Ett Datorstödd Multi-elektrod Patch-clamp System

Summary

Multielektrod patch-clamp inspelningar utgör en komplicerad uppgift. Här visar vi hur, genom att automatisera många av de experimentella steg, är det möjligt att påskynda den process som leder till kvalitativa förbättringar i prestanda och antalet inspelningar.

Abstract

Den patch-clamp teknik är i dag den mest väletablerad metod för att spela in elektrisk aktivitet från enskilda nervceller eller deras subcellulära fack. Icke desto mindre uppnå stabila inspelningar, även från enskilda celler fortfarande en tidskrävande procedur för avsevärd komplexitet. Automatisering av många steg i kombination med en effektiv informationsdisplay kan vara till stor hjälp experimental att utföra ett större antal inspelningar med större tillförlitlighet och på kortare tid. För att uppnå storskaliga inspelningar avslutade vi den mest effektiva metoden är inte att helt automatisera processen utan att förenkla de experimentella stegen och minska risken för mänskliga fel samtidigt effektivt införliva försöks erfarenhet och visuell feedback. Med dessa mål i åtanke utvecklade vi ett datorbaserat system som centraliserar alla kontroller som behövs för ett multielektrod patch-clamp experiment i ett enda gränssnitt, en commercially tillgängliga trådlösa gamepad, när de visar experimentrelaterad information och vägledning ledtrådar på datorskärmen. Här beskriver vi de olika komponenterna i systemet som tillät oss att minska den tid som krävs för att uppnå konfigurationen inspelning och kraftigt öka chanserna att lyckas spela in ett stort antal nervceller samtidigt.

Introduction

Förmågan att spela in och stimulera flera webbplatser med mikrometerprecision är mycket användbart för experimentellt uppnå en bättre förståelse av neuronala system. Många tekniker har utvecklats för detta ändamål men ingen tillåter submillivolt upplösning uppnås av patch-clamp teknik, väsentliga för att studera subthreshold aktivitet och individuella postsynaptiska potentialer. Här täcker vi utvecklingen av en tolv-elektrod datorstödd patch-clamp system som syftar till att samtidigt spela in och stimulera ett stort antal enskilda celler med tillräcklig noggrannhet för att studera nervkopplingar. Medan många andra applikationer kan tänkas för ett sådant system, lämpar den sig särskilt väl till studiet av synaptisk konnektivitet med tanke på att antalet möjliga anslutningar inom en grupp av nervceller växer proportionellt mot kvadraten på antalet neuroner i fråga. Därför, medan ett system med tre elektroder tillåter testning avförekomst av upp till sex anslutningar och oftast spelar in en enda, inspelning tolv nervceller låter testa förekomsten av upp till 132 kontakter och ofta observera över ett dussin (Figur 1). Observationen av dussintals anslutningar gör samtidigt det möjligt att analysera organisationen av små nätverk och sluta statistiska egenskaper hos den nätverksstruktur som inte kan undersökas på annat ^1. Dessutom exakt stimulering av många celler gör också kvantifiering av rekrytering av postsynaptiska celler ^2.

Protocol

1. Förberedelse av utrustning

1. Kontroll manipulatorer från en dator
   1. Anslut varje mikromanipulator controller rutan till en dator via serieportar (RS-232).
   2. Genomföra kommandona för positionering, att fråga och justera inställningar som ska skickas via serieporten. Given hastighet och hårdvara kompatibilitetsproblem C / C + + rekommenderas som programmeringsspråk.
   3. Standardisera referenssystemet av styrapparaterna så att noll är den närmast möjliga läge med avseende på de motorer och positiv rörelse är riktad bort från motorerna.
   4. Placera mikroskop vid sitt centrala läge 2 mm ovanför provet fokalplan (koordinater [0, 0, 2000]).
   5. Store, för varje manipulator, de lokala koordinaterna som tillåter spetsen av en pipett för att observeras i mitten av synfältet för mikroskopet. Detta är den första referenspunkten för varje elektrod.
2. VisuaLize elektrodpositioner. Det är mycket användbart att kunna spåra positionen för varje elektrod under ett experiment. En grafisk representation är det mest intuitiva sättet att åstadkomma detta. Därför referenssystemen i varje elektrod och som av mikroskopet måste matchas. Ett enkelt sätt att åstadkomma detta är:
   1. Bring spetsen av en elektrod till centrum av synfältet.
   2. Lagra läget på varje axel hos manipulatorn och varje axel för mikroskop.
   3. Exekvera med x-axeln av manipulatorn en relativt stor rörelse (1 mm).
   4. Leta spetsen återigen rör sig endast mikroskopet.
   5. Beräkna skillnaden i mikroskop läget sedan den förra mäts. Dessa är projektioner av elektrodaxelrörelse på mikroskop axlarna.
   6. Upprepa steg från 2,3 till 2,5 för Y-och Z-axlarna hos elektroden manipulator. Detta medger att en matris av utskott på mikroskop-axlarna skall bestämmas (<strong> Figur 2) även kallad cosinus matris:
      
