Summary
Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações.
Abstract
A técnica de patch-clamp é hoje o método mais bem estabelecido para gravar a atividade elétrica dos neurônios individuais ou seus compartimentos subcelulares. No entanto, a realização gravações estáveis, mesmo a partir de células individuais, continua a ser um processo demorado de considerável complexidade. Automação de muitos passos em conjunto com display de informação eficiente pode ajudar muito experimentalistas na realização de um maior número de gravações com maior confiabilidade e em menos tempo. A fim de alcançar as gravações em grande escala que concluiu a abordagem mais eficaz não é de automatizar totalmente o processo, mas para simplificar os passos experimentais e reduzir as possibilidades de erro humano, enquanto que incorpora de forma eficiente a experiência do experimentador e o feedback visual. Com esses objetivos em mente, desenvolvemos um sistema assistido por computador que centraliza todos os controles necessários para uma experiência multi-eletrodo patch-clamp em uma única interface, um commercgamepad sem fio ei ra me nt disponível, durante a exibição de experimento relacionado informação e orientação pistas na tela do computador. Descrevemos aqui os diferentes componentes do sistema que permitiu reduzir o tempo necessário para atingir a configuração de gravação e substancialmente aumentar as chances de gravação com sucesso um grande número de neurónios em simultâneo.
Introduction
A capacidade de gravar e estimular vários sites com precisão micrômetro é extremamente útil para experimentalmente alcançar uma melhor compreensão dos sistemas neuronais. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para este fim, mas nenhuma permite a resolução submillivolt conseguida pela técnica de patch-clamp, essencial para o estudo da actividade de sublimiar e potenciais pós-sinápticos individuais. Aqui vamos cobrir o desenvolvimento de um sistema de patch-clamp assistida por computador doze eletrodo destinado a registar simultaneamente e estimular um grande número de células individuais com uma precisão suficiente para o estudo da conectividade neuronal. Embora muitas outras aplicações pode ser concebida para um tal sistema, que se presta especialmente bem para o estudo da conectividade sináptica dado que o número de ligações possíveis dentro de um grupo de neurónios aumenta proporcionalmente ao quadrado do número de neurónios em causa. Por conseguinte, enquanto um sistema com três eléctrodos permite testar oocorrência de até seis ligações e na maioria das vezes a gravação de um único, a gravação doze neurónios permite testar a ocorrência de até 132 ligações e frequentemente mais de uma dúzia de observação (Figura 1). A observação de dezenas de ligações simultaneamente torna possível analisar a organização de redes pequenas e inferir propriedades estatísticas da estrutura de rede que não pode ser de outra forma sondado 1. Além disso, a estimulação precisa de numerosas células também permite a quantificação do recrutamento de células pós-sinápticas 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação Equipamento
- Manipuladores de controle de um computador
- Conecte cada caixa controlador micromanipulador para um computador através de portas seriais (RS-232).
- Implementar os comandos para posicionamento, consulta e ajustar as configurações para ser enviado através da porta serial. Problemas de velocidade e compatibilidade de hardware Dado C / C + + é recomendada como a linguagem de programação.
- Padronizar o sistema de referência de modo a que os manipuladores de zero é a posição mais próxima possível no que diz respeito aos motores e movimento positivo é dirigido para fora a partir dos motores.
- Posicione o microscópio em sua posição central de 2 mm acima da amostra de plano focal (coordenadas [0, 0, 2000]).
- Loja, para cada manipulador, as coordenadas do local que permita que a ponta de uma pipeta a ser observada no centro do campo de visão do microscópio. Este é o ponto de referência inicial para cada eletrodo.
- Visuaposições dos eletrodos Lize. Ele é muito útil para ser capaz de controlar a posição de cada eletrodo durante um experimento. A representação gráfica é a forma mais intuitiva de realizar isto. Para o efeito os sistemas de referência de cada eletrodo e que do microscópio deve ser correspondido. Uma maneira simples de fazer isso é:
- Traga a ponta de um eléctrodo para o centro do campo de visão.
- Guardar a posição de cada eixo do manipulador e cada eixo do microscópio.
- Executar com o eixo x do manipulador de um movimento relativamente grande (1 mm).
- Localize a ponta mais uma vez movendo-se apenas ao microscópio.
- Calcula-se a diferença na posição do microscópio, uma vez que foi passado medido. Estas são as projeções do movimento do eixo do eletrodo sobre o eixo do microscópio.
- Repita os passos de 2,3-2,5 para o Y e Z do manipulador eletrodo. Isto permite que uma matriz de projecções com o microscópio eixos a ser determinado (<strong> Figura 2) também chamada matriz de co-seno:
- Inverter esta matriz para torná-lo possível calcular os movimentos, em três dimensões, necessários pelo manipulador eléctrodo para atingir uma dada posição no microscópio sistema de coordenadas:
- Usando o ponto inicial de referência e a matriz de co-seno determinar a posição de cada eléctrodo no microscópio coordenadas.
- Apresentar graficamente, com base no microscópio coordenadas, a posição de cada um dos eléctrodos em intervalos regulares. Optamos por usar C / C + + bibliotecas desenho (GDI +) para desenhar posições dos eletrodos a cada 40 milissegundos.
- Repita os passos 1.2.1 - 1.2.7 cada vez ângulos do manipulador são alteradas ou se são necessárias mudanças de posição de vários milímetros, por exemplo, quando o tipo de eletrodo é alterado.
- Ativar o armazenamento do positions de características relevantes no tecido, como as células ou pontos de referência anatômicos, em microscópio coordena.
- Adquirir vídeo e sobrepor informações relevantes.
- Mecanicamente alinhar o eixo-x de movimento do microscópio, com o eixo horizontal da câmara do microscópio.
- Instale no computador um framegrabber com vídeo ao vivo e capacidade de sobreposição e um kit de desenvolvimento de software (SDK).
- Implementar a operação de exibição de vídeo ao vivo com o SDK.
- Converter o sistema de coordenadas do microscópio para o sistema de referência da câmara pela tradução adequada e escamação.
- Desenhe as características relevantes em coordenadas de câmera e sobreposição no vídeo ao vivo a imagem resultante em intervalos regulares de cerca de 40 ms (Figura 3).
- Amplificadores de controle.
- Use o software amplificador para controlar as configurações do amplificador da interface.
- Control osciloscópios.
- Conecte os osciloscópios ao PC usando portas seriais.
- Determine a escala do osciloscópio, acoplamento e resolução temporal para as diferentes etapas do processo de patch-clamp em tensão-clamp (por exemplo, eletrodo na banheira, formação de selo, a configuração de célula inteira) e corrente-clamp.
- Envie os comandos de configuração do osciloscópio apropriadas sempre que os comandos de amplificação são emitidos a partir da interface.
- Pressão pipeta de controle.
- Montar um sistema de controlo de pressão de acordo com a Figura 4.
- Use uma fonte de alimentação de 12 V / 5 V para fornecer a cada componente eletrônico de forma adequada.
- Ligue a saída de uma bomba de membrana para o buffer de pressão positiva (um recipiente de 100 ml).
- Ligar a entrada de uma bomba de membrana para o buffer de pressão negativa (um recipiente de 100 ml).
- Ligue o tubo porta-pipeta para um sensor de pressão no pressure sistema de controlo e uma válvula pneumática, que liga para o compartimento de pressão principal.
- Ligar cada um dos tampões de pressão para uma válvula ligada ao compartimento de pressão principal.
- Conectar uma válvula de pressão entre o compartimento principal e a atmosfera.
- Conectar um sensor de pressão para o compartimento de pressão principal.
- Conectar um sensor de pressão de cada tampão.
- Ligar o sistema de controlo de pressão de uma placa de aquisição de dados.
- Conecte cada sensor de pressão para uma entrada analógica.
- Conecte cada válvula para uma saída digital.
- Retirar deslocamento de todos os sensores, abrindo as válvulas excepto as ligar às bombas de membrana e subtraindo a medida de pressão à pressão atmosférica.
- Implementar o controle da pressão
- Definir na interface de um controle para ativar ou de-ativar o controle de pressão positiva para cada pipeta.
- Definir uma pressão positiva mínima para a pipetas de cerca de 70 mbar.
- Periodicamente (a cada 0,5 seg) detectar sempre que a pressão em pipetas sob controle de pressão ativo cai abaixo do limiar definido.
- Após a passagem da cabeceira abrir o tampão de pressão positiva para o compartimento de pressão principal e esse compartimento para a pipeta em questão durante períodos breves (20 ms) até que a pressão nas pipetas é acima do limiar. Feche todas as outras válvulas.
- De-ativar ainda mais o controle da pressão, como a aproximação final para uma célula de interesse é iniciada.
- Aplique uma pressão negativa para a formação selo
- Feche todas as válvulas e abra a válvula tampão pressão negativa em relação à pressão do compartimento principal e esse compartimento para a pipeta em questão para a duração do experimentador requer por manter um botão pressionado.
- Montar um sistema de controlo de pressão de acordo com a Figura 4.
- Centralize comandos para um dispositivo de interface humana.
- Conecte um wirele disponível comercialmentess gamepad para o PC.
- Implementar leitura de status de joystick. Por exemplo, usar as bibliotecas do DirectX para C / C + + para realizar leituras a cada 5 ms.
- Compare o estado atual com o estado anterior para detectar quais botões foram pressionado, liberado ou permanecer pressionado desde passo última vez.
- Atribuir funções a cada botão no gamepad. Um exemplo deste mapeamento é mostrado na Figura 5.
2. Patch-clamp Procedimento
- Preparar as fatias de cérebro da região de interesse.
- Coloque uma fatia do cérebro de interesse, com a região de interesse no centro da faixa de deslocamento do microscópio.
- Seleção celular
- Identificar células de interesse por navegar com o microscópio. Guarde a posição das células com base no microscópio sistema de coordenadas com um direito do mouse clique sobre o monitor de vídeo ao vivo na parte superior da célula de interesse. A interface gráfica apresenta as células seleccionadas, assim como as micropipetas para uma visão geral e global do software irá adicionar um marcador na posição de célula que vai ser revestida sobre as imagens. Além disso uma imagem do celular é capturado para referência futura no arquivo 'celular #. Jpg'.
- Atribuição de células para pipetas
- Depois de selecionar as células de interesse, atribuir pipeta que irá gravar cada célula. A interface gráfica fornece controles de atribuição que deve ser definido. Visualize uma prévia da configuração final selecionando a opção 'Mostrar posições finais.
- Selecione cada pipeta para que a pré-visualização posição final é desejado ou marque a caixa 'Selecionar tudo'. Desativar a exibição de posição atual para melhor visualização, se necessário.
- Prepare as Pipettes
- Encha as pipetas (6-8 mohms são geralmente melhor se muitas pipetas são usados) wiª solução intracelular e carregá-los em seus titulares. Coloque os headstages em suas fixações, mas não deslizar para a frente para evitar tocar o banho com a ponta da pipeta.
- Ativar o controle de pressão positiva e selecione todas as pipetas para garantir que as dicas permanecerá limpo. Deslize com cuidado cada headstage no lugar.
- Localizando as pontas de pipeta
- Posicione o microscópio para uma posição central, com foco três milímetros acima da fatia, premindo o botão R2, mantendo o botão 'A'. Use a posição correspondente para cada manipulador como armazenado a partir da experiência anterior, premindo o botão L2, mantendo o botão A.
