Summary
Multi-elektrot patch-kelepçe kayıtları karmaşık bir görev oluşturmaktadır. Burada, deneysel adım birçok otomatik olarak, performans ve kayıtların sayısı kaliteyi iyileştirmek yol açan sürecini hızlandırmak için nasıl mümkün olduğunu gösterir.
Abstract
Patch-klemp tekniği bireysel nöronlar ya da subselüler bölmelerden elektriksel aktivite kayıt için en köklü yöntemi bugün. Bununla birlikte, kararlı kayıtları elde, hatta tek tek hücrelerden, önemli ölçüde karmaşık bir zaman alıcı bir işlem kalır. Verimli bilgi ekranı ile birlikte birçok adımdan Otomasyon ölçüde daha yüksek güvenilirliği ile kayıtların büyük bir dizi performans ve daha az sürede experimentalists yardımcı olabilir. Büyük ölçekli kayıtları elde etmek için biz en verimli yaklaşım tamamen sürecini otomatik hale ancak deneysel adımları basitleştirmek ve verimli deneycinin deneyim ve görsel geribildirim birleştiren ise insan hatası olasılığını azaltmak değil varmıştır. Akılda bu hedefleri ile biz tek bir arayüzde bir çok elektrot patch-kelepçe deneyde, bir Commerc için gerekli tüm kontrolleri merkezde bilgisayar destekli bir sistem geliştirdiially mevcut kablosuz gamepad, bilgisayar ekranında deney ile ilgili bilgiler ve rehberlik ipuçları göstermeleridir. Burada bize kayıt yapılandırmasını elde etmek için gerekli olan zamanı azaltır ve büyük ölçüde başarılı bir şekilde eş zamanlı olarak nöronların sayıda kayıt şansını artırmak için izin sisteminin farklı bileşenleri tarif eder.
Introduction
Mikrometre hassasiyet ile birden fazla site kayıt ve teşvik kapasitesi deneysel nöronal sistemlerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak için son derece yararlıdır. Bu amaçla birçok teknik geliştirilmiştir ama hiçbiri submillivolt çözünürlük eşik altı aktivitesi ve bireysel postsinaptik potansiyeller çalışmak için gerekli olan patch-clamp tekniği ile elde izin verir. Burada aynı zamanda bir kayıt ve nöronal bağlantı çalışma için yeterli hassasiyetle tek tek hücrelerin bir çok sayıda uyarıcı hedefleyen bir on iki elektrot bilgisayar destekli patch-clamp sisteminin geliştirilmesi kapsar. Diğer birçok uygulama böyle bir sistem için tasarlanmış olsa da, bu nöron grubu içinde mümkün bağlantılarının sayısı, söz konusu durum nöron sayısının karesi ile orantılı olarak büyür verilen sinaptik bağlantı çalışmaya özellikle de çok uygundur. Bu nedenle, üç elektrotlu bir sistem sağlar test ederkenkadar altı bağlantılarının oluşumu ve en sık oniki nöronların kayıt, tek tek kadar kayıt 132 bağlantıların oluşumunu test ve sık sık (Şekil 1) bir düzineden fazla gözlemlemeye olanak sağlar. Bağlantıların onlarca gözlem anda mümkün küçük ağların organizasyonu analiz ve aksi halde 1 problanabilir edilemez ağ yapısının istatistiksel özelliklerini anlaması için yapar. Ayrıca, çok sayıda hücrelerin kesin uyarılması da postsinaptik hücreleri 2 işe kantifizasyonunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Ekipmanları Hazırlık
- Bilgisayardan kontrol manipülatörler
- Seri port (RS-232) üzerinden bir bilgisayara her mikromanipülatördür denetleyici kutusuna bağlayın.
- Sorgulama ve seri port üzerinden gönderilecek ayarlarını, konumlandırma için komutları uygulamak. Verilen hız ve donanım uyumluluk sorunları C / C + + programlama dili olarak tavsiye edilir.
- Sıfır motorlar ve pozitif hareket motorları uzağa yönlendirilir ile ilgili olarak mümkün olan en konumu böylece manipülatörlerin referans sistemini standart hale getirilmiştir.
- 2 mm numune odak düzlemi (koordinatlar [0, 0, 2000]) üzerinde merkezi bir konumda mikroskop yerleştirin.
- Store, her bir manipülatör için, bir pipet ucu mikroskop görüş alanının merkezinde gözlenmesine olanak sağlayacak yerel koordinatlar. Bu her elektrot için ilk referans noktasıdır.
