans zijn verbonden. (B) Paren van neuronen delen meerdere gemeenschappelijke buren vaker dan verwacht toevallig in de bemonsterde netwerken. (c) Verbinding kans op paren neuronen toeneemt als functie van het aantal gemeenschappelijke buren gedeeld door het paar.

Figuur 8
Figuur 8. Kwantificering van de werving van Martinotti Cells. (a) Grafische weergave van een piramidale Cell (rood) dat synapsen vormt op een Martinotti Cell (blauw) die op hun beurt vormen synapsen op een tweede Pyramidal Cell (zwart). (b) Supraliminair stimulatie van de Pyramidal cel ( rood) leidt tot de aanwerving van de Martinotti Cell (blauw) door de integratie van het faciliteren van prikkelende postsynaptische potentialen. De aangeworven Martinotti Cell remt vervolgens de tweede Pyramidal Cell (zwart). (C) Diagram die de stimulatie van een toenemend aantal-patch geklemd piramidecellen en de effecten op andere Pyramidal Cell. (D) Gemiddeld remmende postsynaptische potentialen opgenomen van een Piramidaal Cell als functie van het aantal andere nabijgelegen piramidecellen die geprikkeld. Aangepast van Berger et al.. 2 (e) De amplitude van disynaptic remming in een lokaal circuit heeft de neiging om te verzadigen bij 9 of meer piramidecellen zijn stimulated aangeeft maximale rekrutering van Martinotti Cellen in waarschijnlijk bereikt op dit punt. (f) De fractie van de cellen waar disynaptic remming snel stijgt tot 1 als steeds meer de piramidale cellen worden gestimuleerd.

Figuur 9
Figuur 9. Illustratie van ensemble van het systeem. (A) Grafische gebruikersinterface met hoofdvenster, live video weergave, log venster en grafische weergave. (B) Microscoop en manipulators. (C) Human Interface Device met controles voor experimentele procedure. (D) Glas micropipetten in de stand voor het opnemen van meerdere neuronen.

Figuur 10
Figuur 10. Binomiale probability verdelingsfuncties die de fractie experimenten die met succes een bepaald aantal cellen bepaald gebruik twaalf elektroden opnemen beschrijven. Vergelijking tussen de opbrengst experimenten uitgevoerd met visuele feedback door ervaren gebruikers worden getoond in blauw en minder ervaren gebruikers in niet-ideale omstandigheden in het rood.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een onmiddellijke vraag ontstaat meestal over de mate van succes van de procedure die wij beschreven. Voor hoge slagingspercentages voorbereiding is essentieel. Pipetten moeten hebben tip openingen die geschikt zijn voor de cellen wezens opgenomen zijn. Filtreren van de intracellulaire oplossing verstopte pipetten voorkomen is ook belangrijk. Zeer schoon, vers getapt pipetten zijn een andere eis. Een binomiale verdeling is het eenvoudigste model dat kan worden gebruikt om te begrijpen hoe deze problemen beïnvloeden de uiteindelijke opbrengst. Het is redelijk om een ​​experimentator met ervaring en de juiste apparatuur om een ​​slagingspercentage van 80% of meer in het opnemen van individuele neuronen met visuele feedback te bereiken verwachten. Beginners kunnen worden verwacht dat veel lagere slagingspercentages te bereiken, vooral als belangrijke voorbereiding stappen worden over het hoofd gezien. Hoe deze prijzen vertalen in aantallen cellen opgenomen per experiment is te zien in figuur 10. Een verdere toename van het aantal gelijktijdig patch-clamped neuronen waarschijnlijk miniaturisatie manipulatoren en verhoogde betrouwbaarheid van de procedure, waardoor aanzienlijke aandacht voor detail vereist vereist, maar perfect mogelijk.

De veelzijdigheid van de hier gepresenteerde systeem wordt nog steeds onderzocht en nieuwe toepassingen zijn vaak gevonden, in het bijzonder in de exploratie van de relatie tussen de extracellulaire signalen en individuele neuron activiteit 7. Anatomische overwegingen belangrijker worden naarmate de afstand tussen de opgenomen cellen toeneemt. Toch is dit systeem maakt het zeker onderzoeken van lange-afstands-en tussenlaag connectiviteit waar verbindingen blijven intact na het snijden procedure.

Micromanipulator controle

Inschakelen automatisch positioneren met micromanipulators sterk versnelt het proces van multi-elektrode patch-clamp en verhoogt de betrouwbaarheid verminderen het optreden vanmenselijke fouten. Verschillende fabrikanten bieden verschillende oplossingen om een ​​verbinding van de PC naar de manipulators vestigen. Een optie is een seriële of USB-poort. Om een ​​snelle communicatie te verzekeren gewijd we een seriële poort aan elke manipulator controller. De meest nuttige eigenschap van de automatische positionering is waarschijnlijk de afschaffing van de meest laterale als de verticale beweging van de elektroden in het weefsel en de beperking van de vervorming. Aangezien de beweging van de elektroden in het weefsel vindt bijna uitsluitend langs de axiale richting, wordt mechanische interferentie geminimaliseerd. Zijwaartse bewegingen alleen nodig om af bloedvaten en cellen voorkomen.

Visualiseer elektrodenposities

Het is erg handig om de positie van elke elektrode volgen tijdens een experiment. In een traditionele opstelling het oog te verliezen van een elektrode kan snel een probleem worden. Bij gebruik van een groot aantal elektroden is nietmogelijk alle elektroden binnen het gezichtsveld te allen tijde. Zich baserend op een grafische weergave is de meest intuïtieve alternatieve en ook helpt bij het bijhouden van de voortgang van het experiment, direct zien welke elektroden zijn reeds geplaatst in hun uiteindelijke configuratie en welke niet.

Video acquisitie en overlay

De mogelijkheid om live video weer te geven van de microscoop gezichtsveld op een programmavenster is zeer nuttig. De etalage was geprogrammeerd om te reageren op muisklikken waardoor opslag van posities van belang (cel somata) evenals snelle update van de relatieve posities tussen microscoop en elektroden verwijderen geaccumuleerde fouten wanneer ze verschijnen. We voeren ook de overlay van praktische informatie over live video, zoals de aanpak traject voor elke elektrode richting gekozen cellen of de markering van deze cellen (figuur 3). Registratie of functies en superpositie van ondersteunende beelden zoals cijfers van anatomische atlassen werd eveneens uitgevoerd om te helpen waar regio's van belang zijn niet meteen duidelijk.

Versterkers

Computergestuurde microscoop versterkers kunnen toestaan ​​controle plaatsvinden van andere toepassingen. Dit verhoogt drastisch de snelheid en betrouwbaarheid waarmee meerdere cellen tegelijk kan worden opgenomen en elimineert de belangrijkste bron van menselijke fouten. Na computerondersteunde positionering en pipet drukregeling dit is de stap die de meest opvallende winst in tijd produceert, maar de winst in betrouwbaarheid zijn nog belangrijker.

Oscilloscopen

Ervoor zorgen dat testsignalen kunnen worden gevisualiseerd in real time op de juiste schaal en temporele resolutie verbetert de efficiëntie waarmee een experimentator experimentele stappen kan uitvoeren. Door de koppeling van de oscilloscoop settings aan modes (zoals stroom of spanning klem) versterker we ervoor gezorgd dat tijdkritische stappen werden uitgevoerd en gevisualiseerd met weinig inspanning zoals het houden van cellen op de juiste membraanpotentialen direct na het behalen van de cel bevestigd configuratie. Juiste visualisatie werd verzekerd door het verzenden van de juiste schaal en de koppeling van commando's via de seriële poort in eigen protocol van de oscilloscoop om de amplitude te passen en te compenseren van de test signalen binnen de oscilloscoop scherm.

Pipetteer drukregeling

Als het aantal elektroden gebruikt in een experiment toeneemt, zodat overdruk permanent aangebracht op het uiteinde van de glazen elektroden schoon wordt veeleisender de bijzondere vormen een belangrijke belemmering. Voldoende positieve en negatieve druk (enkele honderden mbar) kunnen worden gegenereerd door eenvoudige membraanpompen. Om de druk te stabiliseren, zijn deze pompen gekoppeld opnieuwservoirs van ongeveer 100 ml waarvan de opening en sluiting werd bestuurd door pneumatische kleppen. De kleppen op hun beurt waren computergestuurde met een data-acquisitie kaart. Het diagram van het pneumatisch circuit is te zien in figuur 4. De drukregelaar vervult een belangrijke rol niet alleen zorgen pipetpunten schoon blijven maar die de vorming van Gigaohm verbindingen snel op de waarneming van indeukingen op het celmembraan als pipetten raken de cellen verder versnellen van de procedure.

De human interface device

Meest experimentele opstellingen hebben de controles van de experimentele apparatuur op grote schaal verspreid over een groot gebied. We concentreerden de meest gebruikte bedieningselementen op een enkele draadloze gamepad (figuur 5) de tijd en inspanning die nodig is om elke cel te nemen, maar belangrijker nog sterk verminderen, waardoor bronnen van menselijke fouten die vaak kan brengen grote experimenten tot een voortijdig end.

Programmeertaal

We hadden zeer weinig keuze in termen van de programmeertaal voor deze toepassing, omdat de enige taal die de integratie van alle benodigde apparatuur ondersteund was C / C + +. Een groot voordeel van C / C + + is de mogelijkheid om de uitvoering van meerdere verwerkingseenheden threads en volledig profiteren van de verbetering van de prestaties toegestaan ​​door multiple-core processoren.

Elektrofysiologische data-acquisitie

Het systeem beschreven we de keuze van de elektrofysiologische opname software en data-acquisitie systeem tot de experimentator. Uitwisseling van de communicatie tussen data-acquisitie software en onze applicatie kan plaatsvinden via seriële poorten of via socket communicatie via het netwerk.

Toekomstperspectieven

Meer dan 30 jaar geleden dat Sakmann en Neher rudimentaire experimenten, de patch-clamp techniek is stilalleen deze gegevens met een bepaalde combinatie van signaalresolutie en bemonsteringsfrequentie die nodig zijn voor een groot aantal experimenten, in het bijzonder l die waarbij de detectie van individuele postsynaptische stromen of potentialen. Door het ontwikkelen van een computerondersteund systeem dat de opname van vele neuronen mogelijk maakt simultaan we gericht op het uitbreiden van de experimentele mogelijkheden van de patch-clamp techniek. Combinatie van dergelijke nieuwe mogelijkheden met de recente ontwikkelingen in de experimentele neurowetenschappen 8-13 kan de weg naar een meer diepgaande kennis van neuronale circuits met ongekende snelheid en detail te openen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij willen Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi en Sonia Garcia bedanken voor waardevolle adviezen over verbeteringen voor de patch-clamp procedure automatisering. Wij danken Rajnish Ranjan voor waardevolle adviezen en assistentie software implementatie. Dit werk werd deels gefinancierd door de EU Synapse-project en deels door het Human Frontier Science Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX51WI 40X Immersion Objective
Manipulators Luigs Neumann SM-5 Serial protocol used
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B SDK used
Camera Till Photonics VS 55 BNC analog output
Framegrabber Data Translation DT3120 SDK used
Oscilloscopes Tektronix TDS 2014 Serial communication
Data acquisition InstruTECH ITC 1600
Data acquisition National Instruments PCI-6221 Library used (.dll)
Pressure valve SMC SMC070C-6BG-32
Pressure sensor Honeywell 24PCDFA6G
Membrane pump Schego Optimal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
  2. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
  3. Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
  4. Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
  5. Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
  6. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
  7. Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
  8. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
  9. Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
  10. Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
  11. Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  12. Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
  13. Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).

Tags

Neurowetenschappen Patch-clamp automatische positionering whole-cell neuronale opname, Multi-elektrode
Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perin, R., Markram, H. AMore

Perin, R., Markram, H. A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System. J. Vis. Exp. (80), e50630, doi:10.3791/50630 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter