Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

A-متعدد القطب نظام التصحيح، المشبك بمساعدة الحاسوب

Published: October 18, 2013 doi: 10.3791/50630

Summary

متعدد القطب التسجيلات التصحيح، المشبك يشكل مهمة معقدة. نحن هنا تظهر كيف، من خلال أتمتة العديد من الخطوات التجريبية، فمن الممكن لتسريع عملية تؤدي إلى تحسن نوعي في الأداء وعدد من التسجيلات.

Abstract

تقنية التصحيح، المشبك هو اليوم الأسلوب الأكثر راسخة لتسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية الفردية أو المقصورات الخاصة التحت خلوية. ومع ذلك، فإن تحقيق التسجيلات مستقرة، حتى من الخلايا الفردية، يبقى إجراء تستغرق وقتا طويلا من التعقيد. أتمتة العديد من الخطوات بالتزامن مع عرض المعلومات فعالة يمكن أن تساعد إلى حد كبير التجريبيون في أداء عدد أكبر من التسجيلات مع زيادة الموثوقية وفي وقت أقل. من أجل تحقيق التسجيلات على نطاق واسع استنتجنا النهج الأكثر فعالية هو عدم تلقائية تماما ولكن عملية لتبسيط الخطوات التجريبية وتقليل فرص الخطأ البشري في حين تتضمن بكفاءة تجربة المجرب وردود الفعل البصري. مع هذه الأهداف في الاعتبار وضعنا نظام بمساعدة الحاسوب الذي يركز كل الضوابط اللازمة لمتعدد القطب تجربة التصحيح، المشبك في واجهة واحدة، والمبادلات التجارغمبد اللاسلكية المتوفرة ially، أثناء عرض المعلومات والإرشادات المتعلقة العظة التجربة على شاشة الكمبيوتر. نحن هنا تصف المكونات المختلفة للنظام الذي سمح لنا لتقليل الوقت المطلوب لتحقيق تكوين تسجيل وبشكل كبير زيادة فرص تسجيل أعداد كبيرة من الخلايا العصبية في وقت واحد بنجاح.

Introduction

القدرة على تسجيل وتنشيط مواقع متعددة مع الدقة ميكرومتر مفيد للغاية لتحقيق تجريبيا على فهم أفضل للنظم العصبية. وقد تم تطوير العديد من التقنيات لتحقيق هذه الغاية ولكن لا شيء يسمح القرار submillivolt تحقيقه عن طريق تقنية التصحيح، المشبك، من الضروري لدراسة النشاط دون العتبي والإمكانات الفردية بعد المشبكي. نحن هنا تغطية تطوير نظام التصحيح، المشبك بمساعدة الحاسوب اثني عشر القطب تهدف إلى تسجيل في وقت واحد وتحفيز عدد كبير من الخلايا الفردية بدقة كافية لدراسة الربط العصبية. بينما العديد من التطبيقات الأخرى يمكن تصورها لمثل هذا النظام، فإنه يفسح المجال بشكل خاص لدراسة الربط متشابك بالنظر إلى أن عدد الاتصالات الممكنة ضمن مجموعة من الخلايا العصبية تنمو بشكل متناسب مع مربع عدد الخلايا العصبية في السؤال. لذلك، في حين أن نظام مع ثلاثة أقطاب يسمح اختبارحدوث ما يصل الى ستة اتصالات وغالبا ما يسجل واحدة واحدة، وتسجيل اثني عشر الخلايا العصبية يسمح اختبار حدوث ما يصل الى 132 الاتصالات ومراقبة كثير من الأحيان أكثر من اثني عشر (الشكل 1). مراقبة العشرات من الاتصالات في وقت واحد يجعل من الممكن لتحليل تنظيم الشبكات الصغيرة واستنتاج الخصائص الإحصائية للبنية الشبكة التي لا يمكن بحثها إلا 1. وعلاوة على ذلك، والتحفيز الدقيق للخلايا عديدة كما يسمح الكمي للتجنيد الخلايا بعد المشبكي 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير المعدات

  1. المتلاعبين التحكم من جهاز كمبيوتر
    1. ربط كل مربع تحكم مياداة مجهرية إلى الكمبيوتر من خلال المنافذ التسلسلية (RS-232).
    2. تنفيذ الأوامر لتحديد المواقع، والاستعلام عن ضبط إعدادات ليتم إرسالها عبر المنفذ التسلسلي. السرعة والتوافق الأجهزة القضايا نظرا ينصح C / C + + كلغة البرمجة.
    3. توحيد النظام المرجعي من المتلاعبين بحيث الصفر هو أقرب موقف ممكن فيما يتعلق المحركات ويتم توجيه حركة إيجابية بعيدا عن المحركات.
    4. وضع المجهر في موقعها المركزي 2 مم فوق العينة البؤري (الإحداثيات [0، 0، 2000]).
    5. متجر، لكل مناور، الإحداثيات المحلية التي تسمح غيض من ماصة التي يتعين مراعاتها في مركز مجال الرؤية من المجهر. هذه هي النقطة المرجعية الأولي لكل القطب.
  2. Visuaمواقف القطب ليز. ومن المفيد جدا أن تكون قادرة على تتبع موقف كل قطب كهربائي أثناء التجربة. تمثيل رسومي هي الطريقة الأكثر بديهية لتحقيق هذا. تحقيقا لهذه الغاية يجب أن تكون مطابقة النظم المرجعية من كل قطب كهربائي وذلك من المجهر. وهناك طريقة بسيطة لتحقيق ذلك هو:
    1. جلب غيض من القطب إلى مركز مجال الرؤية.
    2. تخزين موقف على كل محور من مناور ولكل محور المجهر.
    3. تنفيذ مع محور س للمناور حركة كبيرة نسبيا (1 مم).
    4. تحديد موقع الطرف مرة أخرى تتحرك فقط المجهر.
    5. حساب الفرق في موقف المجهر منذ تم قياس ذلك الماضي. هذه هي التوقعات لحركة محور القطب على محاور المجهر.
    6. كرر الخطوات من 2،3-2،5 لY و Z محاور مناور القطب. وهذا يسمح مصفوفة من التوقعات على المجهر محاور يتم تحديدها (<قوي> الشكل 2) وتسمى أيضا مصفوفة جيب التمام:
      المعادلة 1
    7. عكس هذه المصفوفة لتجعل من الممكن لحساب الحركات، في ثلاثة أبعاد، التي تتطلبها مناور الكهربائي للوصول إلى موقف معين في المجهر نظام الإحداثيات:
      المعادلة 2
    8. باستخدام النقطة المرجعية الأولي وجيب التمام مصفوفة تحديد موقف من كل قطب كهربائي في المجهر إحداثيات.
    9. عرض بيانيا، استنادا إلى إحداثيات المجهر، موقف كل الكهربائي على فترات منتظمة. اخترنا لاستخدام C / C + + مكتبات الرسم (GDI +) لرسم المواقف القطب كل 40 ميللي ثانية.
    10. كرر الخطوات من 1.2.1 - 1.2.7 كل مرة يتم تغيير زوايا مناور أو إذا كانت هناك حاجة تغير موقف من عدة مليمترات، على سبيل المثال، عندما يتم تغيير نوع القطب.
  3. تمكين تخزين positioنانوثانية من الميزات ذات الصلة في الأنسجة، مثل الخلايا أو النقاط المرجعية التشريحية، في إحداثيات المجهر.
  4. الحصول على الفيديو وتراكب المعلومات ذات الصلة.
    1. ميكانيكيا محاذاة محور س من حركة المجهر مع المحور الأفقي للكاميرا المجهر.
    2. تثبيت على جهاز الكمبيوتر الى framegrabber مع لقطات فيديو حية والقدرة تراكب وعدة تطوير البرمجيات (SDK).
    3. تنفيذ عملية عرض الفيديو الحية مع SDK.
    4. تحويل المجهر تنسيق النظام إلى نظام مرجعي الكاميرا عن طريق الترجمة والتحجيم المناسب.
    5. رسم ملامح ذات الصلة في الإحداثيات الكاميرا وتراكب على لقطات فيديو حية الصورة الناتجة على فترات منتظمة خلال حوالي 40 ميللي ثانية (الشكل 3).
  5. مكبرات صوت السيطرة.
    1. استخدام البرنامج مكبر للصوت للسيطرة على إعدادات مكبر للصوت من واجهة.
  6. شاركntrol الذبذبات.
    1. توصيل الذبذبات إلى جهاز الكمبيوتر باستخدام المنافذ التسلسلية.
    2. تحديد نطاق الذبذبات، واقتران والقرار الزماني للخطوات مختلفة لإجراء التصحيح، المشبك في الجهد المشبك (مثل القطب في الحمام، وتشكيل الختم، وتكوين خلية كاملة) والمشبك الحالي.
    3. إرسال الأوامر المناسبة الإعداد الذبذبات كلما تصدر الأوامر مكبر للصوت من واجهة.
  7. السيطرة ماصة الضغط.
    1. تجميع نظام مراقبة ضغط وفقا لشكل 4.
      1. استخدام 12 V / 5 V امدادات الطاقة لتزويد كل مكونات إلكترونية بشكل مناسب.
      2. وصل الناتج من مضخة واحدة الغشاء إلى المخزن المؤقت الضغط الايجابي (وعاء مل 100).
      3. ربط مدخلات واحدة مضخة الغشاء إلى المخزن المؤقت الضغط السلبي (حاوية مل 100).
      4. توصيل أنابيب حامل ماصة لاستشعار الضغط في pressuإعادة نظام التحكم وصمام هوائي الذي يصل إلى حجرة الضغط الرئيسية.
      5. ربط كل من المخازن المؤقتة إلى الضغط صمام متصلا حجرة الضغط الرئيسية.
      6. ربط صمام بين المقصورة الرئيسية وضغط الغلاف الجوي.
      7. ربط جهاز استشعار الضغط على حجرة الضغط الرئيسية.
      8. ربط جهاز استشعار الضغط على كل العازلة.
      9. ربط نظام مراقبة ضغط إلى لوحة الحصول على البيانات.
      10. ربط كل جهاز استشعار الضغط لإدخال واحد التناظرية.
      11. ربط كل صمام إلى الإخراج الرقمي.
    2. إزالة الضغط الجوي الإزاحة من جميع أجهزة الاستشعار عن طريق فتح كل صمامات باستثناء تلك التي تربط لمضخات الغشاء وطرح الضغط قياسها.
    3. تنفيذ السيطرة على ضغط
      1. تعريف في واجهة تحكم لتنشيط أو تفعيل اجتثاث السيطرة على ضغط إيجابي لكل ماصة.
      2. تحديد الحد الأدنى لضغط إيجابي ماصةق من حوالي 70 م بار.
      3. دوري (كل 0.5 ثانية) كشف كلما يسقط الضغط في ماصات تحت السيطرة على ضغط نشطة تحت عتبة محددة.
      4. على عتبة فتح معبر المخزن المؤقت الضغط الايجابي لحجرة الضغط الرئيسية وهذه المقصورة نحو ماصة في سؤال خلال فترات وجيزة (20 ميللي ثانية) حتى الضغط في ماصات فوق العتبة. إغلاق كافة الصمامات الأخرى.
      5. دي تفعيل مزيد من السيطرة على ضغط كما هو بدأ الاقتراب النهائي نحو خلية من الفائدة.
    4. تطبيق الضغط السلبي لتشكيل الختم
      1. إغلاق كافة الصمامات وفتح صمام السلبية العازلة الضغط نحو المقصورة الرئيسية وضغط هذه المقصورة نحو ماصة في السؤال لمدة يتطلب المجرب عن طريق الحفاظ على ضغط زر.
  8. مركزة الأوامر إلى جهاز واجهة الإنسان.
    1. توصيل wirele المتاحة تجارياق ق غمبد إلى جهاز الكمبيوتر.
    2. تنفيذ قراءات من وضع عصا التحكم. على سبيل المثال، استخدام المكتبات دايركت لC / C + + لأداء قراءات كل 5 ميللي ثانية.
    3. مقارنة الوضع الحالي مع الوضع السابق للكشف الذي تم الضغط على الأزرار، أو صدر أبقى الضغط منذ الخطوة في المرة السابقة.
    4. تخصيص وظائف لكل زر في غمبد. ويرد مثال على هذا التعيين في الشكل 5.

2. إجراءات التصحيح، المشبك

  1. إعداد شرائح الدماغ في المنطقة من الفائدة.
  2. وضع شريحة الدماغ من الفائدة، مع المنطقة من اهتمام في وسط نطاق النزوح المجهر.
  3. اختيار الخلية
    1. تحديد الخلايا من الفائدة من خلال التصفح مع المجهر. تخزين الموقف من الخلايا استنادا المجهر تنسيق النظام مع حق الماوس الأيمن فوق على الشاشة لقطات فيديو حية على رأس خلية من الفائدة. فإن واجهة رسومية عرض الخلايا المحددة فضلا عن بال micropipettes لمحة والبرمجيات العالمية ستضيف علامة على موقف الخلية التي سيتم مضافين على الصور. بالإضافة إلى ذلك يتم التقاط صورة للخلية للرجوع إليها مستقبلا في ملف 'خلية #. JPG.
  4. إسناد الخلايا لماصات
    1. بعد تحديد الخلايا من الفائدة، تعيين ماصة التي سوف يسجل كل خلية. يوفر واجهة رسومية ضوابط التعيين التي يجب أن يتم تعيين. تصور معاينة التكوين النهائي عن طريق تحديد خانة الاختيار "إظهار المواقف النهائية.
    2. حدد كل ماصة الذي هو المطلوب معاينة الموقف النهائي أو تحقق من 'تحديد الكل' مربع. تعطيل عرض الوضع الحالي لتحسين التصور إذا لزم الأمر.
  5. إعداد الماصات
    1. ملء الماصات (6-8 MΩ وعادة ما تكون أفضل إذا تم استخدام العديد من الماصات) وايال حل داخل الخلايا وتحميلها على أصحابها. وضع headstages في التثبيتات ولكن لا تنزلق إلى الأمام لتجنب لمس حمام مع طرف ماصة.
    2. تمكين السيطرة على ضغط إيجابي وحدد كل ماصات للتأكد من أن النصائح سوف تبقى نظيفة. الشريحة بلطف كل headstage في المكان.
  6. تحديد موقع نصائح ماصة
    1. وضع المجهر لمكانة مركزية مع التركيز 3 مم فوق شريحة عن طريق الضغط على زر R2 حين عقد زر 'A'. استخدام موقف المقابلة لكل مناور كما المخزنة من التجربة السابقة عن طريق الضغط على زر L2 أثناء الضغط على زر A.
      ملاحظة: عند هذه النقطة يجب أن يكون هناك إما الظل مميزة من ماصة في رأي أو حركة صغيرة على طول محور ماصة ينبغي أن تكون كافية لنلاحظ أنه في معظم الحالات. تعويض عن الاختلافات الطفيفة في شكل ماصة لابد من القيام بها يدويا.
    2. جلب غيض ماصة في التركيز. وضع طرف على النقطة المركزية الأحمر من عرض الفيديو دون تحريك المجهر (يجب أن يكون لا يزال في موقف [0، 0، 2000]).
    3. إبلاغ البرامج التي ماصة هو في مركز الشاشة عن طريق الضغط على زر Z في حين عقد زر C. بعد يقع كل طرف ماصة، وإرسال ذلك ماصة الوراء بحيث التالية واحدة يمكن أن يكون موجودا عن طريق الضغط على زر L1 في حين عقد الزر A.
  7. تقترب من الخلايا
    1. مرة واحدة كل نصائح ماصة وقد تقع بالضبط وينسب كل ماصة للخلية، ضع تلقائيا ماصات على مقربة من الخلايا كل منها. ببساطة انقر بزر الماوس الأيمن في وسط مجموعة من الخلايا وحدد الخيار 'الكتلة' في القائمة المنبثقة. على نافذة خيارات الكتلة التي ستظهر، حدد كافة ماصات الذي تريد وضع في هذا الوقت وانقر على "الذهاب مع جميع ماصات فحص '. كرر هذه العملية لكل مجموعة من الخلايا في المصالح.
    2. المؤسسة العامةrform النهج النهائي يدويا. موقف ماصات نسبة إلى الخلايا يمكن تحديد مختلف ولكن عادة هو ببساطة 200 ميكرون بعيدا عن الخلية في محور ماصة و 200 ميكرومتر فوقه في الاتجاه العمودي، وهو ما يكفي للحفاظ على غيض ماصة خارج النسيج . الانتظار حتى يتم الانتهاء من تحديد المواقع من الماصات ونقل المجهر نحو ماصة عن طريق الضغط على زر R1 أثناء الضغط على زر C.
    3. إعادة تقويم كل موقف ماصة من خلال التركيز المجهر على طرفها في أي مكان في عرض الفيديو والضغط على زر B في حين عقد زر C. A شبكة مربعة يجب أن يظهر لفترة وجيزة مما يدل على موقف تحديدها من ماصة. إذا كان الموقف غير صحيح، ضع طرف على النقطة المركزية لعرض الفيديو واضغط على زر Z في حين عقد زر C.
  8. إنشاء تكوين الخلية المرفقة
    1. تؤكد أن الخلية التي تهم ماصة الحالي هو صحيحملحوظ. خلاف ذلك نقل المجهر لتتناسب مع خلية في المصالح مع النقطة الحمراء المركزية. علامة الخلية عن طريق الضغط على زر Y في حين عقد زر زر L2 الصحافة C. حين عقد زر C لوضع ماصة 200 ميكرون بعيدا عن الخلية المسندة إليه، فإن المجهر الانتقال تلقائيا إلى موقف المقابلة.
    2. ضبط الموقف ماصة بحيث يطابق نقطة حمراء. ضبط ماصة تعويض عن طريق الضغط على زر R1 أثناء الضغط على زر X.
    3. تفعيل نبض الاختبار عن طريق الضغط على زر L1 في حين عقد الزر X. نقترب ببطء ماصة للخلية التي تعزى.
    4. على مراقبة تشكيل الدمل على سطح غشاء الخلية تطبيق نبضة قصيرة من الضغط السلبي عن طريق الضغط على زر Y في حين عقد زر Z للسماح الضغوط التي مورست لتصل إلى الخلية. يجب إنشاء المحتمل عقد حوالي 65mV في هذه المرحلة عن طريق الضغط على زر L2 حين عقد الزر X.
  9. تكوين خلية كاملة
    1. مرة واحدة يتم تشكيل جيجا ختم لكل خلية، تبدأ تمزق الأغشية عن طريق تطبيق الضغط السلبي.
  10. أداء التسجيلات
    1. استخدام نظام التحفيز / الاستحواذ على أداء التسجيلات الخاصة بك. تطبيق البقول أو القطارات من البقول على خلية فرد واحد في وقت ومراقبة الردود على الخلايا المتبقية إلى خريطة الربط بين الخلايا المسجلة.
  11. تنحسر ماصات
    1. حالما يتم الانتهاء من التسجيلات، تنحسر ببطء ماصات من الأنسجة بالنقر بزر الماوس الأيمن على الجدول الراديوية زر. اختر 'تنحسر-> الماصات 500 ميكرون' أن يكون ماصات تنحسر مسافة قصيرة على طول محاورها. مراقبة الانجراف في المحتملة للخلايا (تطهير نصائح من خلال تطبيق بعض الضغوط الإيجابية قد تساعد).
    2. في الانحسار ماصات كل في طريق العودة، تعيين سرعة تحديد المواقع ل'سريعة' وكرر نفس العملية ولكن اختيار "الكل" الخيار. إزالة المستخدمةالماصات عن طريق تحريك بلطف خارج headstages وفك ماصات من أصحاب. ومن المفيد لتجنب التواء في أصحاب قواعدها لأن هذا قد تتداخل بشكل كبير مع الموقف ماصة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وفقا للأساليب المذكورة أعلاه نجحنا في أداء تسجيل خلية كاملة لمدة تصل إلى اثني عشر الخلايا العصبية في وقت واحد، ومضاعفة تقريبا على أكبر عدد من الخلايا العصبية في وقت واحد حتى الآن، فرضت التصحيح. وترد أمثلة على شبكات الاتصالات متشابك مباشرة بين الخلايا العصبية الهرمية سجلت في طبقة الخامس من القشرة الحسية الجسدية من الفئران في الشكل 6.

