En datamaskin-assistert Multi-elektrode Patch-clamp System

Summary

Multi-elektrode patch-clamp opptak utgjør en kompleks oppgave. Her viser vi hvordan, ved automatisering av mange av de eksperimentelle skritt, er det mulig å akselerere prosessen fører til kvalitativ forbedring i ytelse og antall innspillinger.

Abstract

Den patch-clamp teknikken er i dag den mest veletablert metode for registrering av elektrisk aktivitet fra enkelte nerveceller eller deres subcellulære avdelinger. Ikke desto mindre å oppnå stabile opptak, og med fra de enkelte celler, er en tidkrevende prosess av betydelig kompleksitet. Automatisering av mange trinn i forbindelse med effektiv informasjonsdisplay kan i stor grad hjelpe experimentalists i å utføre et større antall innspillinger med større pålitelighet og på kortere tid. For å oppnå store innspillinger konkluderte vi den mest effektive tilnærmingen er ikke å fullautomatisere prosessen, men for å forenkle de eksperimentelle skritt og redusere mulighetene for menneskelige feil ved effektivt å innlemme eksperimentator erfaring og visuell tilbakemelding. Med disse målene i tankene vi utviklet et datastøttet system som sentraliserer alle de tiltak som er nødvendige for en multi-elektrode patch-clamp eksperiment i et enkelt grensesnitt, en commercially tilgjengelig trådløs gamepad, mens du viser eksperiment relatert informasjons-og veiledningspekepinner på dataskjermen. Her beskriver vi de forskjellige komponentene i systemet som mulig for oss å redusere den tid som kreves for å oppnå opptakskonfigurasjon og vesentlig øke sjansene for vellykket opptak av et stort antall neuroner samtidig.

Introduction

Kapasitet til å ta opp og stimulere flere nettsteder med mikrometer presisjon er svært nyttig for eksperimentelt å oppnå en bedre forståelse av nervesystemer. Mange teknikker er blitt utviklet for dette formål, men ingen gir den submillivolt oppløsning oppnådd ved patch-clamp teknikk, essensiell for å studere subthreshold aktivitet og enkelte postsynaptiske potensial. Her dekker vi utviklingen av en tolv-elektrode datamaskin-assistert patch-clamp system rettet mot samtidig opptak og stimulere et stort antall enkeltceller med tilstrekkelig presisjon for studiet av nevronale tilkobling. Selv om mange andre anvendelser kan tenkes for et slikt system, gir det seg spesielt godt til studiet av synaptiske tilkoblings gitt at antall mulige forbindelser innen en gruppe av nerveceller vokser proporsjonalt med kvadratet av antall neuroner det gjelder. Derfor, mens et system med tre elektroder gjør det mulig å testeForekomsten av opp til seks forbindelser og oftest innspilling av et eneste, opptak tolv nevroner kan teste forekomsten av opp til 132 forbindelser og ofte observere over ett dusin (figur 1). Observasjonen av en rekke forbindelser som gjør det mulig samtidig å analysere organiseringen av små nettverk og antyde statistiske egenskaper av nettstruktur som ikke kan bli analysert på annen måte ^en. Videre tillater presis stimulering av mange celler også kvantifisering av rekruttering av postsynaptiske celler ^to.