   7. Invertera denna matris för att göra det möjligt att beräkna de förflyttningar, i tre dimensioner, som krävs av elektroden manipulator för att nå en given position i mikroskopet koordinatsystemet:
      
   8. Med hjälp av den ursprungliga referenspunkten och cosinus matrisen bestämma positionen för varje elektrod i mikroskop koordinater.
   9. Display grafiskt baserat på mikroskop-koordinater, att positionen för varje elektrod vid regelbundna intervall. Vi valde att använda C / C + +-ritning bibliotek (GDI +) för att dra elektrodpositioner var 40 ms.
   10. Upprepa steg 1.2.1 - 1.2.7 varje gång manipulerings vinklar ändras eller om positionsändringar av flera millimeter som behövs, till exempel när den typ av elektrod ändras.
3. Aktivera lagring av positions av relevanta funktioner i vävnaden, t.ex. celler eller anatomiska referenspunkter, i mikroskop koordinater.
4. Förvärva video och overlay relevant information.
   1. Rikta Mekaniskt x-axeln av rörelse av mikroskopet med den horisontella axeln för mikroskopkamera.
   2. Installera på datorn en framegrabber med live video-och överlagringsförmåga och ett Software Development Kit (SDK).
   3. Genomföra live video display operation med SDK.
   4. Konvertera mikroskopet koordinatsystemet till kameran referenssystem med lämplig översättning och skalning.
   5. Rita relevanta funktioner i kamera koordinater och overlay på live-video den resulterande bilden med jämna mellanrum av ca 40 msek (Figur 3).
5. Kontrollförstärkare.
   1. Använd förstärkaren programvara för att styra förstärkarens inställningar från gränssnittet.
6. Control oscilloskop.
   1. Anslut oscilloskop till datorn med serieportar.
   2. Bestäm oscilloskopet skalan, koppling och temporal upplösning för de olika stegen i patch-clamp i spänning-klämma (t.ex. elektrod i badet, tätningsbildning, hel-cell-konfiguration) och ström-klämma.
   3. Skicka lämpliga oscilloskop inställningskommandon när förstärkare kommandon utfärdas från gränssnittet.
7. Styr pipett tryck.
   1. Montera en tryckregleringssystemet enligt figur 4.
      1. Använd en 12 V / 5 V strömförsörjning för att leverera varje elektronisk komponent på lämpligt sätt.
      2. Anslut utgången från en membranpump för att den positiva tryckbuffert (en 100 ml-behållare).
      3. Anslut ingången hos en membranpump av det undertryck som buffert (en 100 ml-behållare).
      4. Anslut pipetthållaren slangen till en trycksensor i den pressure styrsystem och en pneumatisk ventil som är ansluten till huvudtryckutrymmet.
      5. Anslut var och en av de tryckbuffertar till en ventil som är ansluten till huvudtryckutrymmet.
      6. Anslut en ventil mellan huvudtryckutrymmet och atmosfären.
      7. Anslut en trycksensor till huvudtryckutrymmet.
      8. Anslut en trycksensor för varje buffert.
      9. Anslut tryckstyrsystem till ett datainsamlingskortet.
      10. Anslut varje tryckgivare till en analog ingång.
      11. Anslut varje ventil till en digital utgång.
   2. Ta bort lufttrycket förskjutning från alla sensorer genom att öppna alla ventiler utom de ansluter till membranpumpar och subtrahera det uppmätta trycket.
   3. Implementera tryckkontroll
      1. Definiera i gränssnittet en kontroll för att aktivera eller avaktivera övertryck kontroll för varje pipett.
      2. Definiera en minimal positivt tryck för pipettens för ca 70 mbar.
      3. Regelbundet (varje 0,5 sek) upptäcka när trycket i pipetter under aktiv tryckreglering sjunker under det inställda gränsvärdet.
      4. Vid tröskel öppna övertryck bufferten till huvudtryckutrymmet och detta fack mot pipetten i fråga under korta perioder (20 ms) tills trycket i pipetterna är över tröskeln. Stäng alla andra ventiler.
      5. De-aktivera ytterligare tryckreglering som sista strategi för en cell av intresse initieras.
   4. Ansök undertryck för tätning bildning
      1. Stäng alla ventiler och öppna undertryck buffertventil mot huvudtryckutrymmet och detta fack mot pipetten i fråga under hela försöks kräver genom att hålla en knapp intryckt.
8. Centralisera kommandon på en Human Interface Device.
   1. Anslut en kommersiellt tillgänglig wireless gamepad till datorn.
   2. Genomföra avläsning av joystick status. Till exempel använder DirectX bibliotek för C / C + + för att utföra avläsning var 5 ms.
   3. Jämför aktuell status med föregående status för att upptäcka vilka har pressats knappar, släpptes eller hålls intryckt sedan sist steg.
   4. Tilldela funktioner till varje knapp i gamepad. Ett exempel på denna mappning visas i Figur 5.