Nota: Neste ponto não deve ser uma sombra distintivo de uma pipeta em vista ou um pequeno movimento ao longo do eixo da pipeta deve ser suficiente para observá-lo na maioria dos casos. Compensação para as pequenas diferenças na forma pipeta tem de ser realizada manualmente. - Traga a ponta da pipeta em foco. Coloque a ponta no ponto central de vermelho da exibição de vídeo, sem mover o microscópio (que ainda deve estar na posição [0, 0, 2000]).
- Informar o software que a pipeta está no centro da tela, pressionando o botão Z, mantendo o botão C. Após cada ponta da pipeta está localizado, enviar essa pipeta para trás de modo que o seguinte pode ser localizado, premindo o botão L1, mantendo o botão A.
- Posicione o microscópio para uma posição central, com foco três milímetros acima da fatia, premindo o botão R2, mantendo o botão 'A'. Use a posição correspondente para cada manipulador como armazenado a partir da experiência anterior, premindo o botão L2, mantendo o botão A.
- Aproximando-se as células
- Uma vez que todas as pontas de pipetas foram localizados com precisão e cada pipeta é atribuída a uma célula, posicionar automaticamente as pipetas perto das suas respectivas células. Simplesmente clique com o botão direito no centro do grupo de células e selecione a opção 'cluster' no menu pop-up. Na janela de opções do cluster que irá aparecer, selecione todas as pipetas que deseja posicionar neste momento e clique em 'Vá com todas as pipetas verificados. Repita esta operação para cada conjunto de células de interesse.
- Perform a aproximação final manualmente. A posição das pipetas relativos às células podem ser especificados de forma diferente, mas normalmente é simplesmente de 200 mM para longe da célula do eixo da pipeta e 200 um acima dela, em sentido vertical, o que é suficiente para manter a ponta da pipeta de fora do tecido . Aguarde até que o posicionamento das pipetas está acabado e mover o microscópio no sentido de uma pipeta, premindo o botão R1 enquanto pressiona o botão C.
- Recalibrar cada posição pipeta, concentrando-se o microscópio sobre a sua ponta em qualquer lugar do monitor de vídeo e pressionando o botão B enquanto segura o botão C. A grade quadrada deve aparecer brevemente indicando a posição identificada da pipeta. Se a posição não está correta, posicione a ponta no ponto central da exibição de vídeo e pressione o botão Z, mantendo o botão C.
- Estabelecer a configuração anexado à célula
- Confirme se a célula de interesse para a pipeta atual é corretamentemarcado. Caso contrário, se mover ao microscópio para coincidir com a célula de interesse, com o ponto central vermelho. Marcar a célula pressionando o botão Y, mantendo botão C. Pressione L2, mantendo o botão C para posicionar a pipeta de 200 mM de distância de sua célula atribuído, o microscópio passará automaticamente para a posição correspondente.
- Ajuste a posição da pipeta para que coincida com o ponto vermelho. Ajustar o deslocamento pressionando o botão R1 enquanto pressiona o botão X. pipeta
- Ative o pulso de teste pressionando o botão L1, mantendo o botão X. aproximar lentamente a pipeta para sua célula atribuído.
- Ao observar a formação de uma depressão na superfície da membrana da célula aplicam-se um breve pulso de pressão negativa, premindo o botão Y, mantendo o botão Z para permitir que a pressão aplicada para alcançar a célula. Um potencial de realização de cerca de-65mV deve estabelecida neste ponto pressionando o botão L2, mantendo o botão X.
- A configuração de célula inteira
- Uma vez que um Giga-selo é formado, para cada célula, começa ruptura das membranas pela aplicação de pressão negativa.
- Realize gravações
- Use o sistema de estimulação / aquisição para realizar as suas gravações. Aplicar pulsos ou trens de pulsos em uma célula individual em um tempo e observar as respostas sobre as células restantes para mapear a conectividade entre as células gravadas.
- Recede pipetas
- Uma vez que as gravações terminarem, recuar pipetas lentamente do tecido clicando com o botão direito do mouse no botão de rádio de mesa. Selecione "Recede-> Pipettes 500 mm 'para ter as pipetas recuar a uma curta distância ao longo de seus eixos. Observe a deriva no potencial das células (limpar as pontas, aplicando um pouco de pressão positiva pode ajudar).