Protocol

En. Utstyr Forberedelse

1. Kontroll manipulatorer fra en datamaskin
   1. Koble hver micromanipulator kontrollboks til en datamaskin via serielle porter (RS-232).
   2. Implementere kommandoene for posisjonering, spørring og justere innstillinger som skal sendes via den serielle porten. Gitt hastighet og maskinvare kompatibilitetsproblemer C / C + + er anbefalt som programmeringsspråk.
   3. Standardreferansesystemet av manipulatorer, slik at null er tettest mulig posisjon i forhold til motorer og positiv bevegelse er rettet bort fra motorene.
   4. Plasser mikroskop på sin sentrale posisjon 2 mm over prøven fokusplanet (koordinater [0, 0, 2000]).
   5. Store, for hver manipulator, de lokale koordinater som tillater tuppen av en pipette som skal overholdes i sentrum av synsfeltet av mikroskopet. Dette er det innledende kontaktpunkt for hver elektrode.
2. VisuaLize elektrodestillinger. det er svært nyttig å være i stand til å spore posisjonen til hver elektrode i løpet av et eksperiment. En grafisk representasjon er den mest intuitive måte å utføre dette. For dette formål referansesystemer til hver elektrode og som av mikroskopet må bli matchet. En enkel måte å oppnå dette på er:
   1. Bringe spissen på en elektrode til sentrum av synsfeltet.
   2. Oppbevar posisjon på hver akse av manipulatoren, og hver akse av mikroskopet.
   3. Utfør med x-aksen til manipulatoren en relativt stor bevegelse (1 mm).
   4. Finn spissen igjen beveger seg kun i mikroskopet.
   5. Beregn forskjellen i mikroskopet posisjon siden det sist ble målt. Disse er projeksjonene av elektroden aksebevegelsen inn på mikroskop-aksene.
   6. Gjenta trinn 2.3 til 2.5 for Y-og Z-aksene i elektroden manipulator. Dette tillater en matrise av fremspring på mikroskop-aksene som skal bestemmes (<strong> Figur 2) også kalt cosinus matrise:
      
   7. Invert denne matrise for å gjøre det mulig å beregne de bevegelser, i tre dimensjoner, som kreves av elektroden manipulator for å nå en gitt posisjon i mikroskopet koordinatsystem:
      
   8. Ved hjelp av det første referansepunktet og cosinus matrisen bestemme posisjonen til hver elektrode i mikroskop koordinater.
   9. Viser grafisk, basert på mikroskopet koordinater, posisjonen av hver elektrode med jevne mellomrom. Vi valgte å bruke C / C + + tegning biblioteker (GDI +) å trekke elektrodeplasseringer hver 40 msek.
   10. Gjenta trinn 1.2.1 - 1.2.7 hver gang manipulator vinkler endres eller hvis stilling endres på flere millimeter er nødvendig, for eksempel når den elektrodetype endres.
3. Aktiver lagring av positions av relevante egenskaper i vevet, slik som celler eller anatomiske referansepunkter i objektkoordinater.
4. Innhente video-og overlay relevant informasjon.
   1. Mekanisk justere x-aksen for bevegelse av mikroskopet med den horisontale akse for mikroskop-kameraet.
   2. Installer på datamaskinen en framegrabber med live video og overlay evne og et Software Development Kit (SDK).
   3. Implementere live video skjerm drift med SDK.
   4. Konverter mikroskopet koordinatsystem til kameraet referansesystemet med den passende oversettelse og skalering.
   5. Tegn de relevante funksjoner i kamerakoordinater og overlegg på live video resultatbildet med jevne mellomrom på ca 40 msek (figur 3).
5. Kontroll forsterkere.
   1. Bruk av forsterkeren programvare for å styre forsterkerens innstillinger fra grenseflaten.
6. Control oscilloskop.
   1. Koble oscilloskop til PCen via serielle porter.
   2. Bestem oscilloskop skala, kopling og tidsmessig oppløsning for de ulike trinnene i patch-clamp prosedyre i spenning-klemme (f.eks elektrode på bad, segl formasjon, hel-celle konfigurasjon) og strøm-klemmen.
   3. Send de riktige oscilloskop innstillings kommandoer når forsterker kommandoer utstedes fra grensesnittet.
7. Kontroll pipette press.
   1. Sammen en trykkreguleringssystem i henhold til figur 4.
      1. Bruk en 12 V / 5 V strømforsyning for å levere hver elektronisk komponent hensiktsmessig.
      2. Koble utgangen av en membranpumpe med positiv trykkbuffer (en 100 ml beholder).
      3. Kople til input av en membranpumpe til den negative trykkbuffer (100 ml beholder).
      4. Koble pipetteholder slangen til en trykksensor i rykketre kontrollsystem og en pneumatisk ventil som er koblet til hovedtrykkrommet.
      5. Koble hver av trykkbuffere til en ventil er forbundet med hovedtrykkrommet.
      6. Koble en ventil mellom hovedtrykkrommet og atmosfæren.
      7. Koble en trykksensor til hovedtrykket rommet.
      8. Koble en trykksensor til hver buffer.
      9. Koble trykkreguleringssystemet til et datainnsamlings bord.
      10. Koble hver trykksensor til en analog inngang.
      11. Koble hver ventil til en digital utgang.
   2. Fjern atmosfærisk trykk forskjøvet fra alle sensorer ved å åpne alle ventiler unntatt de kobler til membranpumper og trekke den målte trykket.
   3. Implementere trykkontroll
      1. Definer i grensesnittet en kontroll for å aktivere eller deaktivere positivt trykk-kontroll for hver pipette.
      2. Definer en minimal positivt trykk for pipettens av ca 70 mbar.
      3. Med jevne mellomrom (hver 0,5 sek) oppdage når trykket i pipetter under aktiv trykkontroll faller under den innstilte grensen.
      4. Ved terskelovergangen åpne overtrykks buffer til hovedtrykkrommet, og dette kammeret mot pipette aktuelle under korte perioder (20 ms) inntil trykket i pipettene er over terskelen. Lukk alle andre ventiler.
      5. Deaktivere ytterligere press kontroll som det endelige tilnærming mot en celle av interesse er igangsatt.
   4. Påfør undertrykk for segl formasjon
      1. Lukk alle ventiler og åpne den negative trykk buffer ventil mot hovedtrykket rommet og dette rommet mot pipetten aktuelle for varigheten eksperimentator krever ved å holde en knapp trykkes.
8. Sentral kommandoer på en Human Interface Device.
   1. Koble en vanlig wireless gamepad til PCen.
   2. Implementere avlesning av joystick status. For eksempel, bruker DirectX bibliotekene for C / C + + for å utføre avlesning hver 5 msek.
   3. Sammenligne dagens status med tidligere status for å oppdage hvilke knapper er blitt trykket, utgitt eller holdt trykket siden sist trinnet.
   4. Tilordne funksjoner til hver knapp i gamepad. Et eksempel på denne tilordningen er vist i figur 5..