تحديد ملامح احتمال اتصال بوصفها وظيفة من المسافة بين جسدية لإعطاء الخلية من نوع هو قياس نموذجية من الفائدة التي يمكن أن يؤديها بكفاءة مع نظام متعدد القطب التصحيح، المشبك 1. في الآونة الأخيرة بدأت الصورة التحفيز لتبدو وكأنها أكثر كفاءة وسيلة للحصول على مثل هذه البيانات 3،4. الأهم من ذلك، ومع ذلك، فإن البيانات التي حصل عليها مع أنظمة التصحيح، المشبك متعدد القطب يسمح المجربون للحصول على خرائط أكثر اكتمالا من الشبكة قيد الدراسة وكذلك عالية الدقة مع تلطيخ البينيةتنتشر الخلوية الأصباغ. في متعدد القطب تجارب التصحيح، المشبك يمكن تسجيل كل خلية وحفز، والتي غالبا ما تكون غير الحال مع غيرها من التقنيات مثل الصورة التحفيز أو التصوير الكالسيوم. هذه الميزة تسمح المجربون لتتبع التحيزات في الاتصال، مثل ارتفاع معدلات اتصالات متبادلة، والتي لا يمكن قياسها على خلاف ذلك. من خلال تحفيز الخلايا العصبية وتسجيل كل درس أظهرنا أن الخلايا العصبية ليست فقط انحيازا أن يكون متصلا بشكل متبادل ولكن أيضا تشكيل مجموعات. يسمح حجم التسجيلات دينا لنا أيضا أن نلاحظ أن احتمال وجود صلة بين ارتفاع أزواج من الخلايا العصبية التي تتقاسم الدول المجاورة المشتركة، أي كان كلا متصلا في وقت واحد إلى الخلايا العصبية الفردية الأخرى في الشبكة عينات (الشكل 7A). كان هذه الملاحظة الهامة في كل من intersomatic بن مسافة 50 ملم (50-250 ملم). لاحظنا أيضا أزواج من الخلايا العصبية تقاسم العديد من الجيران وقعت أكثر شيوعا بكثير منعشرة مما كان متوقعا عن طريق الصدفة (الشكل 7B). وعلاوة على ذلك، اكتشفنا لها تأثير على احتمال اتصال وفقا لعدد من الدول المجاورة المشتركة بين زوج معين من الخلايا العصبية. الجيران الأكثر شيوعا تشترك معها والأرجح زوج من الخلايا العصبية هو أن تكون مترابطة (الشكل 7C).

هذا الاتجاه يؤدي إلى تشكيل مجموعات من الخلايا العصبية التي هي مترابطة أكثر كثافة من المتوسط. ومن المثير للاهتمام، ومجموعات مترابطة للغاية من الخلايا العصبية أظهرت ليس فقط أكثر عددا وصلات ولكن أيضا، في المتوسط، أقوى منها 1. أدت هذه النتائج بنا إلى استنتاج مفاده أن الدوائر القشرة المخية الحديثة وتنظم ليس فقط في طبقات والأعمدة ولكن أيضا في المجالس الخلية، وهي مجموعات من الخلايا العصبية تقاسم كثيفة وقوية الترابط متشابك كما افترض من قبل دونالد هب منذ عدة عقود.

النتائج الأخرى من الفائدة التي يمكن أن تتحقق مع عدة في وقت واحد التصحيح فرضت نوتشمل eurons الكمي لتوظيف تثبيط حسب النشاط فوق عتبة في أعداد مختلفة من الخلايا مثير 2. يتم بوساطة نموذج في كل مكان من تثبيط في القشرة المخية الحديثة 5 من قبل خلايا مارتينوتي (الأرقام 8A وب، ​​مقتبسة من بيرغر وآخرون.) التي تتلقى مدخلات من الخلايا الهرمية ودمجها بدورها تؤثر، مع بعض الكمون، والخلايا الهرمية الأخرى. أظهرنا أنه بعد رشقات نارية قصيرة من النشاط ارتفاعه في عدد قليل من الخلايا الهرمية إلى أربعة، في كل خلية الهرمية في المتناهيه الصغر المحلية يتلقى هذا النوع من التثبيط (أرقام 8C، ج، و). أظهرنا أيضا أن هذه الإمكانيات بعد المشبكي المثبط تميل إلى تشبع عندما يتم تحفيز ثمانية أو أكثر الخلايا الهرمية في وقت واحد (الشكل 8E).

يمكن أن ينظر إليه نظرة عامة على مكونات النظام في الشكل 9. واجهة وبرامج الأجهزة ع ه هو مبين في الشكل 9A وب فضلا عن واجهة تحكم في الشكل 9C توجيه الأقطاب نحو الخلايا لتسجيل الهدف تحت المجهر (الشكل 9D).

الشكل 1
الشكل 1. يظهر حساب عدد الاتصالات التي لوحظت في تجربة بوصفها وظيفة من عدد الخلايا العصبية في وقت واحد سجلت نموا من الدرجة الثانية. الحسابات العددية (أعلى). مخطط توضيحي حيث يتم إضافة المزيد من الخلايا العصبية من نفس الشبكة على التوالي (أسفل).

