Summary
Multi-électrodes patch-clamp enregistrements constituent une tâche complexe. Ici, nous montrons comment, par l'automatisation de nombreuses étapes expérimentales, il est possible d'accélérer le processus conduisant à une amélioration qualitative de la performance et le nombre d'enregistrements.
Abstract
La technique de patch-clamp est aujourd'hui la méthode la plus bien établi pour enregistrer l'activité électrique des neurones individuels ou leurs compartiments sous-cellulaires. Néanmoins, la réalisation d'enregistrements stables, même à partir de cellules individuelles, reste une procédure fastidieuse d'une complexité considérable. Automatisation de nombreuses étapes en collaboration avec l'affichage de l'information efficace peut grandement aider les expérimentateurs à effectuer un plus grand nombre d'enregistrements avec une plus grande fiabilité et en moins de temps. Afin de réaliser des enregistrements à grande échelle, nous avons conclu l'approche la plus efficace est de ne pas automatiser entièrement le processus, mais de simplifier les étapes expérimentales et de réduire les risques d'erreur humaine tout en intégrant efficacement l'expérience de l'expérimentateur et visuel. Avec ces objectifs à l'esprit, nous avons développé un système assisté par ordinateur qui centralise tous les contrôles nécessaires pour une expérience de patch-clamp multi-électrode dans une seule interface, un commercManette sans fil ially disponible, tout en affichant expérience en matière d'information et d'orientation des indices sur l'écran de l'ordinateur. Nous décrivons ici les différentes composantes du système qui nous a permis de réduire le temps nécessaire pour atteindre la configuration d'enregistrement et d'accroître sensiblement les chances de succès d'enregistrement grand nombre de neurones simultanément.
Introduction
La capacité d'enregistrer et de stimuler plusieurs sites avec une précision micrométrique est extrêmement utile pour atteindre expérimentalement une meilleure compréhension des systèmes neuronaux. De nombreuses techniques ont été développées à cette fin, mais aucun de permettre la résolution des submillivolt obtenue par la technique du patch-clamp, essentielle pour l'étude de l'activité de sous-seuil et des potentiels post-synaptiques individuels. Ici, nous couvrir le développement d'un système de patch-clamp assistée par ordinateur de douze électrode destinée à la stimulation et l'enregistrement d'un grand nombre de cellules individuelles avec une précision suffisante pour l'étude de la connectivité neuronale simultanément. Bien que de nombreuses autres applications peuvent être conçus pour un tel système, il se prête particulièrement bien à l'étude de la connectivité synaptique étant donné que le nombre de connexions possibles à l'intérieur d'un groupe de neurones croît proportionnellement au carré du nombre de neurones en question. Par conséquent, alors qu'un système à trois électrodes permet de tester l'occurrence d'un maximum de six raccordements et d'enregistrement le plus souvent un seul, l'enregistrement douze neurones permet de tester l'apparition d'un maximum de 132 connexions et en observant fréquemment sur une douzaine (Figure 1). L'observation de dizaines de connexions permet simultanément d'analyser l'organisation de petits réseaux et impliquer des propriétés statistiques de la structure du réseau qui ne peut être sondé sinon 1. En outre, la stimulation précise de nombreuses cellules permet également la quantification de recrutement de cellules post-synaptiques 2.
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Protocol
Une. Préparation de l'équipement
- manipulateurs de commande à partir d'un ordinateur
- Connectez chaque boîte de contrôleur de micromanipulateur à un ordinateur via les ports série (RS-232).
- Mettre en œuvre les commandes pour le positionnement, l'interrogation et le réglage des paramètres doivent être envoyés via le port série. Problèmes de vitesse et de compatibilité matérielle donnée C / C + + est recommandé que le langage de programmation.
- Normaliser le système des manipulateurs de référence de sorte que le zéro est la position la plus proche possible à l'égard des moteurs et mouvement positif est dirigé loin des moteurs.
- Placez le microscope à sa position centrale 2 mm au-dessus du spécimen plan focal (coordonnées [0, 0, 2000]).
- Magasin, pour chaque manipulateur, les coordonnées locales qui permettent à l'embout d'une pipette à observer dans le centre du champ de vision du microscope. C'est le point de référence initial pour chaque électrode.
- Visuapositions des électrodes. Lize Il est très utile d'être en mesure de suivre la position de chaque électrode au cours d'une expérience. Une représentation graphique est la façon la plus intuitive de l'accomplissement de cette. À cette fin, les systèmes de référence de chaque électrode et celle du microscope doit être adaptée. Un moyen simple d'y parvenir est:
- Amener la pointe d'une électrode au centre du champ de vue.
- Mémoriser la position de chaque axe du manipulateur et chaque axe du microscope.
- Exécuter avec l'axe des x du manipulateur d'un mouvement relativement grand (1 mm).
- Localiser la pointe une fois de plus le déplacement que le microscope.
- Calculer la différence de la position du microscope depuis sa dernière mesurée. Ce sont les saillies du mouvement de l'axe de l'électrode sur les axes du microscope.
- Répéter les étapes 2.3 à 2.5 de l'axes Y et Z du manipulateur d'électrode. Cela permet une matrice de projections sur le microscope axes à déterminer (<strong> Figure 2), aussi appelée matrice de cosinus:
- Inverser cette matrice pour permettre de calculer les déplacements, dans trois dimensions, requises par le manipulateur d'électrode pour atteindre une position donnée dans le microscope système de coordonnées:
- En utilisant le point de référence initial et la matrice de cosinus de déterminer la position de chaque électrode dans le microscope coordonnées.
- Afficher graphiquement, sur la base de coordonnées, la position de chaque électrode à intervalles réguliers le microscope. Nous avons choisi d'utiliser / C + + bibliothèques dessin C (GDI +) pour dessiner les positions d'électrodes toutes les 40 ms.
- Répéter les étapes 1.2.1 - 1.2.7 chaque fois angles manipulateurs sont modifiées, ou si les changements de position de plusieurs millimètres sont nécessaires, par exemple, lorsque le type d'électrode est modifiée.
- Activer le stockage de la positions des caractéristiques pertinentes dans le tissu, comme des cellules ou des points de référence anatomiques, en coordonnées microscope.
- Acquérir vidéo et superposer des informations pertinentes.
- Mécaniquement aligner l'axe des x de déplacement du microscope avec l'axe horizontal de la caméra du microscope.
- Installer sur l'ordinateur un framegrabber avec la vidéo en direct et la capacité de recouvrement et un kit de développement logiciel (SDK).
- Mettre en œuvre l'opération en direct d'affichage vidéo avec le SDK.
- Convertir le microscope système de coordonnées dans le système de référence de la caméra par la traduction et mise à l'échelle appropriée.
- Dessiner les éléments pertinents en coordonnées de la caméra et de recouvrement sur la vidéo de l'image résultante en direct à intervalles réguliers d'environ 40 ms (figure 3).
- Amplificateurs de contrôle.
- Utilisez le logiciel de l'amplificateur pour contrôler les paramètres de l'amplificateur de l'interface.
- Control oscilloscopes.
- Connectez les oscilloscopes à l'ordinateur en utilisant des ports série.
- Déterminer l'échelle de l'oscilloscope, l'accouplement et la résolution temporelle pour les différentes étapes de la procédure de patch-clamp en voltage-clamp (par exemple électrode dans le bain, la formation de joint, configuration cellule entière) et le courant-clamp.
- Envoyer les commandes de réglage de l'oscilloscope appropriées lorsque les commandes de l'amplificateur sont émis à partir de l'interface.
- pression de la pipette de contrôle.
- Assembler un système de contrôle de pression selon la figure 4.
- Utilisez une alimentation 12 V / 5 V pour alimenter chaque composant électronique appropriée.
- Connecter la sortie d'une pompe à membrane dans le tampon de pression positive (un récipient de 100 ml).
- Connecter l'entrée d'une pompe à membrane dans le tampon de pression négative (un récipient de 100 ml).
- Raccorder le tuyau de support de pipette d'un capteur de pression dans le pressure système de commande et une vanne pneumatique qui se connecte à la chambre de pression principale.
- Relier chacun des tampons de pression pour une vanne reliée à la chambre de pression principale.
- Connectez une vanne entre le compartiment principal de pression et l'atmosphère.
- Connecter un capteur de pression à la chambre de pression principale.
- Connecter un capteur de pression pour chaque tampon.
- Connectez le système de contrôle de pression à une carte d'acquisition de données.
- Connecter chaque capteur de pression à une entrée analogique.
- Connectez chaque soupape à une sortie numérique.
- Retirer décalée par rapport à tous les capteurs par l'ouverture de toutes les vannes sauf ceux qui se connectent à des pompes à membrane et en soustrayant la pression mesurée à la pression atmosphérique.
- Mettre en œuvre le contrôle de la pression
- Définir dans l'interface d'un contrôle pour activer ou de désactiver le contrôle de pression positive pour chaque pipette.
- Définir une pression positive minimale pour la pipettes d'environ 70 mbar.
- Périodiquement (toutes les 0,5 secondes) détecter lorsque la pression dans les pipettes sous le contrôle de pression actif tombe en dessous du seuil fixé.
- Après le franchissement du seuil ouvrir le tampon de pression positive pour le compartiment de pression et ce compartiment vers la pipette en question pendant de brèves périodes (20 ms) jusqu'à ce que la pression dans les pipettes est au dessus du seuil. Fermez toutes les autres vannes.
- De-activer un contrôle supplémentaire de la pression que l'approche finale vers une cellule d'intérêt est lancé.
- Appliquer une pression négative pour la formation de joint
- Fermez tous les robinets et ouvrir la valve négative tampon de pression vers le compartiment de pression et ce compartiment vers la pipette en question pour la durée de l'expérimentateur nécessite en gardant un bouton enfoncé.
- Assembler un système de contrôle de pression selon la figure 4.
- Centraliser les commandes sur un dispositif d'interface humaine.
- Connectez un wirele disponible dans le commercess manette au PC.
- Mettre en œuvre une lecture de l'état de la manette. Par exemple, utiliser les bibliothèques DirectX pour C / C + + pour effectuer des lectures toutes les 5 ms.
- Comparer la situation actuelle avec l'état précédent de détecter les boutons ont été pressé, relâché ou maintenue enfoncée depuis dernière étape de temps.
- Assigner des fonctions à chaque bouton de la manette. Un exemple de cette application est représentée sur la Figure 5.
2. Patch-clamp procédure
- Préparer les tranches de cerveau de la région d'intérêt.
- Placer une tranche de cerveau d'intérêt, avec la région d'intérêt au centre de la plage de déplacement du microscope.
- Sélection de cellules
- Identifier les cellules d'intérêt en naviguant avec le microscope. Mémoriser la position des cellules sur la base du microscope système de coordonnées avec un droit de la souris, cliquez sur l'affichage de la vidéo en direct sur le dessus de la cellule d'intérêt. L'interface graphique permet d'afficher les cellules sélectionnées ainsi que les micropipettes pour une vue d'ensemble et de logiciels mondial va ajouter un marqueur sur la position de la cellule qui sera superposée sur les images. En outre une image de la cellule est capturée pour référence future dans le fichier 'portable #. Jpg ».
- Attribution des cellules de pipettes
- Après avoir sélectionné les cellules d'intérêt, qui attribuer pipette enregistre chaque cellule. L'interface graphique fournit des contrôles d'affectation qui devraient être fixées. Visualiser un aperçu de la configuration finale en cochant la case "Afficher les positions finales.
- Sélectionnez chaque pipette pour qui la position finale l on souhaite ou cochez la case «Sélectionner tout». Désactiver l'affichage de la position actuelle pour une meilleure visualisation, si nécessaire.
- Préparer les Pipettes
- Remplir les pipettes (6 - 8 MQ sont généralement mieux si nombreux pipettes sont utilisées) wième solution intracellulaire et les charger dans leurs détenteurs. Placez les headstages dans leurs fixations, mais ne pas les glisser vers l'avant pour éviter de toucher le bain avec la pointe de la pipette.
- Activer le contrôle de la pression positive et sélectionnez toutes les pipettes de s'assurer que les conseils resteront propres. Faites glisser doucement chaque headstage en place.
- Localisation des embouts de pipette
- Placez le microscope à une position centrale avec un accent 3 mm au-dessus de la tranche en appuyant sur le bouton R2 tout en maintenant la touche 'A'. Utilisez la position correspondante pour chaque manipulateur stockée dans l'expérience précédente en appuyant sur la touche L2 tout en maintenant le bouton A.
Remarque: À ce stade, il devrait y avoir soit une ombre distinctif d'une pipette en vue ou un petit mouvement le long de l'axe de la pipette devrait être suffisant pour l'observer dans la plupart des cas. Compensation pour les légères différences dans la forme de la pipette doit être effectuée manuellement. - Apportez la pointe de la pipette dans le foyer. Placer l'embout sur le point rouge au centre de l'écran vidéo sans déplacer le microscope (il devrait toujours être en position [0, 0, 2000]).
- Informer le logiciel que la pipette est au centre de l'écran en appuyant sur la touche Z tout en maintenant le bouton C. Après chaque pointe de la pipette se trouve, l'envoyer pipette arrière de sorte que le suivant peut être situé en appuyant sur la touche L1 tout en maintenant le bouton A.
- Placez le microscope à une position centrale avec un accent 3 mm au-dessus de la tranche en appuyant sur le bouton R2 tout en maintenant la touche 'A'. Utilisez la position correspondante pour chaque manipulateur stockée dans l'expérience précédente en appuyant sur la touche L2 tout en maintenant le bouton A.
- Approcher les cellules
- Une fois tous les embouts de pipette ont été précisément situé et chaque pipette est attribué à une cellule, positionner automatiquement les pipettes à proximité de leurs cellules respectives. Faites un clic droit dans le centre du groupe de cellules et sélectionnez l'option "Cluster" dans le menu contextuel. Dans la fenêtre des options de cluster qui apparaîtra, sélectionnez toutes les pipettes que vous souhaitez placer en ce moment et cliquez sur «Allez avec toutes les pipettes vérifiés. Répétez cette opération pour chaque groupe de cellules d'intérêt.
- Perform l'approche finale manuellement. La position des pipettes par rapport à des cellules peut être défini différemment, mais est généralement simplement 200 um à une distance à partir de la cellule dans l'axe de la pipette et 200 um ci-dessus dans le sens vertical, ce qui est suffisant pour maintenir la pointe de la pipette à l'extérieur du tissu . Attendez jusqu'à ce que le positionnement des pipettes est terminé et déplacer le microscope vers une pipette en appuyant sur la touche R1 tout en maintenant la touche C.
- Recalibrer chaque position de la pipette en focalisant le microscope sur sa pointe n'importe où dans l'affichage vidéo et en appuyant sur le bouton B tout en maintenant le bouton C. Un quadrillage doit apparaître brièvement indiquant la position identifiée de la pipette. Si la position n'est pas correcte, placer la pointe sur le point central de l'affichage vidéo et appuyez sur la touche Z tout en maintenant la touche C.
- Établir la configuration cellule attachée
- Assurez-vous que la cellule d'intérêt pour la pipette courant est correctementmarqué. Sinon déplacer le microscope pour correspondre à la cellule d'intérêt avec le point rouge central. Sélectionnez la cellule en appuyant sur le bouton Y tout en maintenant la touche C. Appuyez sur le bouton L2 tout en maintenant le bouton C pour positionner la pipette 200 um loin de sa cellule affectée, le microscope se déplace automatiquement à la position correspondante.
- Ajustez la position de la pipette afin qu'il corresponde le point rouge. Réglez le décalage en appuyant sur la touche R1 tout en maintenant le bouton X. pipette
- Activer l'impulsion de test en appuyant sur la touche L1 tout en maintenant le bouton X. approcher lentement la pipette à sa cellule attribué.
- Lors de l'observation de la formation d'une fossette à la surface de la membrane de la cellule appliquer une brève impulsion de pression négative en appuyant sur la touche Y, tout en maintenant la touche Z pour permettre à la pression appliquée pour accéder à la cellule. Un potentiel de maintien de l'ordre de-65mV devrait établie à ce stade en appuyant sur le bouton L2 tout en maintenant la touche X.
- Configuration cellule entière
- Une fois qu'un Giga-joint est formé, pour chaque cellule, commencer la rupture des membranes en appliquant une pression négative.
- Effectuer des enregistrements
- Utilisez le système de stimulation / acquisition pour effectuer vos enregistrements. Appliquer des impulsions ou des trains d'impulsions sur une cellule individuelle à un moment et observer les réponses sur les cellules restantes de la carte la connectivité entre les cellules enregistrées.