2. Patch-clamp prosedyre

1. Forbered hjernen skiver av regionen av interesse.
2. Plasser en hjerne skive av interesse, med regionen av interesse i sentrum av mikroskopet deplasement rekkevidde.
3. Cell Selection
   1. Identifisere celler av interesse ved å bla med mikroskopet. Oppbevar stilling av cellene basert på mikroskopet koordinatsystem med en høyre museklikk på levende video-skjerm på toppen av cellen er av interesse. Det grafiske grensesnittet vil vise de valgte cellene samt mikropipetter for en global oversikt og programvare vil legge en markør på cellen posisjon som vil bli lagt over bildene. I tillegg et bilde av cellen fanges for fremtidig referanse i filen 'Cell #. Jpg'.
4. Navngivelse av celler til pipetter
   1. Når du har valgt cellene av interesse, tildele som pipette vil ta opp hver celle. Det grafiske grensesnittet gir oppgavekontroller som bør stilles. Visualisere en forhåndsvisning av det endelige konfigurasjon ved å velge avkrysningsruten 'Vis Endelige Posisjoner'.
   2. Velg hver pipette som den endelige posisjon forhåndsvisning er ønsket eller sjekke "Select All" boksen. Deaktiver den aktuelle posisjonen skjerm for bedre visualisering hvis nødvendig.
5. Forbered Pipettes
   1. Fyll pipettene (6 - 8 MΩ er vanligvis best hvis mange pipetter brukes) with intracellulær løsning og laste dem inn i deres innehavere. Plasser headstages i deres fikseringer, men ikke skyve dem frem til å unngå å berøre bad med pipettespissen.
   2. Aktiver positiv trykkontroll og velge alle pipetter for å sikre at spissene vil forbli rent. Skyv hver heads forsiktig på plass.
6. Finne pipettespissene
   1. Plasser mikroskop til en sentral stilling med fokus 3 mm over skive ved å trykke på knappen R2 mens du holder knappen 'A'. Bruk tilsvarende posisjon for hver manipulator som er lagret fra forrige eksperiment ved å trykke på knappen L2 mens du holder knappen A.
      Note: På dette punktet bør det være enten en særegen skygge av en pipette i lys eller en liten bevegelse langs pipette akse bør være nok til å observere det i de fleste tilfeller. Kompensasjon for de små forskjeller i pipette form må gjøres manuelt.
   2. Ta pipettespissen i fokus. Plasser tuppen på den røde prikk i midten av videoen skjermen uten å flytte mikroskopet (det bør fortsatt være i posisjon [0, 0, 2000]).
   3. Informer programvaren som pipetten er på midten av skjermen ved å trykke på knappen Z mens du holder knappen C. Etter hvert Pipettespissen ligger, sende den pipette bakover slik at den neste kan være plassert ved å trykke på knappen L1 mens du holder knappen A.
7. Nærmer cellene
   1. Når alle pipettespissene ha blitt nøyaktig plassert og hver pipette er knyttet til en celle, automatisk posisjonere pipettene i nærheten av de respektive celler. Bare høyreklikk i sentrum av den gruppen av celler og velg alternativet "Cluster" på hurtigmenyen. På klase alternativer vinduet som vises, velger du alle pipetter som du ønsker å plassere på denne tiden, og klikk på 'Gå med alle sjekket pipetter'. Gjenta denne operasjon for hver klynge av celler av interesse.
   2. Perform finalen manuelt. Posisjonen til pipettene i forhold til cellene kan angis på en annen måte, men som regel er bare 200 um bort fra cellen i aksen av pipetten og 200 mikrometer over den i vertikal retning, noe som er nok til å holde pipetten sin spiss utenfor vevet . Vent til posisjonering av pipetter er ferdig og før mikroskop mot en pipette ved å trykke på knappen R1 ved å holde knappen C.
   3. Rekalibrere hver pipette posisjonen ved å fokusere mikroskopet på spissen sin hvor som helst i videovisningen og trykke på knappen B mens du holder knappen C. En firkantet rutenett skal vises kort indikerer identifisert posisjon av pipetten. Hvis posisjonen ikke er riktig, plassere tuppen på den sentrale prikk av videovisningen, og trykk på knappen Z mens du holder knappen C.
8. Etablere celle-festet konfigurasjon
   1. Se etter at cellen av interesse for den aktuelle pipette er fullstendigmerket. Ellers bevege mikroskop for å samsvare med celle av interesse med det sentrale rød prikk. Mark cellen ved å trykke på knappen Y mens du holder knappen C. Trykk knappen L2 mens du holder knappen C for å plassere pipetten 200 mikrometer vekk fra sin tildelte celle, vil mikroskopet automatisk flytte til tilsvarende posisjon.
   2. Juster pipette posisjon slik at det samsvarer med den røde prikken. Juster pipette motvirket ved å trykke på knappen R1 mens du holder knappen X.
   3. Aktiver test pulsen ved å trykke på knappen L1 mens du holder knappen X. Sakte nærmer pipetten til sin tilskrives celle.
   4. Ved å observere dannelsen av en fordypning på overflaten av cellens membran anvende en kort puls med negativt trykk ved å trykke på knappen Y ved å holde knappen Z slik at påført trykk for å nå cellen. Et holdingselskap potensial på ca-65mV bør etableres på dette punktet ved å trykke på knappen L2 mens du holder knappen X.
9. Whole-celle konfigurasjon
   1. Når en Giga-tetning er dannet for hver celle, begynner rupturing membraner ved å anvende undertrykk.
10. Utfør opptak
    1. Bruk stimulering / innsamlingssystem for å utføre dine opptak. Påfør pulser eller tog av pulser på en individuell celle om gangen og observere respons på de gjenværende celler for å kartlegge tilkobling mellom de registrerte celler.
11. Vike pipetter
    1. Når opptakene er ferdig, trekker seg tilbake pipetter langsomt fra vev ved å høyreklikke på bordet radio-knappen. Velg "falle-> Pipetter 500 mikrometer 'å ha pipettene falle kort avstand langs sine akser. Observer drift i potensialet i cellene (clearing tips ved å bruke noen overtrykk kan hjelpe).
    2. Å falle pipetter hele veien tilbake, sette posisjonering hastigheten til «Rask» og gjenta den samme operasjonen, men velger "All"-alternativet. Fjern den bruktepipetter ved å forsiktig skyve ut headstages og skru pipettene fra innehaverne. Det er nyttig å unngå vridning innehaverne i sine sokler siden dette kan i stor grad påvirke pipettespissen posisjon.

Representative Results

Etter de metodene som er beskrevet ovenfor vi lyktes i å utføre hel-celle opptak på opptil tolv nevroner samtidig, nesten en dobling av flest nerveceller samtidig patch-klemmes så langt. Eksempler på nettverk av direkte synaptisk forbindelse mellom Pyramideformet Neurons tatt opp i Layer V i somatosensory cortex hos rotter som er vist i figur 6..

Bestemmelsen av forbindelsen sannsynlighetsprofiler som funksjon av inter-somatisk avstand for en gitt celle-typen er en typisk måling av interesse som kan utføres effektivt med en multi-elektrode patch-clamp-systemet ^1.. Nylig foto-stimulering begynte å fremstå som en enda mer effektiv måte å skaffe slike data ^3,4. Viktigere er imidlertid dataene som er innhentet med multi-elektrode patch-clamp-systemer gjør det mulig for forskere å oppnå en mer fullstendig kartlegging av nettverk under undersøkelse, så vel som høy oppløsning farging med intracellular diffust fargestoffer. I multi-elektrode patch-clamp eksperimenter hver celle kan registreres og stimulert, noe som ofte ikke er tilfelle med andre teknikker som for eksempel foto-stimulering-eller kalsium-avbildning. Denne funksjonen gjør at forskere for å holde styr på skjevheter i tilkoblingsmuligheter, som for eksempel den høye forekomsten av gjensidige forbindelser, noe som ikke kan måles på annen måte. Ved å stimulere og opptak hver studert nevron viste vi at nerveceller er ikke bare forutinntatt mot å være gjensidig forbundet, men også danne klynger. Omfanget av våre innspillinger også tillatt oss å observere at en høyere forbindelse sannsynlighet eksisterte blant par av nevroner som delte felles naboer, dvs. ble begge samtidig koblet til andre individuelle nevroner i samplet nettverket (Figur 7a). Denne observasjonen var signifikant på hver intersomatic avstand bin av 50 mm (50-250 mm). Vi observerte også par av nevroner som deler mange felles naboer oppstod betydelig mer avti enn forventet ved en tilfeldighet (figur 7b). Videre har vi oppdaget at en effekt på forbindelse sannsynlighet i henhold til antall felles naboer som deles av et gitt par av nerveceller. Den mer vanlige naboer den deler jo mer sannsynlig et par av nevroner er å være sammen (Figur 7c).

Denne tendensen fører til dannelse av grupper av neuroner som er mer tett forbundet med hverandre enn gjennomsnittet. Interessant, svært sammenhengende grupper av nerveceller ikke bare utstilt mer tallrike forbindelser, men også, i gjennomsnitt, sterkere seg ^en. Disse funnene førte oss til den konklusjon at neokortikale kretsene er ikke bare organisert i lag og kolonner, men også inn i celle forsamlinger, dvs. grupper av nerveceller som deler tett og sterk synaptic tilkoblinger som postulert av Donald Hebb flere tiår siden.

Andre resultater av interesse som kan oppnås med flere samtidig patch-klemt neurons inkludere kvantifisering av rekruttering av hemming av supra-terskel aktivitet i forskjellige antall eksitatoriske celler ^to. En allestedsnærværende form av hemming i neocortex ⁵ er mediert av Martinotti celler (figur 8a og b, tilpasset fra Berger et al.) Som mottar innspill fra pyramidale celler og integrere det i sin tur påvirker, med litt ventetid, andre pyramidale celler. Vi viste at etter korte støt med spiking aktivitet i løpet av så lite som fire pyramidale celler, hver Pyramideformet celle i en lokal mikrokretsen mottar denne form for hemming (figurene 8c, c, og f). Vi viste også at disse inhibitoriske postsynaptiske potensial har en tendens til å mettes når åtte eller flere pyramidale celler stimuleres samtidig (fig. 8E).