- Visualizedirler elektrot konumları. Bu bir deney sırasında her elektrodun pozisyonunu takip edebilmek için çok yararlıdır. Bir grafik gösterimi Bunu sağlamanın en kolay yoludur. Bu amaçla referans her elektrodun sistemleri ve mikroskop eşleşme. Bunu gerçekleştirmek için basit bir yoldur:
- Görüş alanının merkezine bir elektrot ucu getirin.
- Manipülatör her eksen üzerindeki konumunu ve mikroskop her ekseni saklayın.
- Manipülatör göreceli olarak büyük bir hareket (1 mm) x-ekseni ile çalıştırın.
- Bir kez daha, sadece mikroskop hareketli ucu bulun.
- Geçen ölçüldü yana mikroskop pozisyonda farkı hesaplayın. Bu mikroskop eksenleri üzerine elektrot eksen hareketinin tahminler vardır.
- Y ve elektrot manipülatör Z eksenleri için 2.5 - 2.3 adımları tekrarlayın. Bu mikroskop üzerine çıkıntıların bir matris (<belirlenmelidir eksenlerine izin verirstrong> Şekil 2) de kosinüs matrisi denir:
- Mümkün koordinat sistemi mikroskop belirli bir konuma ulaşmak için elektrot manipülatör tarafından gerekli üç boyutlu olarak hareketleri, hesaplamak için bu matris tersine çevirme:
- Ilk referans noktasını kullanarak ve kosinüs matrisi mikroskopta her elektrodun pozisyonunu belirlemek koordinatları.
- Mikroskop, düzenli aralıklarla, her elektrodun konumu koordinatları göre, grafik olarak gösterir. Biz elektrot konumlarını her 40 msn'den çekmek için C / C + + çizim kütüphaneleri (GDI +) kullanmayı seçti.
- 1.2.7 birkaç milimetre pozisyon değişiklikleri ihtiyaç varsa manipülatör açıları değiştirilebilir veya her seferinde, örneğin, elektrot tipi değiştirildiğinde - tekrarlayın 1.2.1 adımları.
- Positio saklamak etkinleştirinBu tür hücreler ya da anatomik referans noktaları olarak dokuda ilgili özelliklerinden ns, mikroskopta koordine eder.
- Videoyu Edinme ve ilgili bilgi bindirmek.
- Mekanik mikroskop kameranın yatay ekseni ile mikroskop hareket x-ekseni hizalayın.
- Bilgisayarınızda canlı video ve bindirme yeteneği ve bir yazılım geliştirme kiti (SDK) ile bir framegrabber yükleyin.
- SDK ile canlı video görüntüleme işlemi uygulamak.
- Mikroskop uygun çeviri ve pullanma ile kamera referans sistemine koordinat sistemi dönüştürmek.
- Yaklaşık 40 msn (Şekil 3) düzenli aralıklarla canlı video edilen görüntü üzerinde kamera koordinatları ve bindirme olarak ilgili özellikleri çizin.
- Kontrol Amplifikatörler.
- Arayüzünden amplifikatör ayarlarını denetlemek için amplifikatör yazılımını kullanın.
- Coosiloskoplarını NTROL.
- Seri bağlantı noktalarını kullanarak PC'ye bağlayın osiloskoplarını.
- Gerilim-kelepçe de yama kelepçe prosedürünün farklı adımları için osiloskop ölçeği, kavrama ve zamansal çözünürlük belirleyin (örneğin elektrot banyo, mühür oluşumu, tam hücreli konfigürasyonunda) ve akım-kelepçe.
- Amplifikatör komutları arayüzünden her yayımlandığında uygun osiloskop ayarı komutları gönderebilirsiniz.
- Kontrol pipet basıncı.
- Şekil 4'e göre bir basınç kontrol sistemi bir araya getirin.
- Uygun şekilde her elektronik komponent temini için bir 12 V / 5 V güç kaynağı kullanın.
- Pozitif basınç tampon maddesi (100 mi kabı) için bir membran pompasının çıkışını.
- Negatif basınç tamponu (100 mi kabı) için bir membran pompasının girişi takın.
- Pressu olarak, bir basınç sensörüne pipet tutucusu boru geçkontrol sistemi ve ana basınç bölmesine bağlayan bir pnömatik vana yeniden.
- Ana basınç bölmesine bağlı bir valf için basınç tampon her bağlayın.
- Ana basınç bölmesi ve atmosfer arasında bir valf bağlayın.
- Ana basınç bölmesine bir basınç sensörü bağlayın.
- Her tampon bir basınç sensörü bağlayın.
- Bir veri toplama kuruluna basınç kontrol sistemi bağlayın.
- Bir analog giriş için her basınç sensörü bağlayın.
- Dijital çıkış için her valfini bağlayın.
- Membran pompalara bağlayan olanlar dışındaki tüm vanaların açılması ve ölçülen basıncı çıkarılarak tüm sensörlerden ofset atmosferik basınç çıkarın.
- Basıncı kontrolü uygulamak
- Arayüzünde her pipet için pozitif basınçlı kontrolünü etkinleştirmek veya de-etkinleştirmek için bir denetim tanımlayın.
- Pipet için bir pozitif basınç en az tanımlamayaklaşık 70 mbar'lık s.
- Aktif basınç kontrol altında pipet basınç ayarlanan eşiğin altına düştüğünde periyodik olarak (her 0.5 sn) algılar.
- Eşiği geçtikten sonra pipetler basınç eşiğinin üstünde olana kadar kısa süreli (20 msn) sırasında söz pipet doğru ana basınç bölmesi ve bu bölme için pozitif basınçlı tampon açın. Diğer tüm vanalarını kapatın.
- Ilgi bir hücreye doğru son yaklaşma başlatılan gibi başka basınç kontrolü de etkinleştirebilirsiniz.
- Mühür oluşumu için negatif basınç uygulayın
- Tüm vanaları kapatın ve deneyci basılı bir düğmeye tutarak gerektirir süre için söz konusu pipet doğru ana basınç bölmesi ve bu bölmeye yönelik negatif basınç tampon vanasını açın.
- Şekil 4'e göre bir basınç kontrol sistemi bir araya getirin.
- Bir insan arabirim aygıt üzerine komutları merkezde.
- Bir ticari olarak temin edilebilir Kablosuz A geçPC'ye ss gamepad.
- Joystick durumu okunmasını uygulamak. Örneğin, readouts her 5 msn'den gerçekleştirmek için C / C + + için DirectX kütüphaneleri kullanabilirsiniz.
- Düğmeler son kez adım beri, basılı serbest veya basılı tutuldu algılamak için önceki durumu ile şimdiki durumunu karşılaştırın.
- Gamepad her düğmenin fonksiyonları atayın. Bu eşleme bir örneği Şekil 5'te gösterilmektedir.
2. Patch-kelepçe Prosedürü
- Ilgi bölgenin beyin dilimleri hazırlayın.
- Mikroskop yer değiştirme aralığının merkezinde ilgi bölgesi ile, ilgi konusu bir beyin dilim yerleştirin.
- Hücre Seçim
- Mikroskop ile tarayarak ilgi hücreleri belirlemek. Koordinat sistemi mikroskop göre hücrelerin konumunu kaydedin doğru bir ilgili hücrenin üstüne canlı video ekranında fare tıklaması. Görüntülerde yerleştirilecektir hücre konumundaki bir işaretleyici katacak grafik arayüzü küresel bir bakış ve yazılım için seçilen hücrelerin yanı sıra mikropipetler gösterecektir. Ayrıca hücrenin bir görüntü dosyası 'Hücre #. Jpg' İleride referans olması için yakalanır.
- Pipetler hücrelerin Attribution
- Ilgi hücreleri seçtikten sonra, her hücre kaydetmek hangi pipet atayın. Grafik arayüzü ayarlanmış olmalıdır atama kontrolleri sağlar. Checkbox 'Show Final Pozisyonlar' seçerek son yapılandırma önizlemesini gözünüzde canlandırın.
- Nihai pozisyon önizleme istenen veya 'Tümünü Seç' onay kutusunu olduğu için her pipet seçin. Gerekirse daha iyi görselleştirme için geçerli konum ekranı devre dışı bırakın.
- Pipetler hazırlayın
- (- Birçok pipetler kullanılır ise, 8 MQ genellikle en iyi 6) wi pipetler doldurunhücre içi bir çözüm inci ve onların sahipleri onları yük. Kendi fiksasyonlarında headstages yerleştirin ama pipet ile banyo dokunmamak için ileri kaydırın yok.
- Pozitif basınç denetimini etkinleştirmek ve ipuçları temiz kalmasını sağlamak için tüm pipetler seçin. Yavaşça bir yerde her headstage kaydırın.
- Pipet ipuçları bulma
- 3 mm 'A' tuşuna basılı tutarken düğmeye R2 basarak dilim üzerinde odak merkezi bir konuma mikroskop yerleştirin. Düğmesi L2 basarak önceki deney saklanan olarak düğme A tutarken her manipülatör için gelen konumunu kullanın
Not: Çoğu durumda bunu gözlemlemek için yeterli olmalıdır Bu noktada görünümünde bir pipet farklı bir gölge ya da Pipet ekseni boyunca küçük bir hareketi ya da olmalıdır. Pipet formda bir miktar farklardan telafisi için el ile yapılması gerekir. - Odak haline pipet getir. (Hala [0, 0 2000] pozisyonda olmalıdır) mikroskop hareket ettirmeden görüntü ekranın merkezi kırmızı nokta üzerinde ucunu yerleştirin.