- Reculer pipettes
- Une fois les enregistrements terminés, reculer pipettes lentement du tissu par un clic droit sur le bouton radio de table. Sélectionnez «reculer-> Pipettes 500 um 'avoir les pipettes reculent à une courte distance le long de leurs axes. Observer la dérive du potentiel des cellules (effacer les conseils en appliquant une certaine pression positive peut aider).
- Pour reculer pipettes tout le chemin du retour, régler la vitesse de positionnement de «Fast» et répétez la même opération mais choisissez l'option "Tous". Retirez le utiliséepipettes en glissant doucement sur les headstages et dévissant les pipettes des détenteurs. Il est utile pour éviter la torsion des titulaires dans leurs orbites car cela pourrait grandement nuire à la position de la pointe de la pipette.
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Representative Results
Après les méthodes décrites ci-dessus nous avons réussi à effectuer un enregistrement à cellules entières jusqu'à douze neurones simultanément, doublant presque le plus grand nombre de neurones simultanément patch-serrée jusqu'à présent. Des exemples de réseaux de connexions synaptiques directes entre les neurones pyramidaux enregistrée dans la couche V du cortex somato-sensoriel chez le rat sont présentés dans la figure 6.
La détermination de profils de probabilité de connexion en fonction de la distance inter-somatique pour un type cellulaire donné est une mesure typique d'intérêt qui peut être effectuée de manière efficace avec un système de patch-clamp multi-électrode 1. Récemment photo-stimulation a commencé à apparaître comme un moyen encore plus efficace d'obtenir des données telles 3,4. Il est important, cependant, les données acquises avec les systèmes de patch-clamp multi-électrodes permet expérimentateurs pour obtenir une cartographie plus complète du réseau à l'étude ainsi que de haute résolution avec coloration intracellulaire diffuse colorants. Dans des expériences multi-électrodes de patch-clamp de chaque cellule peut être enregistrée et stimulée, ce qui n'est souvent pas le cas avec d'autres techniques telles que la photo-imagerie ou la stimulation de calcium. Cette fonction permet aux expérimentateurs de garder une trace de préjugés en matière de connectivité, tels que le taux élevé de connexions réciproques, qui ne peut être mesurée autrement. En stimulant et en enregistrant chaque neurone étudié, nous avons montré que les neurones ne sont pas seulement sollicités vers être connecté réciproquement, mais aussi forment des grappes. L'ampleur de nos enregistrements nous a également permis de constater que la probabilité de connexion supérieur existait entre paires de neurones qui partagent communes voisines, soit ont tous deux connectés simultanément à d'autres neurones individuels dans le réseau échantillonné (figure 7a). Cette observation était significatif à chaque case distance intersomatique de 50 mm (de 50 à 250 mm). Nous avons également observé paires de neurones partageant de nombreuses communes voisines ont eu lieu beaucoup plus dedix que prévu par hasard (figure 7b). De plus, nous avons détecté un effet sur la probabilité de connexion en fonction du nombre de voisins communs partagés par une paire donnée de neurones. Les voisins les plus courantes, il part la plus probable d'une paire de neurones doit être interconnectés (figure 7c).
Cette tendance conduit à la formation de groupes de neurones qui sont plus densément interconnectés que la moyenne. Fait intéressant, les groupes fortement interconnectés de neurones non seulement exposées plus nombreuses connexions, mais aussi, en moyenne, les plus forts 1. Ces résultats nous ont amenés à la conclusion que les circuits du néocortex n'est pas seulement organisée en couches et de colonnes, mais aussi dans des assemblages de cellules, à savoir les groupes de neurones partageant interconnectivité synaptique dense et fort, tel que postulé par Donald Hebb il ya plusieurs décennies.
Autres résultats d'intérêt qui peuvent être obtenus avec de multiples simultanément patch-serré neurons comprennent la quantification du recrutement de l'inhibition de l'activité supra-seuil à différents nombres de cellules excitateurs 2. Une forme omniprésente de l'inhibition dans le néocortex 5 est médiée par les cellules de Martinotti (figures 8a et b, adapté de Berger et al.) Qui reçoivent l'entrée des cellules pyramidales et l'intègrent à leur tour affecter, avec une certaine latence, d'autres cellules pyramidales. Nous avons montré que, après de brefs éclats de dopage activité en aussi peu que quatre cellules pyramidales, chaque cellule pyramidale dans un microcircuit local reçoit cette forme d'inhibition (figures 8c, c et f). Nous avons également montré que ces potentiels post-synaptiques inhibitrices ont tendance à saturer lorsque huit ou plusieurs cellules pyramidales sont stimulés simultanément (figure 8E).