- Para diminuir pipetas todo o caminho de volta, definir a velocidade de posicionamento para 'Fast' e repetir a mesma operação, mas escolha a opção 'Todos'. Remover o usadopipetas, deslizando suavemente os headstages e desapertando as pipetas dos respectivos detentores. É útil para evitar torções titulares em suas órbitas pois isso pode interferir muito com a posição da ponta da pipeta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seguindo os métodos descritos acima, conseguimos realizar a gravação de células inteiras de até doze neurônios simultaneamente, praticamente duplicando o maior número de neurónios em simultâneo, até agora fixada patch. Exemplos de redes de ligações sinápticas directas entre neurónios piramidais gravada na camada V do córtex somatossensorial de ratos são apresentados na Figura 6.
A determinação de perfis de probabilidade de ligação como função da distância inter-somática para um determinado tipo de célula é uma medição típica de interesse que pode ser realizada de forma eficiente com um sistema de patch-clamp de multi-eléctrodo 1. Recentemente foto-estimulação começou a aparecer como uma ainda mais eficiente meio de obtenção de tais dados 3,4. É importante notar, no entanto, os dados obtidos com os sistemas de patch-clamp multieletrodos experimentadores permite obter um mapeamento mais completa da rede em estudo, bem como a coloração de alta resolução com intracelular difusa corantes. Em multieletrodos experiências de patch-clamp de cada célula pode ser gravado e estimulada, o que muitas vezes não é o caso com outras técnicas, tais como foto-estimulação ou de imagem de cálcio. Este recurso permite que pesquisadores para acompanhar tendências em conectividade, tais como a alta incidência de conexões recíprocas, o que não pode ser medido de outra forma. Ao estimular e gravar cada neurônio estudada, mostraram que os neurônios não são apenas inclinado para serem reciprocamente conectado, mas também formam aglomerados. A escala de nossas gravações também permitiu observar que existia uma probabilidade de conexão maior entre os pares de neurônios que compartilharam vizinhos comuns, isto é, ambos foram conectados simultaneamente a outros neurônios individuais na rede amostrada (Figura 7a). Esta observação foi significativa em todos os bin intersomï distância de 50 mm (de 50 a 250 mm). Observamos também pares de neurônios que compartilham muitos vizinhos comuns ocorreu significativamente maisdez do que o esperado pelo acaso (Figura 7b). Além disso, verificou-se um efeito sobre a probabilidade de ligação de acordo com o número de vizinhos comuns entre um dado par de neurónios. Os vizinhos mais comuns que compartilha o mais provável um par de neurônios é para ser interligados (Figura 7c).
Esta tendência leva à formação de grupos de neurónios que são mais densamente interligadas do que a média. Curiosamente, grupos altamente interligados de neurônios não só exibiu mais numerosas conexões, mas também, em média, os mais fortes, um. Estes resultados nos levaram à conclusão de que os circuitos neocortical é não só organizados em camadas e colunas, mas também em conjuntos de células, ou seja, grupos de neurônios que compartilham interconectividade sináptica densa e forte como postulado por Donald Hebb há várias décadas.
Outros resultados de interesse que podem ser alcançados com múltiplas simultaneamente patch-fixada neurons incluem a quantificação do recrutamento de inibição de actividade supra-limiar em diferentes números de células excitatórias 2. Uma forma ubíqua de inibição no neocórtex 5 é mediada por células Martinotti (Figuras 8A e B, adaptado de Berger et al.) Que recebem a entrada das células piramidais e integrá-lo, por sua vez afectar, com alguma latência, outras células piramidais. Nós mostramos que, depois de breves explosões de atividade spiking em tão poucos como quatro células piramidais, cada célula piramidal em um microcircuito local recebe este tipo de inibição (Figuras 8c, c, e f). Também mostrou que esses potenciais pós-sinápticos inibitórios tendem a saturar quando oito ou mais piramidais células são estimuladas simultaneamente (Figura 8E).
Uma visão geral sobre os componentes do sistema pode ser visto na Figura 9. A interface de hardware e software de are mostrado na Figura 9a e b, bem como a interface do controlador na Figura 9c orientando os eletrodos para células para gravar sob objetiva do microscópio (Figura 9d).
Figura 1. O cálculo do número de ligações observados numa experiência como uma função do número de neurónios gravados simultaneamente mostra um crescimento quadrática. Cálculos numéricos (topo). Diagrama ilustrativo onde mais neurônios da mesma rede são adicionados sucessivamente (em baixo).
Figura 2. Os sistemas de coordenadas de cada manipulador eletrodo (amarelo) e microscópio (vermelho).
Figura 3. Captura de tela de uma pipeta na abordagem para celular atribuído com sobreposto vetor contexto, as posições celulares e barra de escala.
Figura 4. Diagrama que ilustra o sistema pneumático para o controlo da pressão da pipeta.
Figura 5. Comandos no dispositivo de interface humana que centraliza os controles usados em experimentos de patch-clamp.
Figura 6. Exemplo de três redes deconexões sinápticas directos mapeados em ensaios experimentais individuais
Figura 7. Efeito vizinho comum. (A) Os pares de neurónios que se ligam simultaneamente a pelo menos um outro neurónio na rede de amostragem (azul), exibem um aumento significativo da probabilidade de ser interligados. (B) Os pares de neurónios compartilham vários vizinhos comuns ocorrem mais frequentemente do que o esperado por acaso nas redes amostrados (c) Ligação de probabilidade. dentro pares de neurónios aumenta como uma função do número de vizinhos comuns entre o par.
Figura 8. Quantificação do recrutamento de Martinotti Cells. (a) Representação gráfica de uma célula piramidal (vermelho) que formam sinapses em um celular Martinotti (azul), que por sua vez formas sinapses em um segundo celular piramidal (preto). (b) estímulo supra-limiar da célula piramidal ( vermelho) leva ao recrutamento do celular Martinotti (azul) através da integração de potenciais pós-sinápticos excitatórios facilitar. O celular Martinotti Recrutado então inibe a segunda célula piramidal (preto). (C) Diagrama que representa a estimulação do aumento do número de células piramidais presa-de correção e os efeitos sobre outra célula piramidal. (D) Média de potenciais pós-sinápticos inibitórios gravados a partir de uma célula piramidal como uma função do número de outras células piramidais nas proximidades que são estimuladas. Adaptado de Berger et al. 2 (e) A amplitude de inibição disynaptic num circuito local tende a saturar quando nove ou mais células piramidais são estimuladaspovoadas indicando recrutamento máxima de células em Martinotti provavelmente atingido neste momento. (f) A fracção de células que receberam a inibição disynaptic rapidamente sobe para 1 como o aumento do número de células piramidais são estimulados.
Figura 9. Ilustração do conjunto do sistema. (A) Interface gráfica do usuário com a janela principal, exibição de vídeo ao vivo, a janela e representação gráfica de log. (B) Microscópio e manipuladores. (C) dispositivo de interface humana com controles para o procedimento experimental. (D) Vidro micropipetas em posição para a gravação de vários neurônios.