2. Patch-clamp Tillvägagångssätt

1. Förbered hjärnan skivor i regionen av intresse.
2. Placera en hjärna skiva av intresse, med regionen av intresse i centrum av mikroskopets förskjutning intervall.
3. Cell Selection
   1. Identifiera celler av intresse genom att bläddra med mikroskopet. Lagra läget för cellerna baserat på mikroskop koordinatsystem med en högerklicka på live videodisplayen på toppen av cellen av intresse. Det grafiska gränssnittet kommer att visa de markerade cellerna samt mikropipetter för en global överblick och mjukvara kommer att lägga en markör på cell position som kommer att överlagras på bilderna. Dessutom en bild av cellen fångas för framtida referens i filen "Cell #. Jpg".
4. Erkännande av celler till pipetter
   1. När du har valt cellerna av intresse, tilldela vilken pipett kommer att spela in varje cell. Det grafiska gränssnittet ger uppdrags kontroller som ska ställas in. Visualisera en förhandsvisning av det slutliga konfigurationen genom att markera kryssrutan "Visa slutliga positioner".
   2. Välj varje pipett för vilka den slutliga positionen förhandsvisning önskas eller kontrollera "Välj alla" kryssrutan. Avaktivera den aktuella positionen display för bättre visualisering vid behov.
5. Förbered Pipetter
   1. Fyll pipetter (6-8 Mohm är oftast bäst om många pipetter används) with intracellulära lösning och ladda dem i sina hållare. Placera headstages i sina upptagningar, men inte skjuta dem framåt för att undvika att röra vid badet med pipettspetsen.
   2. Aktivera den positiva tryckreglering och välja alla pipetter för att säkerställa att spetsarna kommer att förbli rena. Skjut försiktigt varje huvudsteg på plats.
6. Placering av pipettspetsar
   1. Placera mikroskopet till ett centralt läge med fokus 3 mm ovanför skivan genom att trycka på knappen R2 medan du håller knappen "A". Använd motsvarande position för varje manipulator som lagrats från tidigare experiment med knapp L2 samtidigt som du håller knappen A.
      Observera: På denna punkt bör det finnas antingen en distinkt skugga av en pipett med tanke eller en liten rörelse längs pipetten axel bör vara tillräckligt för att konstatera att det i de flesta fall. Ersättning för de små skillnaderna i pipett form måste utföras manuellt.
   2. Bring pipettspetsen i fokus. Placera spetsen på den röda centrala punkten av video displayen utan att flytta mikroskopet (det ska fortfarande vara vid position [0, 0, 2000]).
   3. Informera programvara som pipetten är i mitten av displayen genom att trycka på knappen Z medan du håller knappen C. Efter varje pipettspetsen ligger, skicka den pipetten bakåt så att följande kan lokaliseras genom att trycka på L1-knappen samtidigt som du håller knappen A.
7. Närmar cellerna
   1. När alla pipettspetsar har exakt placerade och varje pipett tillskrivs en cell, automatiskt positionera pipet nära sina respektive celler. Högerklicka bara i mitten av den grupp av celler och välj alternativet "Cluster" på popup-menyn. På klusteralternativ fönstret som visas markerar du alla pipetter som du vill placera på den här gången och klicka på 'Gå med alla kontrolleras pipetter ". Upprepa detta för varje kluster av celler av intresse.
   2. Perform den slutliga inflygningen manuellt. Placeringen av pipetterna i förhållande till de celler som kan specificeras på olika sätt, men oftast är helt enkelt 200 ^ m bort från cellen i axeln av pipetten och 200 ^ m över den i vertikal riktning, vilket är tillräckligt för att hålla pipetten spets utanför vävnaden . Vänta tills placeringen av pipetterna är klar och flytta mikroskopet mot en pipett genom att trycka på knappen R1 medan du håller knappen C.
   3. Kalibrera varje pipett position genom att fokusera mikroskopet på sin spets var som helst i videoskärmen och trycka på knapp B samtidigt som du håller knappen C. Ett rutnät ska kort visas för att indikera det identifierade läget av pipetten. Om läget inte är korrekt, placera spetsen på den centrala punkten av video displayen och tryck på knappen Z medan du håller knappen C.
8. Upprätta cellansluten konfiguration
   1. Bekräfta att cellen av intresse för den aktuella pipetten är korrektmarkerad. Annars flytta mikroskop anpassat till cellen av intresse med den centrala röd prick. Markera cellen genom att trycka på knappen Y medan du håller knappen C. Tryck på knappen L2 samtidigt som du håller knappen C för att placera pipetten 200 ìm bort från sin tilldelade cell, kommer mikroskopet automatiskt till motsvarande position.
   2. Justera pipetten position så den matchar den röda pricken. Justera pipetten kompenseras genom att trycka på knappen R1 samtidigt som du håller knappen X.
   3. Aktivera testpulsen genom att trycka på L1-knappen samtidigt som du håller knappen X. långsamt närma pipetten till sitt skrivas cell.
   4. Vid observation av bildningen av en grop på ytan av cellmembranet tillämpa en kort puls av negativt tryck genom att trycka på knappen Y och samtidigt hålla knappen Z för att tillåta det pålagda trycket för att nå cellen. En anläggning potential om-65mV bör inrättas i detta läge genom att trycka på knappen L2 samtidigt som du håller knappen X.
9. Hel-cellkonfiguration
   1. En i en Giga-tätning bildas för varje cell, börja brista membranen genom att applicera negativt tryck.
10. Utför inspelningar
    1. Använd stimulans / anskaffningssystemet för att utföra dina inspelningar. Applicera pulser eller tåg av pulser på en enskild cell i taget och observera svar på de kvarvarande cellerna att kart anslutning bland de inspelade cellerna.
11. Recede pipetter
    1. När inspelningarna är klar avta pipetter långsamt från vävnaden genom att högerklicka på tabellen radioknappen. Välj "avta-> Pipetter 500 ^ 'att ha pipetterna avta en kort sträcka längs sina axlar. Beakta drift i potentiellt av cellerna (rensa tipsen genom att tillämpa några övertryck kan hjälpa).
    2. Avta pipetter hela vägen tillbaka, ställ in positioneringshastigheten till "Snabb" och upprepa samma operation men välj "Alla" alternativet. Ta bort den användapipetter genom att försiktigt dra ut headstages och skruva pipetterna från hållarna. Det är bra att undvika att vrida innehavarna i sina hålor eftersom detta riskerar att kraftigt störa pipettspetsen läget.