En oversikt over systemkomponenter kan sees i figur 9. Programvaregrensesnittet og maskinvare are er vist på figur 9a og b samt styringen grensesnittet i figur 9c førings elektrodene mot celler for opptak av i henhold til mikroskopobjektiv (fig. 9d).

Figur 1. Beregning av antall forbindelser som ble observert i et eksperiment som en funksjon av antallet neuroner samtidig registrerte viser en kvadratisk vekst. Numeriske beregninger (top). Illustrasjons diagram hvor ytterligere nevroner av det samme nettverket settes suksessivt (nederst).

Figur 2. Koordinatsystemene av hver elektrode manipulator (gul) og mikroskopet (rød).

Figur 3. Skjermbilde av en pipette i tilnærming mot tildelt celle med kledde tilnærming vektor, celleposisjoner og skala bar.

Figur 4. Diagram som illustrerer pneumatisk system for pipette trykkontroll.

Figur 5. Kommandoer på human interface enhet som sentraliserer kontroller som brukes under patch-clamp eksperimenter.

Figur 6. Eksempel på tre nettverk avdirekte synaptiske forbindelser kartlagt i enkelte eksperimenter

Figur 7. Vanlige nabo effekt. (A) Par av nevroner som samtidig kobles til minst en annen neuron i det samplede nettverk (blå) utviser en signifikant økt sannsynlighet for å bli sammenkoplet. (B) Par av nerveceller som deler mange felles naboer oppstå oftere enn forventet ved en tilfeldighet i de samplede nettverk. (c) Kobling sannsynlighet innenfor par av nevroner øker som en funksjon av antall vanlige naboer som deles av de to.

Figur 8. Kvantifisering av rekruttering av Martinotti Cells. (a) Grafisk representasjon av en pyramideformet celle (rød) som danner synapser på et Martinotti Cell (blå) som i sin tur former synapser på et andre Pyramideformet Cell (svart). (b) Supra-terskel stimulering av pyramidal cellen ( red) fører til rekruttering av Martinotti Cell (blå) gjennom integrering av tilrettelegging eksitatoriske postsynaptiske potensialer. Den Rekruttert Martinotti Cell deretter hemmer andre Pyramideformet Cell (sort). (C) Diagram som representerer stimulering med økende antall av patch-klemmes pyramidale celler og effekter på en annen Pyramideformet Cell. (D) Gjennomsnittlig Hemmende postsynaptiske potensialer tatt opp fra en pyramide Cell som en funksjon av antallet av andre nærliggende pyramidale celler som stimuleres. Tilpasset fra Berger et al. ^2. (e) Amplituden av disynaptic inhibering i en lokal krets har en tendens til å mette ved 9 eller flere pyramidale celler er Stimmanøvreres indikerer maksimal rekruttering av Martinotti Cells in sannsynligvis nådd på dette tidspunkt. (f) Fraksjonen av celler som fikk disynaptic inhibering hurtig stiger til en så økende antall pyramide Celler blir stimulert.

Figur 9. Illustrasjon av ensemble av systemet. (A) Grafisk brukergrensesnitt med hovedvinduet, live video display, log vinduet og grafisk representasjon. (B) Mikroskop og manipulatorer. (C) Human Interface Device med kontroller for eksperimentell prosedyre. (D) Glass mikropipetter i posisjon for å ta opp flere nevroner.

Figur 10. Binomisk probability fordelingsfunksjoner som beskriver den del av eksperimenter som med hell ta opp en gitt antall celler gitt anvendelse tolv elektroder. Sammenligning mellom utbyttet av eksperimenter utført ved hjelp av et visuelt inntrykk av erfarne brukere er vist i blått og av mindre erfarne brukere i ikke-ideelle tilstander i rødt.