الرقم 2
الشكل 2. تنسيق نظم كل مناور القطب (الصفراء) والمجهر (الحمراء).

ithin صفحة = "دائما"> الرقم 3
الرقم 3. القبض على الشاشة من ماصة في النهج تجاه تعيين الخلية مع ناقلات نهج متراكبة، مواقف الخلية وشريط مقياس.

الرقم 4
الشكل 4. بياني يوضح نظام هوائي للسيطرة على ضغط ماصة.

الرقم 5
الرقم 5. أوامر على واجهة الجهاز البشري الذي يمركز الضوابط المستخدمة خلال التجارب التصحيح، المشبك.

الرقم 6
الرقم 6. مثال على ثلاث شبكاتاتصالات متشابك المباشر معين في التجارب الفردية

الرقم 7
الرقم 7. تأثير الجار المشتركة (أ) أزواج من الخلايا العصبية التي تربط في وقت واحد إلى واحد على الأقل الخلايا العصبية الأخرى في الشبكة عينات (الأزرق) يحمل احتمال زيادة كبيرة من يجري مترابطة. (ب) أزواج من الخلايا العصبية تقاسم الجيران متعددة شيوعا يحدث في كثير من الأحيان مما كان متوقعا عن طريق الصدفة في شبكات العينة. (ج) احتمال اتصال ضمن أزواج من الخلايا العصبية الزيادات بوصفها وظيفة من عدد من الدول المجاورة المشتركة بين الزوج.

الرقم 8
الرقم 8. الكمي للتجنيد خلايا مارتينوتي. (أ) التمثيل البياني للخلية الهرمية (الحمراء) التي تشكل نقاط الاشتباك العصبي على خلية مارتينوتي (الأزرق) الذي بدوره في أشكال المشابك على خلية الهرمية الثانية (السوداء). (ب) تحفيز سوبرا عتبة الخلية الهرمية ( الحمراء) يؤدي إلى تجنيد خلية مارتينوتي (الأزرق) من خلال دمج تسهيل إمكانات بعد المشبكي مثير. ومارتينوتي الخليوي المعينين ثم يمنع خلية الهرمية الثانية (السوداء). (ج) مخطط يمثل تحفيز أعداد متزايدة من-فرضت التصحيح الخلايا الهرمية والآثار على خلية أخرى الهرمية. (د) متوسط ​​إمكانات بعد المشبكي المثبط المسجلة من خلية الهرمية بوصفها وظيفة من عدد الخلايا الهرمية الأخرى القريبة التي يتم تحفيز. مقتبس من بيرغر وآخرون. 2 (ه) من السعة تثبيط ثنائي التشابك في الدائرة المحلية تميل إلى تشبع عند 9 أو أكثر الخلايا الهرمية هي STIMخاضعة للتنظيم مشيرا التوظيف القصوى من الخلايا في مارتينوتي ربما تم التوصل إليها في هذه النقطة. (و) جزء من الخلايا المستقبلة تثبيط ثنائي التشابك بسرعة يرتفع إلى 1 نظرا لتزايد أعداد الخلايا الهرمية يتم تحفيز.

الرقم 9
الرقم 9. التوضيح من الفرقة للنظام. (أ) واجهة المستخدم الرسومية مع الإطار الرئيسي، وعرض لقطات فيديو حية، ونافذة وتمثيل رسومي تسجيل (ب) المجهر والمتلاعبين. (ج) الإنسان واجهة الجهاز مع وجود ضوابط لإجراء التجارب. (د) الزجاج بال micropipettes في مراكز للتسجيل الخلايا العصبية متعددة.

الرقم 10
الرقم 10. probabilit ذي الحدينيتم عرض وظائف التوزيع ذ التي تصف جزء من التجارب التي تسجل بنجاح عدد معين من الخلايا نظرا لاستخدام اثني عشر الأقطاب. مقارنة بين العائد من تنفيذ التجارب باستخدام ملاحظات مرئية من قبل المستخدمين ذوي الخبرة في الزرقاء وبنسبة أقل للمستخدمين ذوي الخبرة في ظروف غير مثالية باللون الأحمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

سؤال يطرح نفسه على الفور عادة بشأن معدل نجاح العملية وصفنا. بالنسبة لمعدلات نجاح عالية إعداد أمر ضروري. يجب أن يكون ماصات الفتحات التي هي غيض كافية لخلايا الكائنات المسجلة. تصفية الحل داخل الخلايا لتجنب انسداد ماصات مهم أيضا. نظيفة للغاية الماصات، وسحبت حديثا هي شرط آخر. A توزيع ذي الحدين هو أبسط نموذج التي يمكن استخدامها لفهم كيف تؤثر هذه القضايا العائد النهائي. فمن المعقول أن نتوقع مجرب من ذوي الخبرة والمعدات المناسبة لتحقيق نسبة نجاح 80٪ أو أكثر في تسجيل الخلايا العصبية الفردية مع ردود الفعل البصري. ويمكن توقع تحقيق معدلات نجاح أقل بكثير مبتدئين، وخاصة إذا تم التغاضي عن الخطوات إعداد الهامة. كيف يترجم هذه المعدلات في أعداد الخلايا سجلت في التجربة يمكن أن ينظر إليه في الشكل 10. زيادات أخرى في عدد من التصحيح في وقت واحد، البطلينوسمن المرجح أن تتطلب الخلايا العصبية PED التصغير من المتلاعبين وزيادة موثوقية الإجراء، الأمر الذي يتطلب بدوره اهتماما كبيرا بالتفاصيل، ولكن هي مجدية تماما.