- Pipet her pipet ucu bulunduktan sonra düğmesini C. tutarken düğmeye Z basarak ekranın merkezinde bulunan yazılım bilgilendirin, geriye o pipet göndermek böylece düğme A tutarken, tek bir düğmeye basarak L1 bulunabilir aşağıdaki
- 3 mm 'A' tuşuna basılı tutarken düğmeye R2 basarak dilim üzerinde odak merkezi bir konuma mikroskop yerleştirin. Düğmesi L2 basarak önceki deney saklanan olarak düğme A tutarken her manipülatör için gelen konumunu kullanın
- Hücreleri yaklaşırken
- Tüm pipet uçları lokalize edilmiş ve her pipet bir hücreye atfedilen sonra, otomatik olarak kendi hücrelerine yakın pipetler yerleştirin. Sadece bir hücre grubunun merkezinde sağ tıklatın ve açılır menüde seçeneği 'Küme' seçiniz. , Görünür şu anda konumlandırmak istediğiniz tüm pipetler seçin ve 'tüm işaretli pipetler git' tıklayın olacak kümesi seçenekleri penceresinde. Ilgi hücreleri her küme için bu işlemi tekrarlayın.
- Peel ile son yaklaşım rform. Hücrelere göreli pipetler konumu farklı belirtilen ancak genellikle 200 um uzakta doku dışında pipetin ucu tutmak için yeterli olan dikey yönde, pipet ve yukarıda 200 um, en ekseninde hücreden basitçe edilebilir . Pipet konumlandırma bitene kadar bekleyin ve düğme C tutarak düğme R1 basarak bir pipet doğru mikroskop hareket
- Video görüntüsüne herhangi bir yerde bahşiş mikroskop odaklanarak ve düğme C'yi bir kare ızgara tutarken B düğmesine basarak her pipet konumunu yeniden kalibre kısaca pipet tespit konumunu belirten görünmelidir. Pozisyonu doğru değilse düğmesini C. tutarken, video görüntü ve düğmesine basın Z merkezi nokta üzerinde ucu yerleştirin
- Hücreye bağlı yapılandırma kurulması
- Geçerli pipet ilgi hücre doğru olduğunu teyitişaretlenir. Aksi merkezi kırmızı nokta ile ilgi hücre maç için mikroskop taşıyın. Mark pipet uzakta onun atanan hücreden 200 mikron konumlandırmak için C düğmesine tutarken düğmesi C. düğmesine basın L2 tutarken düğmeye Y basarak hücre, mikroskop otomatik olarak ilgili konuma hareket edecektir.
- O kırmızı noktayı eşleşecek şekilde pipet konumunu ayarlayın. Düğmesi X'i tutarak düğme R1 basarak ofset pipet ayarlayın
- Yavaş yavaş atfedilen hücreye pipet yaklaşım düğmesine X'i tutarken düğmeye L1 basarak testi darbesi etkinleştirin.
- Hücre zarı yüzeyi üzerinde bir çukur oluşumunun gözlenmesi üzerine uygulanan basınç hücre ulaşmak için izin düğme Z tutarken düğmesine basarak Y negatif basınç kısa bir darbe uygulamak. Yaklaşık-65mV bir tutma potansiyeli düğme X tutarken düğmeye L2 basarak bu noktada kurulmuş olmalıdır
- Tüm hücre konfigürasyonunun
- Bir Giga-mühür, her bir hücre için oluşturulduktan sonra, negatif basınç uygulanarak zarlar kopmasına başlatın.
- Kayıtları gerçekleştirin
- Kayıtları gerçekleştirmek için stimülasyon / toplama sistemi kullanın. Bir seferde darbeleri veya bir tek hücre üzerindeki bakliyat trenler uygulayın ve kaydedilen hücreler arasında bağlantı haritasına kalan hücrelerin yanıtları gözlemlemek.
- Pipetler gerileyeceği
- Kayıtlar bittikten sonra, Tablo radyo düğmesini sağ tıklayarak dokudan yavaş yavaş çekilmeye pipetler. Pipetler kendi eksenleri boyunca kısa bir mesafe çekilmeye var 'gerileyeceği-> Pipetler 500 um' seçeneğini seçin. (Bazı pozitif basınç uygulayarak ipuçları temizleyerek yardımcı olabilir) hücrelerin potansiyeli sürüklenme gözlemlemek.
- Tüm yolu geri pipetler çekilmeye, 'Hızlı' olarak konumlandırma hızını ayarlamak ve aynı işlemi tekrarlayın, ancak 'tüm' seçeneğini seçin. Kullanılan kaldırmayavaşça headstages dışarı kayar ve sahiplerinden pipetler sökerek pipetler. Bu büyük ölçüde pipet ucu pozisyonu ile etkileşebilir beri yuvalarına sahipleri büküm önlemek için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda tarif edilen yöntemler izlenerek neredeyse eş zamanlı olarak nöronların en çok patch-kenetlenir ve böylece iki katına kadar, aynı anda en fazla on iki nöron bütün hücre kayıt performans başardı. Sıçanların somatosensory korteks tabaka V kaydedilen piramidal nöronlar arasındaki doğrudan sinaptik bağlantıların ağların örnekleri, Şekil 6'da gösterilmiştir.
, Belirli bir hücre tipi için somatik arası mesafenin bir fonksiyonu olarak bağlantı olasılığı profillerinin belirlenmesi, bir çok elektrot patch-clamp sistemi 1 ile etkin bir şekilde gerçekleştirilebilir ilgi tipik bir ölçüsüdür. Son zamanlarda fotoğraf-stimülasyon gibi veri 3,4 elde daha verimli bir araç olarak görünmeye başladı. Önemlisi, ancak, çoklu elektrot patch-kelepçe sistemleri ile edinilen veriler deneyciler daha eksiksiz bir çalışmanın altında ağ haritalama gibi içi ile yüksek çözünürlüklü boyanma elde etmesini sağlarhücresel boyalar dağınık. Multi-elektrot patch-kelepçe deneylerinde her hücre genellikle fotoğraf uyarılması veya kalsiyum görüntüleme gibi diğer teknikleri ile durum böyle değil, hangi kayıt ve teşvik edilebilir. Bu özellik, deneyci gibi aksi ölçülen olamaz karşılıklı bağlantıların yüksek insidansı, gibi, bağlantı önyargıları izlemenize olanak sağlar. Her okudu nöron uyarıcı ve kayıt biz nöronlar değil, sadece karşılıklı olarak bağlı olan karşı önyargılı değil, aynı zamanda kümeler oluştururlar gösterdi. Bizim kayıtların ölçek da bize daha yüksek bir bağlantı olasılığı ortak komşular örneğin, her ikisi aynı anda, örneklenen ağ (Şekil 7) olarak diğer bireysel nöronlar bağlanmıştır ortak nöronların çiftleri arasında olduğunu gözlemlemek bırakıldı. Bu gözlem (50 ila 250 mm) 50 mm her intersomatic mesafe bin anlamlı oldu. Ayrıca birçok ortak komşuları paylaşan nöronların çift anlamlı daha oluştu gözlenenOn şans (Şekil 7b) ile beklenenden daha. Ayrıca, belirli bir nöron tarafından paylaşılan ortak çift komşu sayısına göre bağlantı olasılık üzerinde bir etkisi tespit edildi. Bu daha çok nöronların bir çift paylaşan daha sık komşu (Şekil 7c) birbirine olmaktır.
Bu eğilim, daha yoğun bir ortalama fazla birbirine bağlı nöronların gruplarının oluşumuna yol açar. İlginçtir, nöronların birbirine son derece grupları ortalama, güçlü olanlardan 1, aynı zamanda daha fazla sayıda bağlantı sergiledi değil sadece. Bu bulgular Neokortikal devresi katmanları ve sütunlarda düzenlenen değil, aynı zamanda hücre derlemeler içine değil sadece bu sonuca götürdü, birkaç yıl önce Donald Hebb tarafından öne gibi yoğun ve güçlü sinaptik birleştiricisi paylaşım nöronların yani gruplar.
Aynı anda birden fazla yama kenetli n ile elde edilebilir ilgi diğer sonuçlareurons uyarıcı hücreler 2 farklı sayılarda supra-eşik aktivitesinin inhibe işe miktarının içerir. Neokorteks 5 inhibisyonunun bir yerde bir şekilde, piramidal hücre girdi almak ve bir bekleme süresi, diğer piramidal hücreleri ile, etki sırayla entegre (Berger et al. Uyarlanmıştır Şekil 8a ve b) Martinotti hücreler tarafından aracılık eder. Dört piramidal Hücreler olduğunca az aktivite spike kısa patlamaları sonra, yerel bir mikrodevre her piramidal hücre Engellemenin form (Şekil 8c, c ve f) alır gösterdi. Ayrıca, bu inhibe edici postsinaptik potansiyeller, sekiz ya da daha fazla, piramidal hücreleri (Şekil 8E), aynı anda uyarılırlar zaman doyurulması eğilimi gösterdi.
Sistem bileşenlerinin bir genel görünüşü Şekil 9'da görülebilir. Yazılım arayüzü ve donanım are Şekil 9a ve b hem de objektif mikroskop (Şekil 9d) altında kayıt için hücrelere karşı elektrotlara yol Şekil 9c 'de gösterilen kontrol cihazı arayüzünde.
Şekil 1. Eş zamanlı olarak kaydedilir nöron sayısının bir fonksiyonu olarak bir deneyde gözlenen bağlantıların sayısının hesaplanması ikinci dereceden bir büyüme gösterir. Sayısal hesaplamaları (üst). Aynı ağının daha da nöronlar arda ilave edilir örnekleri şeması (altta).
Şekil 2. Her elektrot manipülatör (sarı) ve mikroskop (kırmızı) koordinat sistemleri.
Şekil 3,. Kaplanmış yaklaşım vektörü, hücre pozisyonları ve ölçek çubuğu ile atanan hücreye doğru yaklaşım bir pipet Ekran yakalama.
Şekil 4. Diyagram pipet basınç kontrolü için pnömatik sistem gösteren.
Şekil 5,. Patch-kelepçe deneyler sırasında kullanılan kontrolleri merkezde insan arayüz cihazı komutları.
Şekil 6,. Üç ağlar ÖrneğiTek tek deneylerin haritalanmıştır doğrudan sinaptik bağlantıları
Şekil 7. Eş zamanlı olarak birbirine bağlı olan bir önemli bir artış gösteren bir olasılık örneklenen ağı (mavi) en az bir başka nöron bağlanabilir nöronların ortak komşu etkisi. (A) Çift. (B) çok sayıda ortak komşular paylaşan nöronların çiftleri beklenenden daha sık ortaya çıkar örneklenen ağlarda tesadüfen. (c) bağlantı çifti tarafından paylaşılan ortak komşularının sayısının bir fonksiyonu olarak nöronlar artar çifti içinde olasılığı.
Şekil 8,. Martinotti Hücrelerinin işe Kantitasyonu. (a) grafiksel gösterimi. piramidal hücre (b) Supra-eşik stimülasyonu ( kırmızı) eksitatör postsinaptik potansiyeller kolaylaştırmak entegrasyonu ile Martinotti Cell (mavi) alımı yol açar. Recruited Martinotti Hücre daha sonra ikinci piramidal hücre (siyah) inhibe eder. (C) Diyagram patch-kenetlenir piramit hücreleri ve başka piramidal hücre üzerindeki etkileri artan sayıda uyarılmasını temsil eder. Bir piramidal hücre kaydedilmiş (d) ortalama inhibe edici postsinaptik potansiyeller uyarılır diğer yakın piramidal hücreleri sayısının bir fonksiyonu olarak. Berger ve ark. 2 (e) 'den uyarlanmıştır yerel devre disinaptik inhibisyon genliği 9 ya da daha fazla, piramidal hücreleri buyar zaman doyurmak eğilimiulated olasılıkla bu noktaya ulaşana içinde Martinotti hücrelerinin maksimum alımı gösterir. (f) hızlı bir şekilde alma inhibisyonu disinaptik hücre fraksiyonu, piramidal hücre sayıları uyarılır artırılması gibi 1 yükselir.
Şekil 9,. Sistemin topluluk İllüstrasyon. (A) ana penceresinde, canlı video gösterimi ile grafiksel kullanıcı arabirimi, pencere ve grafiksel temsilini oturum açın. Deneysel prosedür için kontrolleri ile (b) Mikroskop ve manipülatörler. (C) İnsan arabirim cihazı. (D) Cam Birden çok nöronlar kayıt için konumda mikropipetler.
Şekil 10. Binom Olasılıkdeneyler deneyimli kullanıcılar tarafından görsel geribildirim kullanılarak gerçekleştirilen verimi arasındaki başarıyla kullanacağım oniki elektrotları verilen hücrelerin belirli bir sayıda kayıt deneylerin kısmını açıklamak y dağılım fonksiyonları. Karşılaştırma mavi ve ideal olmayan koşullarda daha az deneyimli kullanıcılar tarafından gösterilir kırmızı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir acil soru genellikle biz anlatılan prosedürün başarı oranı ile ilgili ortaya çıkar. Yüksek başarı oranları için hazırlık esastır. Pipetler kaydedilen hücreleri canlılar için yeterli ipucu açıklıklar olmalıdır. Tıkanmış pipetler önlemek için hücre içi çözelti filtre de önemlidir. Son derece temiz, taze çekilmiş pipetler başka bir şartı vardır. Bir binom dağılımı bu konularda nihai verimini nasıl etkilediğini anlamak için kullanılabilecek basit modeldir. Bu% 80 veya görsel geribildirim ile bireysel nöronlar kayıt içinde daha fazla bir başarı oranı elde etmek için deneyim ve uygun ekipman ile bir deneyci beklemek mantıklıdır. Yeni Başlayanlar önemli hazırlık adımlar göz ardı edilir, özellikle eğer, çok daha düşük başarı oranları elde beklenebilir. Bu oranlar her deneyde kaydedilen hücrelerinin sayısında çevirmek Nasıl Şekil 10'da görülebilir. Aynı anda patch-istiridye sayısında daha fazla artışlarped nöronlar olasılıkla Manipülatörlerin minyatür ve sırayla detaylara önemli dikkat gerektiren prosedür, artan güvenilirlik gerektirir, ama tamamen mümkün bulunmaktadır olacaktır.
Burada sunulan sisteminin çok yönlülüğü hala araştırılmaktadır ve yeni uygulamaları sık sık dışı sinyallerin ve bireysel nöron aktivitesi 7 arasındaki ilişkinin araştırılması, özellikle de bulunmuştur. Anatomik düşünceler kaydedildi hücreleri artışları arasındaki mesafe olarak daha önemli hale gelir. Bağlantıları dilimleme işlemi aşağıdaki bozulmadan kalır yerde Bununla birlikte, bu sistemi kesinlikle uzun menzilli ve inter-katman bağlantısı soruşturma sağlar.
Mikromanipülatördür kontrolü
Mikromanipülatörlerle otomatik yerleştirilmesini sağlayan büyük multi-elektrot patch-kelepçe sürecini hızlandırır ve oluşumunu azaltılması güvenilirliğini artırırinsan hataları. Farklı üreticilerin manipülatörlerinden PC'den bağlantı kurmak için farklı çözümler sunar. Ortak bir seçenek, bir seri veya USB bağlantı noktası. Hızlı iletişim sağlamak amacıyla her manipülatör denetleyicisi için bir seri port adamıştır. Otomatik konumlandırma en yararlı özelliği muhtemelen doku içinde ve distorsiyon sınırlayıcı elektrot en yanal ve dikey hareketinin ortadan kaldırılmasıdır. Doku içinde elektrotların hareket eksenel yön boyunca hemen hemen tamamen yerini alır gibi, mekanik girişim en aza indirilir. Yanal hareketler bazen kan damarları ve hücreleri önlemek için sadece gereklidir.
Elektrot pozisyonları görselleştirmek
Bu deney sırasında, her bir elektrodun konumunu izlemek için edebilmek için çok yararlıdır. Bir elektrot geleneksel kurulum kaybeden görünürde hızla sorunlu hale gelebilir. Elektrot bir sayıda kullanarak zaman değilmümkün olan her zaman görüş alanı içindeki tüm elektrotları tutmak. Bir grafik gösterimi dayanarak en sezgisel alternatif ve aynı zamanda anında elektrotlar zaten onlar değil zorunda onların son konfigürasyonda yerleştirilmiş ve hangilerinin gösteren deney ilerleme takip yardımcı olur.
Video satın alma ve bindirme
Bir uygulama penceresinin üzerinde görüş mikroskop alanında canlı video görüntülemek için yeteneği çok yararlıdır. Ekran penceresi faiz (hücre somata) pozisyonları depolama yanı sıra mikroskop ve göründükleri zaman birikmiş hataları ortadan kaldırarak elektrot arasındaki göreli konumları hızlı güncellemesini sağlayan fare tıklaması yanıt programlandı. Biz de böyle bir yaklaşımın seçilen hücrelere karşı her elektrot için yörünge veya bu hücrelerin işaretlenmesi (Şekil 3) olarak canlı video pratik bilgi kaplamayı uyguladı. Kayıt of özellikleri ve bu tür anatomik atlaslarının rakamlarına gibi yardımcı görüntülerin süperpozisyon de ilgi bölgeleri hemen net olmadığı durumlarda yardımcı olmak için uygulanmıştır.
Amplifikatörler
Bilgisayar kontrollü mikroskop yükselticiler kontrol yanı sıra diğer uygulamalar yer almasına izin verebilir. Bu büyük ölçüde birden fazla hücre aynı anda kayıt ve insan hatalarının başlıca kaynağını ortadan olabilir hızını ve güvenilirliğini artırır. Bilgisayar destekli konumlandırma ve pipet basınç kontrolü takiben, bu süre içinde en çok dikkat çeken kazanımları üretir ama güvenilirlik kazanımları daha da önemli bir adımdır.
Osiloskop
Bu test sinyalleri sağlanması, uygun ölçekte gerçek zamanlı görsel ve zamansal çözünürlük büyük bir deneyci deney adımları yürütebilirsiniz hangi ile verimliliği artırır olabilir. Osiloskop seti birleştirilmesi ilebiz o zaman kritik adımlar, derhal hücre bağlı yapılandırmayı elde ettikten sonra, uygun membran potansiyelleri hücrelerini tutan az çaba ile yürütülen ve görsel sağlanmalıdır (örneğin akım veya gerilim kelepçe gibi) modları yükseltici tings. Uygun görselleştirme genlik uygun ve osiloskop ekran içinde test sinyalleri ofset osiloskobun kendi protokolünde seri port üzerinden uygun ölçeklendirme ve birleştirme komutları göndererek sağlanmıştır.
Pipet basınç kontrolü
Pozitif basınç sürekli olarak temiz cam elektrot ucunu tutmak için geçerli olduğunu sağlayan bir deney artar kullanılan elektrot sayısı, önemli bir engel teşkil noktasına daha zor hale gelir. Yeterli pozitif ve negatif basınç (mbar birkaç yüz) basit membran pompaları tarafından oluşturulmuş olabilir. Basıncı stabilize etmek amacıyla, bu pompalar yeniden birleştirildiaçma ve kapama pnömatik valf ile kontrol edilmiştir yaklaşık 100 ml'lik servoirs. Bu da vana bilgisayar kontrollü bir veri toplama kartı kullanarak edildi. Pnömatik devre şeması Şekil 4'te görülebilir. Basınç kontrolörü pipetler hücreleri dokunmatik olarak sağlanması pipet uçları daha fazla prosedürü hızlandırmak, hücre zarında gamzeler gözlem üzerine, temiz kalır ama aynı zamanda hızlı gigaohm mühürler oluşumunu sağlayan değil, sadece önemli bir rol gerçekleştirir.
Insan arabirim cihazı
Çoğu deneysel kurulumları çok geniş bir alana dağılmış deneysel ekipmanların kontrolleri var. Büyük ölçüde genellikle erken e büyük deneyler getirebilir insan hatası ortadan kaldırarak, her bir hücre kaydetmek ama en önemlisi için gerekli olan zaman ve çaba azaltmak tek bir kablosuz gamepad (Şekil 5) üzerine, en sık kullanılan kontrol konsantre edildind.
Programlama dili
Gerekli tüm ekipmanların entegrasyonu desteklenen tek dil C / C + + olduğundan biz bu uygulama için programlama dili açısından çok az seçenek vardı. C / C + + biri büyük avantajı çoklu çekirdekli işlemciler tarafından izin performans iyileştirme birden fazla işlenmesi konuları uygulamak ve tamamen kâr etmek imkanı vardır.
Elektrofizyolojik veri toplama
Biz açıklanan sistem deneyci kadar elektrofizyolojik kayıt yazılımı ve veri toplama sisteminin seçimi bırakır. Veri toplama yazılımı ve uygulama arasındaki iletişim, Exchange seri port üzerinden veya ağ üzerinden soket iletişim yoluyla gerçekleşebilir.
Gelecek perspektifler
30 yılı aşkın Sakmann ve Neher seminal deneyleri beri, yama klemp tekniği stil olduğunutek başına, özellikle, deney geniş bir yelpazede için gerekli olan sinyal çözünürlük ve örnekleme frekansı belirli bir kombinasyonu ile veri sağlayan l tek postsinaptik akımlar ya da potansiyellerinin saptanmasını içerenlerdir. Birçok nöron kaydedilmesini sağlayan bir bilgisayar destekli bir sistem geliştirerek aynı anda biz yama kelepçe tekniği deneysel olanakları genişletmeyi amaçladık. Deneysel nörobilim 8-13 son gelişmeler ile bu tür yeni olanaklar kombinasyonu görülmemiş hız ve detaylar nöronal devrelerin daha derin bir anlayış doğru yol açabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz yama kelepçe prosedür otomasyonu için iyileştirmeler değerli tavsiyeler Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca GAMBAZZI ve Sonia Garcia teşekkür etmek istiyorum. Biz değerli tavsiye ve yazılım uygulama ile yardım için Rajnish Ranjan teşekkür ederim. Bu çalışma, AB Synapse proje ve kısmen İnsan Frontiers Bilim Programı tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
References
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
- Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
- Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
- Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
- Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
- Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
- Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).