Figura 10. Probabilit Binomialfunções de distribuição de y que descrevem a fração de experimentos que registram com sucesso um determinado número de células, dado o uso de doze eletrodos. Comparação entre o rendimento de experimentos realizados com feedback visual por usuários experientes são mostrados em azul e por usuários menos experientes em condições não ideais no vermelho.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uma questão imediata geralmente surge sobre a taxa de sucesso do procedimento foi descrito. Para altas taxas de sucesso preparação é essencial. Pipettes deve ter aberturas de ponta que são adequadas para os seres células gravadas. Filtração da solução intracelular para evitar pipetas entupidos também é importante. São impecáveis, pipetas acabadas de tirar são outra exigência. A distribuição binomial é o modelo mais simples que pode ser usado para entender como essas questões afetam o rendimento final. É razoável esperar que um experimentador com experiência e equipamento adequado para alcançar uma taxa de sucesso de 80% ou mais na gravação de neurônios individuais com feedback visual. Iniciantes podem ser esperados para alcançar taxas de sucesso muito mais baixos, especialmente se passos importantes de preparação são negligenciados. Como estas taxas traduzir em números de células gravadas por experiência podem ser vistos na Figura 10. Novos aumentos no número de simultaneamente patch-clamneurônios ped provavelmente vai exigir miniaturização dos manipuladores e aumento da fiabilidade do processo, que por sua vez requer uma atenção considerável aos detalhes, mas é totalmente viável.
A versatilidade do sistema aqui apresentado ainda está sendo explorado e novas aplicações têm sido freqüentemente encontrados, em especial, na exploração da relação entre sinais extracelulares e atividade neurônio individual 7. Considerações anatômicas tornam-se mais importante que a distância entre os aumentos registrados células. No entanto, este sistema permite que definitivamente investigação de longo alcance e conectividade inter-camada onde as conexões permanecem intactos após o processo de corte.
Controle micromanipulador
Ativando posicionamento automático com os micromanipuladores acelera muito o processo de multi-eletrodo patch-clamp e aumenta sua confiabilidade reduzindo a ocorrência deerros humanos. Diferentes fabricantes fornecer soluções diferentes, a fim de estabelecer uma conexão do PC para os manipuladores. Uma opção comum é uma porta serial ou USB. A fim de garantir uma comunicação rápida, dedicamos uma porta serial para cada controlador de manipulador. O recurso mais útil de posicionamento automático é, provavelmente, a eliminação de movimento mais lateral e vertical de eletrodos dentro do tecido e que limitem a sua distorção. À medida que o movimento dos eléctrodos no interior do tecido ocorre quase exclusivamente no sentido axial, a interferência mecânica é minimizada. Movimentos laterais são necessário apenas ocasionalmente evitar vasos sanguíneos e células.
Visualize posições dos eletrodos
É muito útil ser capaz de controlar a posição de cada eléctrodo durante um experimento. Em uma configuração tradicional perder visão de um eletrodo pode rapidamente tornar-se problemática. Quando se utiliza um grande número de eléctrodos não épossível manter todos os eléctrodos dentro do campo de visão em todos os momentos. Baseando-se em uma representação gráfica é a alternativa mais intuitiva e também ajuda a manter o controle sobre o andamento do experimento, mostrando de imediato que já eletrodos foram posicionados em sua configuração final e quais não têm.
Aquisição de vídeo e de sobreposição
A capacidade de exibir vídeo ao vivo a partir do campo do microscópio de vista em uma janela do aplicativo é muito útil. A janela de exibição foi programado para responder a cliques do mouse, permitindo armazenamento de posições de interesse (somata celular), bem como atualização rápida das posições relativas entre microscópio e eletrodos removendo erros acumulados sempre que eles aparecem. Também implementamos a sobreposição de informações práticas sobre o vídeo ao vivo, como a trajetória de aproximação para cada eletrodo para células escolhidas ou a marcação dessas células (Figura 3). Registro ocaracterísticas de f e superposição de imagens auxiliares, tais como dados do atlas anatômico também foi implementado para ajudar onde as regiões de interesse não são imediatamente claras.
Amplificadores
Computador controlado amplificadores microscópio pode permitir o controle para ter lugar a partir de outras aplicações também. Isso aumenta drasticamente a velocidade ea confiabilidade com que várias células podem ser gravadas simultaneamente e elimina a principal fonte de erros humanos. Após posicionamento e pressão pipeta controle assistida por computador este é o passo que produz os ganhos mais notáveis no tempo, mas os ganhos em confiabilidade são ainda mais importantes.
Osciloscópios
Garantir que os sinais de teste podem ser visualizados em tempo real, à escala adequada e resolução temporal aumenta muito a eficiência com que um experimentador pode executar passos experimentais. Ao unir o conjunto osciloscópiotings ao amplificador modos (como braçadeira de tensão ou corrente) que assegurou que as medidas de tempo crítico foram executados e visualizados com pouco esforço, como celas de potenciais de membrana apropriados imediatamente após atingir a configuração anexado celular. Visualização adequada foi assegurada através do envio de comandos de escala e de acoplamento apropriadas através da porta serial em protocolo próprio do osciloscópio para ajustar a amplitude eo deslocamento dos sinais de teste dentro da tela do osciloscópio.
Controle de pressão Pipeta
À medida que o número de eléctrodos utilizados em uma experiência aumenta, garantindo que a pressão positiva é aplicada de forma permanente para manter a ponta dos eléctrodos de vidro limpo torna-se mais exigente para o ponto de constituir um obstáculo importante. Pressão positiva e negativa suficiente (algumas centenas de mbar) pode ser gerado por meio de bombas de membrana simples. A fim de estabilizar a pressão, estas bombas foram acoplados para reservoirs de cerca de 100 ml, cuja abertura e fechamento foi controlado por válvulas pneumáticas. As válvulas, por sua vez estavam usando uma placa de aquisição de dados controlado por computador. O diagrama do circuito pneumático pode ser visto na Figura 4. O regulador de pressão desempenha um papel importante, não só garantindo pontas de pipeta permanecer limpo, mas também permitindo a formação de selos gigaohm rapidamente, mediante a observação de covinhas na membrana celular como pipetas tocar as células, acelerando ainda mais o processo.
O dispositivo de interface humana
A maioria das montagens experimentais têm os controles do equipamento experimental amplamente dispersos em uma grande área. Concentramos os controles mais comumente usados em um único gamepad sem fio (Figura 5) reduzindo o tempo eo esforço necessários para registrar cada célula, mas o mais importante, eliminar fontes de erro humano que muitas vezes podem trazer grandes experiências para um e prematuroª.
A linguagem de programação
Tivemos muito pouca escolha em termos de linguagem de programação para esta aplicação já que a única linguagem que apoiou a integração de todo o equipamento necessário foi C / C + +. Uma grande vantagem do C / C + + é a possibilidade de implementar vários segmentos de processamento e de beneficiar plenamente a melhora de desempenho permitido pela processadores de núcleos múltiplos.
Aquisição de dados eletrofisiológicos
O sistema que descreveu deixa a escolha do software de gravação eletrofisiológico e sistema de aquisição de dados até o experimentador. Troca de comunicação entre o software de aquisição de dados e nossa aplicação pode ser feita através de portas seriais ou através da comunicação tomada pela rede.
Perspectivas futuras
Mais de 30 anos desde de Sakmann e Neher experiências seminais, a técnica de patch-clamp é stilsozinho no fornecimento de dados com uma combinação particular de resolução do sinal de frequência de amostragem e que são necessários para uma ampla variedade de experiências, em particular l aqueles envolvendo a detecção de correntes ou potenciais pós-sinápticos individuais. Através do desenvolvimento de um sistema assistido por computador que permite a gravação de muitos neurônios simultaneamente que visa ampliar as possibilidades experimentais da técnica de patch-clamp. Combinação dessas novas possibilidades com os desenvolvimentos recentes em neurociência experimental 8-13 pode abrir o caminho para uma compreensão mais profunda dos circuitos neuronais com velocidade e detalhes sem precedentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi e Sonia Garcia para conselhos valiosos sobre melhorias para a automação de processo patch-clamp. Agradecemos Rajnish Ranjan para aconselhamento e assistência com implementação de software valioso. Este trabalho foi financiado em parte pelo projeto Synapse UE e, em parte, pelo Programa Ciência Fronteiras Humanos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
References
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
- Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
- Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
- Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
- Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
- Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
- Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).