Une vue d'ensemble des composants du système peut être vu sur la figure 9. L'interface et le matériel logiciel are représenté à la figure 9a et b, ainsi que l'interface de contrôleur de la figure 9c guider vers les électrodes des cellules pour l'enregistrement sous l'objectif de microscope (Figure 9d).
Figure 1. Calcul du nombre de connexions observées dans une expérience en fonction du nombre de neurones enregistrés simultanément montre une croissance quadratique. Calculs numériques (en haut). Schéma illustratif où d'autres neurones du même réseau sont successivement ajoutées (en bas).
Figure 2. Systèmes de chaque manipulateur d'électrode (jaune) et microscope (rouge) de coordonnées.
Figure 3. Capture d'écran d'une pipette en approche vers la cellule affectée avec le vecteur d'approche superposée, positions de cellule et barre d'échelle.
Figure 4. Schéma illustrant un système pneumatique pour la commande de la pression de la pipette.
Figure 5. Commandes sur le dispositif d'interface humaine qui centralise les contrôles utilisés lors des expériences de patch-clamp.
Figure 6. Exemple de trois réseaux deconnexions synaptiques directes associées à des expériences individuelles
Figure 7. Effet de voisin commun. (A) paires de neurones qui se connectent simultanément à au moins un autre neurone dans le réseau échantillonné (bleu) présentent une probabilité accrue de manière significative d'être reliés entre eux. (B) paires de neurones partageant plusieurs communes voisines se produisent plus souvent que prévu par hasard dans les réseaux échantillonnés. (c) probabilité de connexion à l'intérieur des paires de neurones augmente en fonction du nombre de voisins communes partagées par la paire.
Figure 8. Quantification du recrutement des cellules de Martinotti. (a) Représentation graphique d'une cellule pyramidale (rouge) qui forme des synapses sur une cellule Martinotti (bleu) qui fait elle-même synapses sur une deuxième cellule pyramidale (noir). (b) de stimulation supra-seuil de la cellule pyramidale ( rouge) conduit au recrutement de la Cellule Martinotti (bleu) grâce à l'intégration de faciliter potentiels post-synaptiques excitateurs. La cellule Martinotti Recruté inhibe alors la deuxième cellules pyramidales (noir). (C) Schéma représentant la stimulation de plus en plus de patch-serré cellules pyramidales et les effets sur une autre cellule pyramidale. (D) Moyenne des potentiels post-synaptiques inhibitrices enregistrés à partir d'une cellule pyramidale en fonction du nombre d'autres cellules pyramidales voisines qui sont stimulés. Adapté de Berger et al. 2 (e) L'amplitude de l'inhibition disynaptique dans un circuit local a tendance à saturer quand 9 ou plus cellules pyramidales sont stimmenté indiquant le recrutement maximal des cellules de Martinotti dans probablement atteint à ce point. (f) La fraction de cellules recevant inhibition disynaptique monte rapidement à 1 que le nombre de cellules pyramidales sont stimulées croissante.
Figure 9. Illustration de ensemble du système. (A) interface utilisateur graphique avec la fenêtre principale, l'affichage de la vidéo en direct, connectez-fenêtre et la représentation graphique. (B) Microscope et manipulateurs. (C) dispositif d'interface humaine avec des commandes pour la procédure expérimentale. (D) en verre micropipettes de la situation pour l'enregistrement de plusieurs neurones.
Figure 10. Probabilit binomialefonctions de distribution de y qui décrivent la fraction d'expériences qui enregistrent avec succès un certain nombre de cellules donné l'utilisation de douze électrodes. Comparaison entre le rendement des expériences effectuées en utilisant une rétroaction visuelle par des utilisateurs expérimentés sont en bleu et par les utilisateurs moins expérimentés dans des conditions non idéales en rouge.
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Discussion
Une question se pose immédiatement général concernant le taux de réussite de la procédure que nous avons décrit. Pour les taux de réussite élevés préparation est essentielle. Les pipettes doivent avoir des ouvertures de pointe qui sont adéquates pour les cellules des êtres enregistrées. Filtrer la solution intracellulaire pour éviter le colmatage des pipettes est également important. Extrêmement propre, pipettes fraîchement tirées sont une autre exigence. Une distribution binomiale est le modèle le plus simple qui peut être utilisé pour comprendre comment ces problèmes affectent le rendement final. Il est raisonnable de s'attendre à un expérimentateur avec une expérience et un équipement adéquat pour atteindre un taux de 80% ou plus pour l'enregistrement de neurones individuels avec un retour visuel succès. Les débutants peuvent s'attendre à obtenir des taux de réussite beaucoup plus faibles, surtout si d'importantes mesures de préparation sont négligés. Comment ces taux traduisent en nombre de cellules enregistrées par expérience on peut le voir sur la figure 10. D'autres augmentations dans le nombre de fois patch-palourdeneurones de pédales seront probablement besoin de miniaturisation des manipulateurs et une fiabilité accrue de la procédure, ce qui nécessite une grande attention aux détails, mais sont tout à fait réalisable.
La polyvalence du système présenté ici est encore à l'étude et de nouvelles applications ont souvent été trouvée, en particulier dans l'exploration de la relation entre les signaux extracellulaires et l'activité individuelle des neurones 7. Considérations anatomiques deviennent plus importantes que la distance entre enregistrées cellules augmente. Néanmoins, ce système permet certainement enquête de longue portée et de la connectivité inter-couche, où les connexions restent intacts après la procédure de découpage.
contrôle de Micromanipulateur
Permettant un positionnement automatique avec les micromanipulateurs accélère grandement le processus de multi-électrode de patch-clamp et augmente la fiabilité et la réduction de la survenue d'les erreurs humaines. Différents fabricants proposent des solutions différentes pour établir une connexion à partir du PC aux manipulateurs. Une option courante est un port série ou USB. Afin d'assurer une communication rapide, nous avons consacré un port série à chaque contrôleur de manipulateur. La caractéristique la plus utile de positionnement automatique est probablement l'élimination de la plupart des mouvements latéraux et verticaux d'électrodes à l'intérieur du tissu et la limitation de sa déformation. Alors que le mouvement des électrodes à l'intérieur du tissu a lieu presque exclusivement le long de la direction axiale, une interférence mécanique est réduite au minimum. Mouvements latéraux ne sont nécessaires pour éviter parfois des vaisseaux sanguins et des cellules.
Visualisez positions des électrodes
Il est très utile d'être capable de suivre la position de chaque électrode pendant une expérience. Dans une configuration traditionnelle perdre de vue d'une électrode peut rapidement devenir problématique. Lors de l'utilisation d'un grand nombre d'électrodes, il n'est paspossible de maintenir toutes les électrodes à l'intérieur du champ de vision à tout moment. S'appuyant sur une représentation graphique est l'alternative la plus intuitive et aide à garder la trace des progrès de l'expérience, montrant instantanément les électrodes ont déjà été positionnés dans leur configuration finale et ceux qui ne l'ont pas également.
acquisition de la vidéo et superposition
La possibilité d'afficher la vidéo en direct à partir du champ de vision du microscope sur une fenêtre de l'application est très utile. La fenêtre d'affichage a été programmé pour répondre aux clics de souris permettant le stockage des positions d'intérêt (de corps cellulaires) ainsi que la mise à jour rapide des positions relatives entre microscope et des électrodes en supprimant les erreurs accumulées chaque fois qu'ils apparaissent. Nous avons également mis en place la superposition d'informations pratiques sur la vidéo en direct, comme la trajectoire d'approche pour chaque électrode vers les cellules choisies ou le marquage de ces cellules (Figure 3). Inscription ofonctions f et superposition d'images auxiliaires tels que les chiffres de atlas anatomiques ont également été mises en place pour aider les régions où d'intérêt ne sont pas immédiatement clair.
Amplificateurs
Commandés par ordinateur des amplificateurs de microscope peuvent permettre le contrôle doit avoir lieu à partir d'autres applications. Cela augmente considérablement la rapidité et la fiabilité avec laquelle les cellules multiples peuvent être enregistrées simultanément et élimine la principale source d'erreurs humaines. Après le positionnement et la pression de la pipette commande assistée par ordinateur est l'étape qui produit les gains les plus notables dans le temps, mais les gains en termes de fiabilité sont encore plus importants.