لا يزال يجري استكشاف براعة النظام المعروضة هنا وكثيرا ما وجدت تطبيقات جديدة، ولا سيما في مجال استكشاف العلاقة بين إشارات خارج الخلية ونشاط الخلايا العصبية الفردية 7. تصبح الاعتبارات التشريحية أكثر أهمية والمسافة بين الخلايا الزيادات المسجلة. ومع ذلك، فإن هذا النظام يسمح بالتأكيد التحقيق في المدى الطويل والربط بين طبقة أينما تبقى اتصالات سليمة بعد إجراء تشريح.

السيطرة مياداة مجهرية

تمكين تحديد المواقع التلقائي مع micromanipulators يسرع كثيرا من عملية متعددة القطب التصحيح، المشبك، ويزيد من موثوقيتها والحد من حدوثالأخطاء البشرية. مختلف الصانعين تقديم حلول مختلفة من أجل تأسيس اتصال من الكمبيوتر إلى المتلاعبين. وثمة خيار شيوعا هو تسلسلي أو منفذ USB. من أجل ضمان التواصل السريع كرسنا منفذ تسلسلي إلى كل وحدة تحكم مناور. ميزة مفيدة للغاية من المواقع التلقائي وربما القضاء على معظم الحركة الجانبية والرأسية من الأقطاب الكهربائية داخل الأنسجة والحد من تشويه لها. كما حركة الأقطاب داخل الأنسجة يحدث بشكل حصري تقريبا على طول اتجاه محوري، يتم التقليل من التدخل الميكانيكية. الحركات الجانبية ضرورية فقط لتجنب بعض الأحيان الدم والأوعية الخلايا.

تصور مواقف الكهربائي

ومن المفيد جدا أن تكون قادرة على تتبع موقف كل قطب كهربائي أثناء التجربة. في الإعداد إغفال التقليدية للإلكترود يمكن أن تصبح بسرعة مشكلة. عند استخدام عدد كبير من أقطاب أنه ليسممكن للحفاظ على جميع الأقطاب داخل مجال الرؤية في جميع الأوقات. الاعتماد على التمثيل البياني هو البديل الأكثر بديهية وتساعد في تتبع التقدم المحرز في التجربة، والتي تبين على الفور والتي تم بالفعل وضع الأقطاب الكهربائية في شكلها النهائي وتلك التي لم أيضا.

اقتناء الفيديو وتراكب

القدرة على عرض لقطات فيديو حية من الميدان المجهر نظر على نافذة التطبيق مفيد جدا. كان مبرمجا في نافذة العرض للرد على نقرات الماوس تمكين التخزين من المناصب في المصالح (somata الخلية) وكذلك تحديث سريع لمواقف النسبية بين المجهر والأقطاب إزالة الأخطاء المتراكمة كلما ظهورها. كما نفذنا تراكب المعلومات العملية بشأن لقطات فيديو حية مثل مسار النهج لكل القطب نحو الخلايا المختارة أو وضع علامات على هذه الخلايا (الشكل 3). تسجيل ستم تنفيذ ميزات و وتراكب الصور المساعدة مثل الأرقام من الأطالس التشريحية أيضا لمساعدة حيث المناطق ذات الاهتمام ليست واضحة على الفور.

مكبرات الصوت

الكمبيوتر التي تسيطر عليها المجهر مكبرات الصوت قد تسمح بالتحكم في الفترة من التطبيقات الأخرى كذلك. هذا يزيد بشكل كبير من السرعة والموثوقية التي يمكن تسجيلها خلايا متعددة في وقت واحد ويزيل مصدرا رئيسيا للأخطاء البشرية. المواقع التالية والضغط ماصة السيطرة بمساعدة الحاسوب هذه هي الخطوة التي تنتج مكاسب أكثر ما يلفت الانتباه في الوقت المناسب ولكن المكاسب في الموثوقية، بل هي أكثر أهمية.

الذبذبات

ضمان أن إشارات الاختبار يمكن تصور في الوقت الحقيقي على المستوى المناسب والقرار الزماني يعزز إلى حد كبير من الكفاءة التي مجرب يمكن تنفيذ الخطوات التجريبية. وذلك بربط مجموعة الذبذباتالرنين إلى مكبر للصوت وسائط (مثل المشبك الحالية أو الجهد) نحن ضمنت أعدم أن الخطوات ذات الأهمية الزمنية وتصور مع القليل من الجهد مثل زنزانات في إمكانات غشاء المناسب مباشرة بعد تحقيق تكوين الخلية المرفقة. وقد ضمنت التصور السليم عن طريق إرسال الأوامر التحجيم واقتران المناسبة من خلال المنفذ التسلسلي في بروتوكول الذبذبات الخاصة لتتناسب مع السعة وإزاحة إشارات الاختبار داخل الشاشة الذبذبات.