Discussion

En umiddelbar spørsmål vanligvis oppstår om frekvensen av suksessen av prosedyren vi beskrevet. For høy suksessrate forberedelser er viktig. Pipetter må ha tips åpninger som er tilstrekkelig for cellenes vesener registrert. Filtrering av den intracellulære løsning for å unngå å tette pipetter er også viktig. Ekstremt rene, nytappet pipetter er et annet krav. En binomial fordeling er den enkleste modell som kan brukes til å forstå hvordan disse forhold påvirker det endelige utbyttet. Det er rimelig å forvente en eksperimentator med erfaring og riktig utstyr for å oppnå en suksessrate på 80% eller mer i opptak enkelte nerveceller med visuell tilbakemelding. Nybegynnere kan forventes å oppnå mye lavere suksessrate, særlig hvis viktige forberedelse trinn blir oversett. Hvordan disse prisene oversette i antall celler som er tatt opp for hvert forsøk kan sees i figur 10. Ytterligere økning i antall samtidig patch-muslingPED nevroner vil trolig kreve miniatyrisering av manipulatorer og økt pålitelighet av prosedyren, som i sin tur krever betydelig oppmerksomhet på detaljer, men er fullt mulig.

Allsidigheten til systemet presenteres her er fortsatt utforskes og nye applikasjoner har ofte blitt funnet, særlig i utforskningen av forholdet mellom ekstracellulære signaler og individuell neuron aktivitet ^7. Anatomiske betraktninger blitt viktigere etter hvert som avstanden mellom innspilte cellene øker. Likevel gir dette systemet definitivt etterforskning av langtrekkende og inter-lags-tilkobling uansett hvor tilkoblinger forblir intakt etter slicing prosedyre.

Micromanipulator kontroll

Aktivering automatisk posisjonering med micromanipulators sterkt akselererer prosessen med multi-elektrode patch-clamp og øker påliteligheten redusere forekomsten avmenneskelige feil. Forskjellige produsenter tilbyr ulike løsninger for å etablere en forbindelse fra PC til manipulatorer. En vanlig alternativ er en seriell eller USB-port. For å sikre rask kommunikasjon viet vi en seriell port til hver manipulator kontrolleren. Den mest nyttige trekk ved automatisk posisjonering er sannsynligvis eliminering av de sideveis og vertikal bevegelse av elektrodene inne i vevet og som begrenser dens forvrengning. Etter hvert som bevegelsen av elektrodene inne i vevet foregår nesten utelukkende langs den aksiale retning, er mekanisk interferens reduseres til et minimum. Sidebevegelser er bare nødvendig å tidvis unngå blodårer og celler.

Visualelektrodeplasseringer

Det er meget hensiktsmessig å være i stand til å spore posisjonen til hver elektrode i løpet av et eksperiment. I et tradisjonelt oppsett miste synet av en elektrode kan fort bli problematisk. Ved bruk av et stort antall elektroder er det ikkemulig å holde alle elektrodene innenfor synsfeltet til enhver tid. Stole på en grafisk representasjon er den mest intuitive alternativ og bistår i å holde oversikt over fremdriften av eksperimentet, kjapt viser hvilke elektroder har allerede blitt plassert i sin endelige form og hvilke som ikke har også.

Video oppkjøp og overlay

Muligheten til å vise levende bilder fra mikroskop synsfelt på et programvindu er veldig nyttig. Denne displayvinduet var programmert til å reagere på museklikk muliggjør lagring av posisjonene av interesse (celle somata) samt rask oppdatering av de relative posisjoner mellom mikroskop og elektrodene fjerne akkumulerte feil når de vises. Vi har også implementert overlapping av praktisk informasjon om levende bilder som tilnærmingen bane for hver elektrode mot utvalgte celler eller merking av disse cellene (figur 3). Registrering of funksjoner og superposisjon av hjelpe bilder, for eksempel tall fra anatomiske atlas ble også gjennomført for å hjelpe der regioner av interesse er ikke umiddelbart klart.

Forsterkere

Datastyrte mikroskop forsterkere kan tillate kontrollen skal skje fra andre programmer også. Dette øker drastisk hastigheten og påliteligheten med flere celler, som kan tas opp samtidig og eliminerer den største kilden til menneskelige feil. Følgende datamaskinassistert posisjonering og pipette trykkontroll dette er det trinnet som produserer de mest merkbare gevinster i tid, men gevinsten i pålitelighet er enda viktigere.

Oscilloskop

Sikre at testsignaler kan visualiseres i sanntid på riktig skala og tidsmessig oppløsning forbedrer effektiviteten som en eksperimentator kan utføre eksperimentelle skritt. Ved kopling av oscilloskop setTings til forsterker moduser (for eksempel strøm eller spenning klemme) vi sørget for at tidskritiske tiltak ble henrettet og visualisert med liten innsats som holder cellene på passende membran potensialer umiddelbart etter å oppnå cellen vedlagte konfigurasjon. Riktig visualisering ble sikret ved å sende de riktige skalerings og koblingskommandoer via serieport i oscilloskop egen protokoll for å passe på amplitude og offset av testsignaler innenfor oscilloskop skjermen.

Pipette trykkontroll

Ettersom antallet av elektroder anvendt i et eksperiment øker, slik at positivt trykk er permanent anvendt for å holde spissen av glasselektroder ren blir mer krevende til punkt som utgjør en viktig hindring. Tilstrekkelig positivt og negativt trykk (noen få hundre mbar) kan genereres ved enkle membranpumper. For å stabilisere trykket, ble disse pumper er koblet til rereservoarer av ca 100 ml som åpning og lukking ble kontrollert av pneumatiske ventiler. Ventilene i sin tur ble datamaskin-styrt ved hjelp av et datainnsamlingskort. Diagrammet i den pneumatiske krets kan sees i figur 4. Trykket kontrolleren utfører en viktig rolle, ikke bare sikrer pipettespisser forblir rene, men også slik at dannelsen av Gigaohm tetninger raskt, ved observasjon av gropene på cellemembranen som pipetter berører cellene, noe som ytterligere akselererer prosedyren.

Den Human Interface Device

De fleste forsøksoppsett har kontrollene av eksperimentelt utstyr viden spredt over et stort område. Vi konsentrerte de mest brukte kontrollene på en enkelt trådløs gamepad (figur 5) sterkt redusere tiden og innsatsen som kreves for å spille inn hver celle, men viktigst av alt, eliminere kilder til menneskelige feil som ofte kan gi store eksperimenter til en for tidlig end.

Programmeringsspråk

Vi hadde svært lite annet valg i form av programmeringsspråket for dette programmet siden det eneste språket som støttes integrering av alt nødvendig utstyr var C / C + +. En stor fordel med C / C + + er muligheten for å implementere flere prosessortråder og fullt overskudd fra ytelsesforbedring tillates av flerkjerneprosessorer.

Elektro datainnsamling

Systemet vi beskrev later valget av elektrofysiologisk registrering programvare og datainnsamling system opp til eksperimentator. Utveksling av kommunikasjon mellom data-oppkjøpet programvare og vår søknad kan skje over serielle porter eller via socket kommunikasjon over nettverket.

Fremtidige perspektiver

Mer enn 30 år siden Sakmann og Neher sin nyskapende eksperimenter, er patch-clamp teknikken still alene leverer data med en bestemt kombinasjon av signal oppløsning og samplingsfrekvens som er nødvendig for en lang rekke eksperimenter, spesielt de som involverer påvisning av de enkelte post-synaptiske strømmer eller potensialer. Ved å utvikle et datastøttet system som muliggjør opptak av mange nerveceller samtidig vi sikte på å utvide de eksperimentelle mulighetene for patch-clamp teknikken. Kombinasjon av slike nye muligheter med den siste utviklingen i eksperimentell nevrovitenskap ^8-13 kan åpne veien mot en mer dyptgående forståelse av nevrale kretser med enestående hastighet og detaljer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	40X Immersion Objective
Manipulators	Luigs Neumann	SM-5	Serial protocol used
Amplifiers	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK used
Camera	Till Photonics	VS 55	BNC analog output
Framegrabber	Data Translation	DT3120	SDK used
Oscilloscopes	Tektronix	TDS 2014	Serial communication
Data acquisition	InstruTECH	ITC 1600
Data acquisition	National Instruments	PCI-6221	Library used (.dll)
Pressure valve	SMC	SMC070C-6BG-32
Pressure sensor	Honeywell	24PCDFA6G
Membrane pump	Schego	Optimal