Oscilloscopes
Veiller à ce que des signaux de test peut être visualisée en temps réel à l'échelle appropriée et une résolution temporelle améliore grandement l'efficacité avec laquelle un expérimentateur peut exécuter les étapes expérimentales. En couplant l'ensemble de l'oscilloscopeTings à l'amplificateur modes (comme pince de courant ou tension) nous nous sommes assurés que les mesures de temps critique ont été exécutés et visualisés avec peu d'effort telles que les cellules de détention à des potentiels de membrane appropriées immédiatement après la réalisation de la configuration ci-joint de la cellule. Visualisation approprié a été assurée par l'envoi des commandes de mise à l'échelle et de couplage appropriés via le port série dans son propre protocole de l'oscilloscope pour s'adapter à l'amplitude et le décalage des signaux de test au sein de l'écran de l'oscilloscope.
contrôle de la pression de la pipette
Comme le nombre d'électrodes utilisées dans une expérience augmente, veiller à ce que la pression positive est appliquée en permanence pour maintenir la pointe des électrodes de verre propre devient plus exigeant au point de constituer une entrave importante. Une pression positive et négative suffisante (quelques centaines de mbar) peut être générée par des pompes à membrane simples. Afin de stabiliser la pression, ces pompes ont été couplés à reservoirs d'environ 100 ml dont l'ouverture et la fermeture a été contrôlé par des valves pneumatiques. Les valves ont été à leur tour à l'aide d'une carte d'acquisition de données commandé par un ordinateur. Le schéma du circuit pneumatique peut être vu sur la figure 4. Le régulateur de pression joue un rôle important non seulement assurant pointes de pipettes restent propres, mais aussi permettre la formation de joints d'étanchéité gigaohm rapidement, sur l'observation des fossettes sur la membrane cellulaire en tant que pipettes en contact avec les cellules, ce qui accélère encore la procédure.
Le dispositif d'interface humaine
La plupart des configurations expérimentales ont les commandes de matériel expérimental très dispersés sur une vaste zone. Nous nous sommes concentrés les commandes les plus couramment utilisées sur une seule manette sans fil (Figure 5) réduit considérablement le temps et les efforts nécessaires pour enregistrer chaque cellule mais surtout, éliminer les sources d'erreur humaine qui peut souvent apporter de grandes expériences à un e prématurée.
Langage de programmation
Nous avons eu très peu de choix en termes de langage de programmation pour cette application puisque la seule langue qui a soutenu l'intégration de tout l'équipement nécessaire était C / C + +. Un grand avantage de C / C + + est la possibilité de mettre en œuvre plusieurs threads de traitement et de profiter pleinement de l'amélioration de la performance permise par les processeurs multi-core.
Acquisition de données électrophysiologiques
Le système que nous avons décrit laisse le choix de logiciel d'enregistrement électrophysiologique et un système d'acquisition de données jusqu'à l'expérimentateur. Échange de communications entre le logiciel d'acquisition de données et notre application peut avoir lieu sur les ports série ou via la communication par socket sur le réseau.
Perspectives d'avenir
Plus de 30 ans que des expériences séminales de Sakmann et Neher, la technique de patch-clamp est still seule à fournir des données à une combinaison particulière de résolution de signal et la fréquence d'échantillonnage, qui sont nécessaires pour un grand nombre d'expériences, en particulier ceux qui impliquent la détection des courants ou des potentiels post-synaptiques individuels. En développant un système assisté par ordinateur qui permet l'enregistrement de nombreux neurones simultanément nous avons cherché à élargir les possibilités expérimentales de la technique de patch-clamp. Combinaison de ces nouvelles possibilités avec les développements récents en neurosciences expérimentales 8-13 peut ouvrir la voie à une compréhension plus profonde des circuits neuronaux avec une vitesse sans précédent et le détail.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, et Sonia Garcia pour de précieux conseils sur l'amélioration de la procédure d'automatisation de patch-clamp. Nous remercions Rajnish Ranjan pour obtenir des conseils et de l'aide avec la mise en œuvre de logiciels utiles. Ce travail a été financé en partie par le projet de l'UE Synapse et en partie par la Human Frontiers Science Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
References
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