السيطرة على ضغط ماصة

حيث وصل عدد من الأقطاب الكهربائية المستخدمة في التجربة الزيادات، وضمان أن يتم تطبيق الضغط الايجابي بشكل دائم للحفاظ على غيض من أقطاب الزجاج نظيفة يصبح أكثر تطلبا لجهة تشكل عائقا مهما. يمكن أن تتولد الضغوط الإيجابية والسلبية كافية (بضعة مئات من م بار) بواسطة مضخات غشاء بسيط. من أجل تحقيق الاستقرار في الضغط، واقترنت هذه المضخات لإعادةservoirs حوالي 100 مل الذين الافتتاح والختام كان يسيطر عليها صمامات تعمل بالهواء المضغوط. كانت الصمامات بدوره باستخدام بطاقة الحصول على البيانات الكمبيوتر التي تسيطر عليها. يمكن أن ينظر إلى الرسم التخطيطي للدارة الهوائية في الشكل 4. وحدة تحكم الضغط يؤدي دورا هاما ليس فقط ضمان نصائح ماصة تبقى نظيفة ولكن أيضا السماح بتشكيل الأختام Gigaohm بسرعة، على مراقبة الدمامل على غشاء الخلية كما ماصات لمس الخلايا، وكذلك تسريع الإجراء.

واجهة الجهاز البشري

معظم الاجهزة التجريبية لديهم ضوابط المعدات التجريبية فرقت على نطاق واسع على مساحة واسعة. ركزنا الضوابط الأكثر استخداما على غمبد اللاسلكية واحد (الشكل 5) الحد بشكل كبير من الوقت والجهد اللازمين لتسجيل كل خلية ولكن الأهم من ذلك، والقضاء على مصادر الخطأ البشري الذي يمكن وغالبا ما تجلب تجارب كبيرة إلى البريد سابق لأوانهالثانية.

لغة البرمجة

كان لدينا خيار سوى القليل جدا من حيث لغة البرمجة لهذا التطبيق منذ اللغة الوحيدة التي تدعم تكامل جميع المعدات اللازمة وC / C + +. واحدة ميزة كبيرة من C / C + + هو إمكانية تنفيذ معالجة المواضيع المتعددة وبشكل كامل الربح من تحسين الأداء المسموح به من قبل معالجات متعددة النواة.

الحصول على البيانات الكهربية

النظام وصفنا يترك اختيار برنامج تسجيل الكهربية ونظام الحصول على البيانات تصل إلى المجرب. تبادل الاتصالات بين البرمجيات الحصول على البيانات والتطبيق لدينا يمكن أن تتم خلال المنافذ التسلسلية أو عبر وسائل الاتصال مقبس عبر الشبكة.

الآفاق المستقبلية

أكثر من 30 عاما منذ Sakmann وNeher والتجارب الأصيلة، وتقنية التصحيح، المشبك هو لا يزال خارجل وحده في توفير البيانات مع مزيج خاص من القرار إشارة وتواتر أخذ العينات اللازمة لمجموعة واسعة من التجارب، ولا سيما تلك التي تنطوي على الكشف عن التيارات أو إمكانات آخر متشابك الفردية. من خلال تطوير نظام بمساعدة الحاسوب التي تمكن تسجيل العديد من الخلايا العصبية في وقت واحد ونحن تهدف إلى توسيع الاحتمالات التجريبية من تقنية التصحيح، المشبك. مزيج من هذه الإمكانيات الجديدة مع التطورات الأخيرة في علم الأعصاب التجريبي 8-13 يمكن فتح الطريق نحو فهم أكثر عمقا للدوائر العصبية مع السرعة والتفاصيل لم يسبق لها مثيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نود أن نشكر جلعاد سيلبيربيرج، ميشيل بغناتيلي، توماس K. بيرغر، لوكا Gambazzi، وسونيا جارسيا لمشورة قيمة بشأن التحسينات لأتمتة إجراءات التصحيح، المشبك. نشكر راجنيش رانجان للحصول على المشورة والمساعدة في تنفيذ برامج قيمة. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من مشروع الاتحاد الأوروبي المشبك وجزئيا من قبل برنامج العلوم حدود الإنسان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX51WI 40X Immersion Objective
Manipulators Luigs Neumann SM-5 Serial protocol used
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B SDK used
Camera Till Photonics VS 55 BNC analog output
Framegrabber Data Translation DT3120 SDK used
Oscilloscopes Tektronix TDS 2014 Serial communication
Data acquisition InstruTECH ITC 1600
Data acquisition National Instruments PCI-6221 Library used (.dll)
Pressure valve SMC SMC070C-6BG-32
Pressure sensor Honeywell 24PCDFA6G
Membrane pump Schego Optimal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
  2. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
  3. Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
  4. Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
  5. Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
  6. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
  7. Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
  8. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
  9. Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
  10. Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
  11. Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  12. Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
  13. Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).

Tags

علم الأعصاب، العدد 80، التصحيح، المشبك، وتحديد المواقع التلقائي، خلية كاملة، وتسجيل الخلايا العصبية،
A-متعدد القطب نظام التصحيح، المشبك بمساعدة الحاسوب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perin, R., Markram, H. AMore

Perin, R., Markram, H. A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System. J. Vis. Exp. (80), e50630, doi:10.3791/50630 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter