Summary
बहु इलेक्ट्रोड पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक जटिल कार्य का गठन. यहाँ हम प्रायोगिक चरण में कई की स्वचालित रूप से, यह प्रदर्शन और रिकॉर्डिंग की संख्या में गुणात्मक सुधार के लिए अग्रणी प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए कैसे संभव है, दिखाते हैं.
Abstract
पैच दबाना तकनीक व्यक्तिगत न्यूरॉन्स या उनके subcellular डिब्बों से बिजली की गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए सबसे अच्छी तरह से स्थापित विधि आज है. फिर भी, स्थिर रिकॉर्डिंग प्राप्त करने, यहां तक कि व्यक्ति की कोशिकाओं से, काफी जटिलता का एक समय लेने वाली प्रक्रिया बनी हुई है. कुशल जानकारी के प्रदर्शन के साथ संयोजन के रूप में कई कदम के स्वचालन बहुत अधिक से अधिक विश्वसनीयता के साथ रिकॉर्डिंग की एक बड़ी संख्या के प्रदर्शन में और कम समय में experimentalists सहायता कर सकते हैं. बड़े पैमाने पर रिकॉर्डिंग हासिल करने के लिए हमें सबसे कुशल दृष्टिकोण पूरी तरह से प्रक्रिया automatize लिए लेकिन प्रायोगिक कदमों को आसान बनाने के लिए और कुशलता से प्रयोगकर्ता के अनुभव और दृश्य प्रतिक्रिया को शामिल करते हुए मानव त्रुटि की संभावना कम नहीं है निष्कर्ष निकाला है. मन में इन लक्ष्यों के साथ हम एक अंतरफलक में एक बहु इलेक्ट्रोड पैच दबाना प्रयोग, एक commerc के लिए आवश्यक सभी नियंत्रण केंद्रीकृत जो एक कंप्यूटर की सहायता प्रणाली विकसित कीially उपलब्ध वायरलेस gamepad, कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रयोग से संबंधित जानकारी और मार्गदर्शन संकेत प्रदर्शित करते हुए. यहाँ हम हमें रिकॉर्डिंग विन्यास को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय को कम करने और काफी हद तक सफलतापूर्वक एक साथ न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या रिकॉर्डिंग के अवसरों में वृद्धि करने की अनुमति दी है जो प्रणाली के विभिन्न घटकों का वर्णन.
Introduction
सुक्ष्ममापी परिशुद्धता के साथ कई साइटों को रिकार्ड करने और प्रोत्साहित करने के लिए क्षमता प्रयोगात्मक neuronal सिस्टम का एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए अत्यंत उपयोगी है. कई तकनीकों यह अंत करने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन कोई नहीं submillivolt संकल्प subthreshold गतिविधि और व्यक्तिगत postsynaptic क्षमता के अध्ययन के लिए आवश्यक पैच दबाना तकनीक, द्वारा हासिल की अनुमति देते हैं. यहाँ हम एक साथ रिकॉर्डिंग और neuronal कनेक्टिविटी के अध्ययन के लिए पर्याप्त परिशुद्धता के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या उत्तेजक के उद्देश्य से एक बारह इलेक्ट्रोड कंप्यूटर की मदद से पैच दबाना प्रणाली के विकास को कवर किया. कई अन्य अनुप्रयोगों एक ऐसी प्रणाली के लिए कल्पना की जा सकती है, यह न्यूरॉन्स के एक समूह के भीतर संभव कनेक्शनों की संख्या प्रश्न में न्यूरॉन्स की संख्या के वर्ग के आनुपातिक बढ़ता दिया है कि synaptic कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से उधार देता है. इसलिए, तीन इलेक्ट्रोड के साथ एक प्रणाली परीक्षण की अनुमति देता है, जबकिअप करने के लिए छह कनेक्शन की घटना और सबसे अधिक बार बारह न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग, एक भी एक रिकॉर्डिंग के लिए 132 कनेक्शन की घटना का परीक्षण और अक्सर चित्रा (1) एक दर्जन से अधिक देख सकते हैं. कनेक्शन के दर्जनों के अवलोकन के साथ ही साथ यह संभव छोटे नेटवर्क के संगठन का विश्लेषण और नहीं तो 1 की जांच नहीं की जा सकती कि नेटवर्क संरचना के सांख्यिकीय गुणों अनुमान करने में आता है. इसके अलावा, कई कोशिकाओं की सटीक उत्तेजना भी postsynaptic कोशिकाओं 2 की भर्ती की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है.
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Protocol
1. उपकरण तैयारी
- एक कंप्यूटर से नियंत्रण manipulators
- धारावाहिक बंदरगाहों (RS-232) के माध्यम से एक कंप्यूटर करने के लिए प्रत्येक micromanipulator नियंत्रक बॉक्स से कनेक्ट करें.
- क्वेरी और सीरियल पोर्ट के माध्यम से भेजा जाना सेटिंग्स का समायोजन, स्थिति के लिए आदेशों को लागू करें. देखते गति और हार्डवेयर संगतता मुद्दों सी / सी + + प्रोग्रामिंग भाषा के रूप में सिफारिश की है.
- शून्य मोटर्स और सकारात्मक आंदोलन मोटर्स से दूर निर्देशित है के संबंध में निकटतम संभव स्थिति है कि इतनी manipulators के संदर्भ प्रणाली का मानकीकरण.
- 2 मिमी नमूना फोकल प्लेन (निर्देशांक [0, 0, 2000]) ऊपर अपनी केंद्रीय स्थान पर खुर्दबीन स्थिति.
- स्टोर, प्रत्येक जोड़तोड़ के लिए, एक पिपेट की नोक माइक्रोस्कोप से देखने के क्षेत्र के केंद्र में मनाया जा करने की अनुमति है कि स्थानीय निर्देशांक. यह प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिए प्रारंभिक संदर्भ बिंदु है.
- VisuaLize इलेक्ट्रोड पदों. यह एक प्रयोग के दौरान एक इलेक्ट्रोड की स्थिति पर नज़र रखने के लिए सक्षम होने के लिए बहुत उपयोगी है. एक चित्रमय प्रतिनिधित्व को पूरा करने का सबसे सहज तरीका है. कि अंत करने के लिए संदर्भ प्रत्येक इलेक्ट्रोड की व्यवस्था और माइक्रोस्कोप की कि मिलान किया जाना चाहिए. यह पूरा करने के लिए एक सरल तरीका है:
- देखने के क्षेत्र के केंद्र के लिए एक इलेक्ट्रोड की नोक लाओ.
- जोड़तोड़ के प्रत्येक अक्ष पर स्थिति और माइक्रोस्कोप के प्रत्येक अक्ष स्टोर.
- जोड़तोड़ एक अपेक्षाकृत बड़े आंदोलन (1 मिमी) की एक्स अक्ष के साथ चलाएँ.
- एक बार और केवल माइक्रोस्कोप चलते टिप जानें.
- यह पिछले मापा गया था के बाद से माइक्रोस्कोप स्थिति में अंतर की गणना. ये माइक्रोस्कोप कुल्हाड़ियों पर इलेक्ट्रोड अक्ष आंदोलन के अनुमानों हैं.
- Y और इलेक्ट्रोड जोड़तोड़ के Z कुल्हाड़ियों के लिए 2.5 - दोहराएँ 2.3 दोहराएँ. इस माइक्रोस्कोप पर अनुमानों के एक मैट्रिक्स <(निर्धारित किया जाना कुल्हाड़ियों की अनुमति देता हैमजबूत> चित्रा 2) भी कोज्या मैट्रिक्स कहा जाता है:
- यह संभव समन्वय प्रणाली माइक्रोस्कोप में दी गई स्थिति तक पहुँचने के लिए इलेक्ट्रोड जोड़तोड़ द्वारा आवश्यक तीन आयामों में आंदोलनों, गणना करने के लिए बनाने के लिए इस मैट्रिक्स पलटना:
- प्रारंभिक संदर्भ बिंदु का उपयोग और कोज्या मैट्रिक्स माइक्रोस्कोप में प्रत्येक इलेक्ट्रोड की स्थिति को निर्धारित निर्देशांक.
- माइक्रोस्कोप, नियमित अंतराल पर प्रत्येक इलेक्ट्रोड की स्थिति निर्देशांक पर आधारित, रेखांकन प्रदर्शित करें. हम इलेक्ट्रोड पदों हर 40 मिसे आकर्षित करने के लिए सी / सी + + ड्राइंग पुस्तकालयों (GDI +) का उपयोग करने के लिए चुना है.
- 1.2.7 कई मिलीमीटर की स्थिति में परिवर्तन की जरूरत है अगर जोड़तोड़ कोण बदल रहे हैं या हर समय, उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोड का प्रकार बदल जाता है जब - दोहराएँ 1.2.1 दोहराएँ.
- पदों के भंडारण सक्रिय करेंऐसी कोशिकाओं या शारीरिक संदर्भ बिंदु के रूप में ऊतक में प्रासंगिक सुविधाओं के एनएस, माइक्रोस्कोप में निर्देशांक.
- वीडियो मोल और प्रासंगिक जानकारी उपरिशायी.
- यंत्रवत् खुर्दबीन कैमरे की क्षैतिज अक्ष के साथ माइक्रोस्कोप की गति की एक्स अक्ष संरेखित.
- कंप्यूटर पर रहते वीडियो और ओवरले की क्षमता है और एक सॉफ्टवेयर डेवलपमेंट किट (एसडीके) के साथ एक framegrabber स्थापित करें.
- एसडीके के साथ लाइव वीडियो प्रदर्शन के ऑपरेशन को लागू.
- माइक्रोस्कोप उचित अनुवाद और स्केलिंग द्वारा कैमरा संदर्भ प्रणाली के लिए समन्वय प्रणाली में कनवर्ट करें.
- लगभग 40 मिसे (चित्रा 3) के नियमित अंतराल पर लाइव वीडियो परिणामस्वरूप छवि पर कैमरा निर्देशांक और ओवरले में प्रासंगिक सुविधाओं ड्रा.
- नियंत्रण एम्पलीफायरों.
- इंटरफ़ेस से एम्पलीफायर सेटिंग्स को नियंत्रित करने के लिए एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
- सहoscilloscopes ntrol.
- धारावाहिक बंदरगाहों का उपयोग करने के लिए पीसी oscilloscopes कनेक्ट करें.
- वोल्टेज दबाना में पैच दबाना प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के लिए आस्टसीलस्कप पैमाने पर, युग्मन और अस्थायी समाधान निर्धारित (जैसे इलेक्ट्रोड स्नान, सील गठन, पूरे सेल विन्यास में) और वर्तमान दबाना.
- एम्पलीफायर आदेशों इंटरफ़ेस से जारी किए जाते हैं, जब भी उचित आस्टसीलस्कप सेटिंग आदेशों भेजें.
- नियंत्रण पिपेट दबाव.
- चित्रा 4 के अनुसार एक दबाव नियंत्रण प्रणाली को इकट्ठा.
- उचित रूप से प्रत्येक इलेक्ट्रॉनिक घटक आपूर्ति करने के लिए एक 12 वी / 5 वी बिजली की आपूर्ति का उपयोग करें.
- सकारात्मक दबाव बफर (एक 100 मिलीलीटर कंटेनर) के लिए एक झिल्ली पंप के उत्पादन में कनेक्ट.
- नकारात्मक दबाव बफर (एक 100 मिलीलीटर कंटेनर) के लिए एक झिल्ली पंप के इनपुट से कनेक्ट करें.
- Pressu में एक प्रेशर सेंसर करने विंदुक धारक ट्यूबिंग कनेक्टनियंत्रण प्रणाली और मुख्य दबाव डिब्बे को जोड़ता है कि एक साँस का वाल्व कर रहे हैं.
- मुख्य दबाव डिब्बे से जुड़ा एक वाल्व के लिए दबाव बफ़र्स की प्रत्येक जुड़ें.
- मुख्य दबाव कम्पार्टमेंट और वातावरण के बीच एक वाल्व से कनेक्ट करें.
- मुख्य दबाव डिब्बे में एक प्रेशर सेंसर कनेक्ट करें.
- प्रत्येक बफर करने के लिए एक प्रेशर सेंसर कनेक्ट करें.
- एक डाटा अधिग्रहण बोर्ड के लिए दबाव नियंत्रण प्रणाली से कनेक्ट करें.
- एक अनुरूप निवेश करने के लिए प्रत्येक प्रेशर सेंसर कनेक्ट करें.
- एक डिजिटल उत्पादन करने के लिए प्रत्येक वाल्व से कनेक्ट करें.
- झिल्ली पंप से कनेक्ट कर उन लोगों को छोड़कर सभी वाल्व खोलने और मापा दबाव को घटाकर की सभी सेंसरों से ऑफसेट वायुमंडलीय दबाव निकालें.
- दबाव नियंत्रण लागू
- अंतरफलक में हर पिपेट के लिए सकारात्मक दबाव नियंत्रण को सक्रिय या de-सक्रिय करने के लिए एक नियंत्रण परिभाषित करें.
- पिपेट के लिए एक न्यूनतम सकारात्मक दबाव को परिभाषित करेंलगभग 70 एम्बार की है.
- सक्रिय दबाव नियंत्रण में pipettes में दबाव निर्धारित सीमा से नीचे चला जाता है जब भी समय समय पर (हर 0.5 सेकंड) का पता लगा.
- सीमा पार करने पर pipettes में दबाव सीमा से ऊपर है जब तक संक्षिप्त अवधि (20 मिसे) के दौरान प्रश्न में पिपेट की ओर मुख्य दबाव कम्पार्टमेंट और इस डिब्बे को सकारात्मक दबाव बफर खुला. अन्य सभी वाल्व बंद करें.
- ब्याज की एक सेल की ओर अंतिम दृष्टिकोण शुरू की है के रूप में आगे दबाव नियंत्रण de-सक्रिय करें.
- सील गठन के लिए नकारात्मक दबाव लागू करें
- सभी वाल्व बंद करो और प्रयोगकर्ता दबाया बटन रखने के द्वारा की आवश्यकता अवधि के लिए प्रश्न में पिपेट की ओर मुख्य दबाव कम्पार्टमेंट और इस डिब्बे के प्रति नकारात्मक दबाव बफर वाल्व खुला.
- चित्रा 4 के अनुसार एक दबाव नियंत्रण प्रणाली को इकट्ठा.
- एक मानव इंटरफ़ेस डिवाइस पर आदेशों केंद्रस्थ.
- एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध wirele कनेक्टपीसी के लिए एस एस gamepad.
- जॉयस्टिक स्थिति के readout लागू करें. उदाहरण के लिए, readouts हर 5 मिसे प्रदर्शन करने के लिए सी / सी + + के लिए इंटरनेट पुस्तकालयों का उपयोग करें.
- बटन पिछली बार कदम के बाद, दबाया जारी या दबाया रखा गया है, जो पता लगाने के लिए पिछले स्थिति के साथ मौजूदा स्थिति की तुलना करें.
- Gamepad में प्रत्येक बटन को कार्य आवंटित. इस मानचित्रण का एक उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है.
2. पैच दबाना प्रक्रिया
- हित के क्षेत्र के मस्तिष्क स्लाइस तैयार करें.
- माइक्रोस्कोप के विस्थापन श्रेणी के मध्य में ब्याज के क्षेत्र के साथ ब्याज की एक मस्तिष्क टुकड़ा रखें.
- सेल चयन
- माइक्रोस्कोप से ब्राउज़ द्वारा ब्याज की कोशिकाओं की पहचान. साथ समन्वय प्रणाली माइक्रोस्कोप के आधार पर कोशिकाओं की स्थिति स्टोर एक सही ब्याज की सेल के शीर्ष पर रहते वीडियो प्रदर्शन पर माउस क्लिक करें. छवियों पर मढ़ा जाएगा कि सेल की स्थिति पर एक मार्कर जोड़ देगा चित्रमय इंटरफेस एक वैश्विक अवलोकन और सॉफ्टवेयर के लिए चयनित कोशिकाओं के साथ ही micropipettes प्रदर्शित करेगा. साथ ही सेल की एक छवि फ़ाइल 'सेल #. तस्वीरें' में भविष्य में संदर्भ के लिए कब्जा कर लिया है.
- Pipettes को कोशिकाओं के रोपण
- ब्याज की कोशिकाओं को चुनने के बाद, प्रत्येक कोशिका रिकॉर्ड होगा जो पिपेट आवंटित. ग्राफिकल इंटरफ़ेस निर्धारित किया जाना चाहिए कि काम के नियंत्रण प्रदान करता है. चेकबॉक्स 'शो अंतिम स्थिति' का चयन करके अंतिम विन्यास के एक पूर्वावलोकन कल्पना.
- अंतिम स्थिति पूर्वावलोकन वांछित या 'सभी का चयन करें' चेकबॉक्स है जिसके लिए प्रत्येक पिपेट का चयन करें. यदि आवश्यक हो तो बेहतर दृश्य के लिए वर्तमान स्थिति प्रदर्शन को निष्क्रिय.
- Pipettes तैयार करें
- (- कई pipettes उपयोग किया जाता है, तो 8 MΩ आमतौर पर अच्छा कर रहे हैं 6) वाई pipettes भरेंintracellular समाधान वें और उनके धारकों में उन्हें लोड. उनके fixations में headstages रखें लेकिन पिपेट टिप के साथ स्नान को छू से बचने के लिए उन्हें आगे स्लाइड नहीं है.
- सकारात्मक दबाव नियंत्रण सक्षम और सुझावों साफ रहेगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए सभी pipettes का चयन करें. धीरे जगह में प्रत्येक headstage स्लाइड.
- पिपेट सुझावों लगाने
- 3 मिमी 'ए' बटन दबाए हुए बटन R2 दबाकर टुकड़ा ऊपर ध्यान देने के साथ एक केंद्रीय स्थान के लिए माइक्रोस्कोप स्थिति. बटन L2 दबाकर पिछले प्रयोग से संग्रहीत के रूप में बटन ए दबाए हुए प्रत्येक जोड़तोड़ के लिए इसी स्थिति का उपयोग
नोट: ज्यादातर मामलों में यह निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए इस बिंदु पर ध्यान में रखते हुए एक विंदुक के एक विशिष्ट छाया या पिपेट की धुरी के साथ एक छोटे से आंदोलन या तो होना चाहिए. पिपेट आकार में मामूली अंतर के लिए क्षतिपूर्ति मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जाना है. - फोकस में पिपेट टिप लाओ. (यह अभी भी [, 0, 0 2000] की स्थिति में होना चाहिए) माइक्रोस्कोप चलते बिना वीडियो प्रदर्शन के लाल केंद्रीय डॉट पर टिप रखें.
- पिपेट प्रत्येक पिपेट टिप स्थित है, के बाद बटन सी. दबाए हुए बटन Z दबाकर प्रदर्शन के केंद्र में है कि सॉफ्टवेयर को सूचित करें, कि पीछे की ओर पिपेट भेज इतना है कि बटन ए दबाए हुए एक बटन एल 1 दबाकर स्थित किया जा सकता है निम्नलिखित
- 3 मिमी 'ए' बटन दबाए हुए बटन R2 दबाकर टुकड़ा ऊपर ध्यान देने के साथ एक केंद्रीय स्थान के लिए माइक्रोस्कोप स्थिति. बटन L2 दबाकर पिछले प्रयोग से संग्रहीत के रूप में बटन ए दबाए हुए प्रत्येक जोड़तोड़ के लिए इसी स्थिति का उपयोग
- कोशिकाओं के करीब पहुंच
- सभी विंदुक युक्तियाँ ठीक स्थित किया गया है और प्रत्येक पिपेट एक सेल को जिम्मेदार ठहराया है एक बार, स्वचालित रूप से अपने संबंधित कोशिकाओं के करीब pipettes स्थिति. बस कोशिकाओं के समूह के बीच में ठीक क्लिक करें और पॉपअप मेनू पर विकल्प 'क्लस्टर' का चयन करें. दिखाई देते हैं, आप इस समय स्थिति चाहते हैं कि सभी pipettes का चयन करें और 'सभी की जाँच pipettes साथ जाओ' पर क्लिक करेंगे कि क्लस्टर विकल्प विंडो पर. ब्याज की कोशिकाओं में से प्रत्येक क्लस्टर के लिए इस आपरेशन दोहराएँ.
- पेमैन्युअल रूप से अंतिम दृष्टिकोण rform. कोशिकाओं के सापेक्ष pipettes की स्थिति अलग ढंग से निर्दिष्ट लेकिन आम तौर पर 200 मीटर की दूरी पर ऊतक बाहर पिपेट की नोक रखने के लिए पर्याप्त है जो ऊर्ध्वाधर दिशा में पिपेट और यह ऊपर 200 मीटर की धुरी में सेल से बस जा सकता है . Pipettes की स्थिति समाप्त हो गया है जब तक प्रतीक्षा करें और बटन सी. दबाए हुए बटन R1 दबाकर पिपेट की ओर माइक्रोस्कोप स्थानांतरित
- वीडियो प्रदर्शन में कहीं भी इसकी टिप पर खुर्दबीन ध्यान केंद्रित है और बटन सी. एक वर्ग ग्रिड, जबकि पकड़े बटन B दबाकर प्रत्येक पिपेट स्थिति recalibrate संक्षेप पिपेट की पहचान की स्थिति का संकेत दिखाई देनी चाहिए. स्थिति सही नहीं है तो बटन सी. पकड़े, वीडियो प्रदर्शन और प्रेस बटन जेड के केंद्रीय डॉट पर टिप
- सेल संलग्न विन्यास की स्थापना
- वर्तमान पिपेट के लिए ब्याज की सेल सही ढंग से है की पुष्टिचिह्नित. अन्यथा केंद्रीय लाल डॉट के साथ ब्याज की सेल मैच के लिए माइक्रोस्कोप चाल है. मार्क पिपेट दूर अपनी सौंपा सेल से 200 माइक्रोन की स्थिति के लिए बटन सी दबाए हुए बटन सी. प्रेस बटन L2 दबाए हुए बटन वाई दबाकर सेल, माइक्रोस्कोप स्वचालित रूप से इसी स्थिति में चले जाएँगे.
- यह लाल डॉट से मेल खाता है तो पिपेट स्थिति को समायोजित करें. बटन एक्स दबाए हुए बटन R1 दबाकर ऑफसेट पिपेट समायोजित
- धीरे धीरे अपनी जिम्मेदार ठहराया सेल को पिपेट दृष्टिकोण बटन एक्स दबाए हुए बटन एल 1 दबाकर परीक्षण नाड़ी सक्रिय करें.
- कोशिका झिल्ली की सतह पर एक डिंपल के गठन का अवलोकन करने पर लागू दबाव सेल तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए बटन जेड दबाए हुए बटन वाई दबाकर नकारात्मक दबाव का एक संक्षिप्त पल्स लागू होते हैं. के बारे में-65mV की एक होल्डिंग क्षमता बटन एक्स दबाए हुए बटन L2 दबाकर इस बिंदु पर स्थापित करना चाहिए
- पूरे सेल विन्यास
- एक गीगा सील प्रत्येक कक्ष के लिए गठित होने के बाद, नकारात्मक दबाव लागू करने से झिल्ली rupturing शुरू करते हैं.
- रिकॉर्डिंग प्रदर्शन
- अपने रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए उत्तेजना / अधिग्रहण प्रणाली का प्रयोग करें. एक समय में दालों या एक व्यक्ति के सेल पर दालों की गाड़ियों को लागू करें और दर्ज की कोशिकाओं के बीच कनेक्टिविटी नक्शा करने के लिए शेष कोशिकाओं पर प्रतिक्रियाओं का पालन.
- Pipettes दूर जाना
- रिकॉर्डिंग समाप्त हो जाने के बाद, टेबल रेडियो बटन पर क्लिक करके ऊतक से धीरे धीरे pipettes दूर जाना. Pipettes उनके axes साथ एक छोटी दूरी दूर जाना है करने के लिए 'दूर जाना> Pipettes 500 माइक्रोन' चुनें. (कुछ सकारात्मक दबाव लागू करने से सुझावों समाशोधन मदद कर सकते हैं) कोशिकाओं की क्षमता में बहाव को ध्यान से देखें.
- सभी तरह से वापस pipettes दूर जाना, 'फास्ट' के लिए स्थिति गति सेट और एक ही ऑपरेशन दोहराने लेकिन 'सभी' विकल्प का चयन करें. इस्तेमाल किया निकालेंधीरे headstages बाहर फिसलने और धारकों से pipettes unscrewing द्वारा pipettes. यह यह बहुत पिपेट टिप स्थिति के साथ हस्तक्षेप कर सकता है के बाद से उनकी कुर्सियां में धारकों घुमा से बचने के लिए उपयोगी है.
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Representative Results
ऊपर वर्णित विधि के बाद हम लगभग एक साथ न्यूरॉन्स की संख्या सबसे अधिक पैच clamped इस प्रकार अब तक दोहरीकरण, एक साथ बारह न्यूरॉन्स के पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने में सफल रहा. चूहों के somatosensory प्रांतस्था की परत वी में दर्ज पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच प्रत्यक्ष synaptic कनेक्शन के नेटवर्क के उदाहरण चित्रा 6 में दिखाया गया.
एक दिया सेल प्रकार के लिए अंतर - दैहिक दूरी के एक समारोह के रूप में संबंध संभावना प्रोफाइल के दृढ़ संकल्प एक बहु इलेक्ट्रोड पैच दबाना प्रणाली 1 के साथ कुशलता से किया जा सकता है कि ब्याज की एक विशिष्ट माप है. हाल ही में फोटो उत्तेजना ऐसे डेटा 3,4 प्राप्त करने का एक और भी अधिक कारगर साधन के रूप में प्रदर्शित हुई. महत्वपूर्ण बात है, हालांकि, बहु इलेक्ट्रोड पैच दबाना सिस्टम के साथ प्राप्त डेटा प्रयोगकर्ताओं अधिक पूर्ण अध्ययन के तहत नेटवर्क की मैपिंग के साथ ही अंतर के साथ उच्च संकल्प धुंधला प्राप्त करने के लिए अनुमति देता हैसेलुलर रंगों दूर तक फैला हुआ. बहु इलेक्ट्रोड पैच दबाना प्रयोगों में हर कोशिका अक्सर ऐसे फोटो उत्तेजना या कैल्शियम इमेजिंग के रूप में अन्य तकनीकों के साथ ऐसा नहीं है, जो दर्ज की और प्रेरित किया जा सकता है. यह सुविधा प्रयोगकर्ताओं ऐसे अन्यथा नहीं मापा जा सकता है, जो पारस्परिक कनेक्शन के उच्च घटना के रूप में, कनेक्टिविटी में पूर्वाग्रहों का ट्रैक रखने के लिए अनुमति देता है. हर अध्ययन न्यूरॉन उत्तेजक और रिकॉर्डिंग करके हम न्यूरॉन्स रहे हैं न केवल आपस में जोड़ा जा रहा है के प्रति पक्षपाती लेकिन यह भी समूहों के रूप में दिखाया. हमारे रिकॉर्डिंग के पैमाने पर भी हमें एक उच्च संबंध संभावना आम पड़ोसियों, यानी दोनों एक साथ जांचा नेटवर्क (चित्रा 7A) में अन्य व्यक्तिगत न्यूरॉन्स से जुड़े थे कि साझा न्यूरॉन्स के जोड़े के बीच में है कि अस्तित्व का निरीक्षण करने की अनुमति दी. इस अवलोकन (50 से 250 मिमी) 50 मिमी के हर intersomatic दूरी बिन में महत्वपूर्ण था. हम भी कई आम पड़ोसियों बांटने न्यूरॉन्स के जोड़े की काफी अधिक हुई मनायादस मौका (चित्रा 7b) से अधिक की उम्मीद. इसके अलावा, हम न्यूरॉन्स की दी जोड़ी के द्वारा साझा आम पड़ोसियों की संख्या के हिसाब से कनेक्शन संभावना पर असर का पता चला. यह अधिक संभावना न्यूरॉन्स की एक जोड़ी के शेयरों अधिक आम पड़ोसियों (चित्रा 7C) जुड़े हो रहा है.
यह प्रवृत्ति अधिक घनी औसत से जुड़े रहते हैं कि न्यूरॉन्स के समूहों के गठन की ओर जाता है. दिलचस्प है, न्यूरॉन्स के अत्यधिक परस्पर समूहों औसत, मजबूत वाले 1 में, भी अधिक कई कनेक्शन का प्रदर्शन किया, लेकिन न केवल. इन निष्कर्षों neocortical circuitry परतों और स्तंभों में संगठित लेकिन यह भी सेल विधानसभाओं में है कि न केवल इस निष्कर्ष पर हमें का नेतृत्व किया, कई दशक पहले डोनाल्ड Hebb द्वारा माने के रूप में घने और मजबूत synaptic इंटरकनेक्टिविटी बांटने न्यूरॉन्स की यानी समूहों.
एक साथ कई पैच clamped एन के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि ब्याज की अन्य परिणामeurons उत्तेजक कोशिकाओं 2 की विभिन्न संख्या में पूर्व दहलीज गतिविधि से निषेध की भर्ती की मात्रा का ठहराव शामिल हैं. Neocortex 5 में अवरोध का एक सर्वव्यापी फार्म पिरामिड कोशिकाओं से निवेश प्राप्त और कुछ विलंबता, अन्य पिरामिड कोशिकाओं के साथ प्रभावित बारी में यह जो एकीकृत (बर्गर एट अल. से अनुकूलित आंकड़े 8A और बी,) Martinotti कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता है. हम चार पिरामिड कोशिकाओं के रूप में कुछ में spiking गतिविधि का संक्षिप्त फटने के बाद, एक स्थानीय Microcircuit में हर पिरामिड सेल इस अवरोध के रूप (आंकड़े 8c, सी, और एफ) प्राप्त करता है, पता चला है कि. हम भी इन निरोधात्मक postsynaptic क्षमता आठ या उससे अधिक पिरामिड कोशिकाओं (चित्रा 8E) एक साथ प्रेरित कर रहे हैं जब तर करते हैं कि पता चला है.
प्रणाली के घटकों का अवलोकन 9 चित्र में देखा जा सकता है. सॉफ्टवेयर इंटरफेस और हार्डवेयर की गिरफ्तारीई चित्रा 9A और बी के साथ ही खुर्दबीन उद्देश्य (चित्रा 9D) के तहत रिकॉर्डिंग के लिए कोशिकाओं की दिशा में इलेक्ट्रोड मार्गदर्शक 9c चित्रा में नियंत्रक इंटरफ़ेस में दिखाया गया है.
चित्रा 1. एक साथ दर्ज न्यूरॉन्स की संख्या के एक समारोह के रूप में एक प्रयोग में मनाया कनेक्शनों की संख्या की गणना एक द्विघात वृद्धि को दर्शाता है. संख्यात्मक गणना (ऊपर). एक ही नेटवर्क के आगे न्यूरॉन्स क्रमिक जुड़ जाते हैं जहां व्याख्यात्मक आरेख (नीचे).
चित्रा 2. प्रत्येक इलेक्ट्रोड जोड़तोड़ (पीला) और माइक्रोस्कोप (लाल) की प्रणालियों का समन्वय.
चित्रा 3. मढ़ा दृष्टिकोण वेक्टर, सेल स्थिति और पैमाने पर पट्टी के साथ सौंपा सेल के प्रति दृष्टिकोण में एक पिपेट की स्क्रीन पर कब्जा.
चित्रा 4. आरेख पिपेट दबाव नियंत्रण के लिए हवाई प्रणाली को दर्शाता हुआ.
चित्रा 5. पैच दबाना प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल किया नियंत्रण केंद्रीकृत कि मानव इंटरफ़ेस डिवाइस पर हासिल है.
चित्रा 6. की तीन नेटवर्क का उदाहरणव्यक्तिगत प्रयोगों में मैप प्रत्यक्ष synaptic कनेक्शन
चित्रा 7. एक साथ जुड़े होने का एक काफी वृद्धि की संभावना के प्रदर्शन जांचा नेटवर्क (नीला) में कम से कम एक अन्य न्यूरॉन से कनेक्ट है कि न्यूरॉन्स की आम पड़ोसी प्रभाव. (एक) जोड़े. (ख) एकाधिक आम पड़ोसियों बांटने न्यूरॉन्स के जोड़े से अधिक की उम्मीद अधिक बार होती नमूना नेटवर्क में संयोग से. (ग) कनेक्शन जोड़ी द्वारा साझा आम पड़ोसियों की संख्या के एक समारोह के रूप में न्यूरॉन्स बढ़ जाती है के जोड़े के भीतर संभावना.
चित्रा 8. Martinotti कोशिकाओं की भर्ती की मात्रा. (क) ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व. पिरामिड सेल (ख) ऊपर अर्थ का उपसर्ग दहलीज उत्तेजना ( लाल) उत्तेजक postsynaptic क्षमता को सुविधाजनक बनाने के एकीकरण के माध्यम से Martinotti सेल (नीला) की भर्ती के लिए जाता है. भर्ती Martinotti सेल तो दूसरा पिरामिड सेल (काला) को रोकता है. (ग) आरेख पैच clamped पिरामिड कोशिकाओं और एक और पिरामिड सेल पर प्रभाव की बढ़ती संख्या की उत्तेजना का प्रतिनिधित्व. एक पिरामिड सेल से दर्ज (डी) औसत निरोधात्मक postsynaptic क्षमता प्रेरित कर रहे हैं कि आस पास के अन्य पिरामिड कोशिकाओं की संख्या के एक समारोह के रूप में. बर्गर एट अल. 2 (ई) से अनुकूलित एक स्थानीय सर्किट में disynaptic निषेध के आयाम 9 या अधिक पिरामिड कोशिकाओं stim हैं जब तर करने के लिए जाताulated शायद इस बिंदु पर पहुंच गया में Martinotti प्रकोष्ठों के अधिक से अधिक भर्ती का संकेत है. (च) जल्दी disynaptic निषेध प्राप्त कोशिकाओं के अंश पिरामिड कोशिकाओं की संख्या प्रेरित कर रहे हैं वृद्धि के रूप में 1 से उगता है.
चित्रा 9. प्रणाली के कलाकारों की टुकड़ी का चित्रण. (क) मुख्य खिड़की, लाइव वीडियो प्रदर्शन के साथ ग्राफिकल यूजर इंटरफेस, खिड़की और चित्रमय प्रतिनिधित्व लॉग ऑन करें. प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए नियंत्रण के साथ (ख) माइक्रोस्कोप और manipulators. (ग) मानव इंटरफ़ेस डिवाइस. (डी) ग्लास कई न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग के लिए स्थिति में micropipettes.
चित्रा 10. द्विपद probabilitप्रयोगों अनुभवी उपयोगकर्ताओं द्वारा दृश्य प्रतिक्रिया का उपयोग कर प्रदर्शन की उपज के बीच सफलतापूर्वक उपयोग बारह इलेक्ट्रोड दिया कोशिकाओं का एक दिया संख्या रिकॉर्ड है कि प्रयोगों के अंश का वर्णन है कि y वितरण कार्य करता है. तुलना नीले रंग में और गैर आदर्श स्थिति में कम अनुभवी उपयोगकर्ताओं द्वारा दिखाए जाते हैं लाल रंग में.
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Discussion
एक तत्काल प्रश्न आमतौर पर हम वर्णित प्रक्रिया की सफलता की दर के विषय में उठता है. उच्च सफलता दर के लिए तैयार करने के लिए आवश्यक है. Pipettes दर्ज की कोशिकाओं प्राणियों के लिए पर्याप्त हैं कि टिप के उद्घाटन के लिए होना चाहिए. भरा pipettes से बचने के लिए intracellular समाधान फ़िल्टर करना भी महत्वपूर्ण है. बहुत साफ, हौसले से निकाला pipettes एक अन्य आवश्यकता हैं. एक द्विपद वितरण इन मुद्दों अंतिम उपज को प्रभावित समझने के लिए कैसे इस्तेमाल किया जा सकता है कि सरल मॉडल है. यह 80% या दृश्य प्रतिक्रिया के साथ व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग में अधिक की सफलता दर प्राप्त करने के लिए अनुभव और उचित उपकरण के साथ एक प्रयोगकर्ता उम्मीद करना उचित है. शुरुआती महत्वपूर्ण तैयारी चरणों अनदेखी कर रहे हैं, खासकर अगर बहुत कम सफलता दर हासिल करने की उम्मीद की जा सकती. इन दरों प्रयोग प्रति दर्ज की कोशिकाओं की संख्या में अनुवाद कैसे 10 चित्र में देखा जा सकता है. एक साथ पैच क्लैम की संख्या में आगे बढ़ जाती हैped न्यूरॉन्स की संभावना manipulators के miniaturization और बदले में विस्तार करने के लिए पर्याप्त ध्यान देने की आवश्यकता है, जो प्रक्रिया है, की वृद्धि की विश्वसनीयता की आवश्यकता होती है, लेकिन पूरी तरह से संभव है होगा.
यहाँ प्रस्तुत प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा अभी भी पता लगाया जा रहा है और उपन्यास अनुप्रयोगों अक्सर कोशिकी संकेतों और व्यक्तिगत न्यूरॉन गतिविधि 7 के बीच संबंध की खोज में विशेष रूप से, पाया गया है. शारीरिक कारणों से दर्ज की कोशिकाओं वृद्धि के बीच दूरी के रूप में और अधिक महत्वपूर्ण हो गया है. कनेक्शन टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के बाद बरकरार रहेगा जहाँ भी फिर भी, इस प्रणाली निश्चित रूप से लंबी दूरी की और अंतर - परत कनेक्टिविटी की जांच की अनुमति देता है.
Micromanipulator नियंत्रण
Micromanipulators के साथ स्वत: स्थिति को सक्षम करने से बहुत बहु इलेक्ट्रोड पैच दबाना की प्रक्रिया accelerates और घटना के कम करने में अपनी विश्वसनीयता बढ़ जाती हैमानवीय त्रुटियों. विभिन्न निर्माताओं manipulators पीसी से एक कनेक्शन स्थापित करने के क्रम में विभिन्न समाधान प्रदान करते हैं. एक आम विकल्प एक सीरियल या यूएसबी पोर्ट है. तेजी से संचार सुनिश्चित करने के लिए हम प्रत्येक जोड़तोड़ नियंत्रक करने के लिए एक सीरियल पोर्ट समर्पित किया. स्वत: स्थिति का सबसे उपयोगी सुविधा शायद ऊतक के अंदर और उसके विरूपण सीमित इलेक्ट्रोड के सबसे पार्श्व और ऊर्ध्वाधर आंदोलन का उन्मूलन है. ऊतक के अंदर इलेक्ट्रोड के आंदोलन अक्षीय दिशा साथ लगभग विशेष रूप से जगह लेता है, यांत्रिक हस्तक्षेप कम से कम है. पार्श्व आंदोलनों कभी कभी रक्त वाहिकाओं और कोशिकाओं से बचने के लिए ही जरूरी हैं.
इलेक्ट्रोड पदों कल्पना
यह एक प्रयोग के दौरान एक इलेक्ट्रोड की स्थिति पर नज़र रखने के लिए सक्षम होने के लिए बहुत उपयोगी है. एक इलेक्ट्रोड की एक पारंपरिक सेटअप हारी दृष्टि में तेजी से समस्याग्रस्त हो सकता है. इलेक्ट्रोड की एक बड़ी संख्या का उपयोग करते समय यह नहीं हैसंभव हर समय देखने के क्षेत्र के भीतर सभी इलेक्ट्रोड रखने के लिए. एक ग्राफिक प्रतिनिधित्व पर भरोसा सबसे सहज विकल्प है और भी तुरन्त इलेक्ट्रोड पहले से ही लोगों को नहीं है उनके अंतिम विन्यास में तैनात है और जो किया गया है, जो दिखा, प्रयोग की प्रगति का ट्रैक रखने में मदद करता है.
वीडियो अधिग्रहण और ओवरले
एक आवेदन खिड़की पर देखने की खुर्दबीन क्षेत्र से लाइव वीडियो प्रदर्शित करने की क्षमता बहुत उपयोगी है. प्रदर्शन खिड़की ब्याज (सेल somata) के पदों के भंडारण के साथ ही माइक्रोस्कोप और वे दिखाई देते हैं जब भी संचित त्रुटियों को दूर इलेक्ट्रोड के बीच सापेक्ष पदों के त्वरित अद्यतन को सक्षम करने के लिए माउस क्लिक करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए प्रोग्राम था. हम भी इस तरह के दृष्टिकोण को चुना कोशिकाओं की दिशा में प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिए प्रक्षेपवक्र या इन कोशिकाओं का अंकन (चित्रा 3) के रूप में जीना वीडियो पर व्यावहारिक जानकारी के ओवरले लागू किया है. पंजीकरण ओच सुविधाओं और इस तरह के संरचनात्मक atlases से आंकड़ों के रूप में सहायक छवियों के superposition भी हित के क्षेत्रों तुरंत स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, जहां की सहायता के लिए लागू किया गया था.
एम्पलीफायरों
कंप्यूटर नियंत्रित माइक्रोस्कोप एम्पलीफायरों नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से अन्य अनुप्रयोगों से जगह लेने के लिए अनुमति दे सकता है. यह काफी एकाधिक कोशिकाओं को एक साथ दर्ज की गई और मानवीय त्रुटियों के प्रमुख स्रोत समाप्त किया जा सकता है जो गति के साथ और विश्वसनीयता बढ़ जाती है. कंप्यूटर की मदद से स्थिति और विंदुक दबाव नियंत्रण के बाद इस समय में सबसे महत्त्वपूर्ण लाभ का उत्पादन लेकिन विश्वसनीयता में लाभ और भी अधिक महत्वपूर्ण हैं कि कदम है.
Oscilloscopes
कि परीक्षण संकेतों सुनिश्चित करना उचित पैमाने पर वास्तविक समय में कल्पना और अस्थायी समाधान बहुत एक प्रयोगकर्ता प्रायोगिक कदमों पर अमल कर सकते हैं जिसके साथ क्षमता को बढ़ाता जा सकता है. आस्टसीलस्कप सेट युग्मनहम उस समय महत्वपूर्ण कदम ऐसे तुरंत सेल संलग्न विन्यास को प्राप्त करने के बाद उचित झिल्ली क्षमता पर कोशिकाओं के रूप में धारण छोटे से प्रयास के साथ मार डाला और कल्पना थे सुनिश्चित किया है (जैसे कि वर्तमान या वोल्टेज क्लैंप के रूप में) मोड एम्पलीफायर को सी चीज़ें. उचित दृश्य आयाम फिट और आस्टसीलस्कप स्क्रीन के अंदर परीक्षण संकेतों की भरपाई करने के लिए आस्टसीलस्कप के स्वयं के प्रोटोकॉल में सीरियल पोर्ट के माध्यम से उपयुक्त स्केलिंग और युग्मन आदेश भेजने के द्वारा सुनिश्चित किया गया था.
पिपेट दबाव नियंत्रण
सकारात्मक दबाव स्थायी रूप से स्वच्छ कांच इलेक्ट्रोड की नोक रखने के लिए लागू किया जाता है यह सुनिश्चित करना कि एक प्रयोग बढ़ता में कार्यरत इलेक्ट्रोड की संख्या, एक महत्वपूर्ण बाधा के गठन के मुद्दे पर और अधिक की मांग हो जाता है. पर्याप्त सकारात्मक और नकारात्मक दबाव (एम्बार की कुछ सैकड़ों) सरल झिल्ली पंप द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है. दबाव को स्थिर करने के लिए, इन पंपों को फिर से करने के लिए मिलकर कर रहे थेजिसका उद्घाटन और समापन साँस का वाल्व द्वारा नियंत्रित किया गया था लगभग 100 मिलीलीटर की servoirs. बदले में वाल्व कंप्यूटर नियंत्रित एक डाटा अधिग्रहण कार्ड का उपयोग कर रहे थे. वायवीय सर्किट के आरेख चित्रा 4 में देखा जा सकता है. दबाव नियंत्रक pipettes कोशिकाओं को छूने के रूप में यह सुनिश्चित करने के विंदुक युक्तियाँ आगे की प्रक्रिया को तेज करने, कोशिका झिल्ली पर डिम्पल का अवलोकन करने पर, स्वच्छ रहना भी है लेकिन जल्दी Gigaohm जवानों के गठन की अनुमति न केवल एक महत्वपूर्ण भूमिका करता है.
मानव इंटरफ़ेस डिवाइस
अधिकांश प्रयोगात्मक setups व्यापक रूप से एक बड़े क्षेत्र में छितरी हुई प्रयोगात्मक उपकरणों का नियंत्रण है. हम बहुत अक्सर समय से पहले ई करने के लिए बड़े प्रयोगों ला सकता है जो मानव त्रुटि के स्रोतों को नष्ट करने, प्रत्येक कोशिका रिकॉर्ड लेकिन सबसे महत्वपूर्ण बात करने के लिए आवश्यक समय और प्रयास को कम करने के लिए एक एकल वायरलेस gamepad (चित्रा 5) पर सबसे अधिक इस्तेमाल किया नियंत्रण केंद्रितएन डी.
प्रोग्रामिंग भाषा
सभी आवश्यक उपकरणों के एकीकरण का समर्थन किया कि केवल भाषा सी / सी + + था के बाद से हम इस आवेदन के लिए प्रोग्रामिंग भाषा के मामले में बहुत कम विकल्प नहीं था. सी / सी + + के महान लाभ एकाधिक कोर प्रोसेसर द्वारा अनुमति दी प्रदर्शन में सुधार से कई प्रसंस्करण धागे को लागू करने और पूरी तरह से लाभ की संभावना है.
Electrophysiological डेटा अधिग्रहण
हम वर्णित व्यवस्था प्रयोगकर्ता के लिए ऊपर electrophysiological रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर और डाटा अधिग्रहण प्रणाली का विकल्प छोड़ देता है. डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और हमारे आवेदन के बीच संचार की विनिमय धारावाहिक बंदरगाहों पर या नेटवर्क पर सॉकेट संचार के माध्यम से जगह ले सकते हैं.
भविष्य के दृष्टिकोण
30 से अधिक वर्षों Sakmann और नेहर के मौलिक प्रयोगों के बाद से, पैच दबाना तकनीक stil हैअकेले विशेष रूप से, प्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए आवश्यक हैं जो संकेत संकल्प और नमूने आवृत्ति की एक विशेष संयोजन के साथ डाटा उपलब्ध कराने में एल व्यक्तिगत बाद synaptic धाराओं या क्षमता का पता लगाने के उन लोगों को शामिल. कई न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है कि एक कंप्यूटर की सहायता प्रणाली विकसित करके एक साथ हम पैच दबाना तकनीक की प्रयोगात्मक संभावनाओं के विस्तार के उद्देश्य से. प्रयोगात्मक न्यूरोसाइंस 8-13 में हाल के घटनाक्रम के साथ ऐसी नई संभावनाओं के संयोजन अभूतपूर्व गति और विस्तार के साथ neuronal सर्किट का एक और अधिक गहरा समझ की दिशा में रास्ता खोल सकते हैं.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
हम पैच दबाना प्रक्रिया स्वचालन के लिए सुधार पर मूल्यवान सलाह के लिए गिलाड Silberberg, मिशेल Pignatelli, थॉमस के.एच. बर्गर, लुका Gambazzi, और सोनिया गार्सिया को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम मूल्यवान सलाह और सॉफ्टवेयर कार्यान्वयन के साथ सहायता के लिए रजनीश रंजन धन्यवाद. इस काम के लिए यूरोपीय संघ Synapse परियोजना द्वारा और आंशिक रूप से मानव सीमाओं विज्ञान कार्यक्रम के हिस्से में वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
References
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
- Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
- Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
- Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
- Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
- Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
- Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).