Representative Results

Efter de ovan beskrivna metoderna vi lyckades genomföra hela-cell inspelning av upp till tolv nervceller samtidigt, nästan en fördubbling det största antalet nervceller samtidigt patch-fastklämd hittills. Exempel på nät av direkt synaptiska anslutningar mellan pyramidala nervceller registreras i Layer V i den somatosensoriska cortex hos råtta visas i figur 6.

Bestämningen av anslutningssannolikhetsprofiler som funktion av inter somatisk avstånd för en given celltyp är en typisk mätning av intresse som kan utföras effektivt med en multielektrod patch-clamp-systemet ^1. Nyligen fotostimulering började framstå som en ännu effektivare sätt att erhålla sådana uppgifter ^3,4. Viktigt är dock de uppgifter som erhållits med multielektrod patch-clamp system låter praktiker för att få en mer fullständig kartläggning av det nätverk som studeras samt högupplösta färgning med intracellulär diffust färgämnen. I flerelektrod patch-clamp experiment kan spelas in och stimuleras varje cell, vilket ofta inte är fallet med andra tekniker såsom fotostimulering eller kalcium avbildning. Denna funktion gör praktiker för att hålla koll på fördomar i anslutning, till exempel den höga förekomsten av ömsesidiga förbindelser, som inte kan mätas på annat sätt. Genom att stimulera och spela in varje studerat neuron visade vi att nervceller är inte bara partisk mot att vara ömsesidigt ansluten men också bilda kluster. Omfattningen av våra inspelningar tillät oss också att konstatera att en högre anslutnings sannolikhet funnits bland par av nervceller som delade gemensamma grannar, det vill säga båda samtidigt anslutna till andra enskilda nervceller i den samplade nätverket (figur 7a). Denna observation var signifikant vid varje intersomatic avstånd bin på 50 mm (50-250 mm). Vi observerade även par av nervceller som delar många gemensamma grannar var signifikant förten än väntat av en slump (Figur 7b). Dessutom upptäckte vi en effekt på anslutnings sannolikhet beroende på antal vanliga grannar som delas av ett givet par av nervceller. De vanligaste grannar den delar det mer sannolikt ett par av nervceller är att vara sammankopplade (figur 7c).

Denna tendens leder till bildandet av grupper av nervceller som är tätare sammankopplade än genomsnittet. Intressant, mycket sammankopplade grupper av nervceller inte bara ut mer talrika kontakter utan också, i genomsnitt, starkare sådana ^1. Dessa resultat ledde oss till slutsatsen att hjärnbarkens kretsar inte bara organiserat i lager och kolumner, men också i cellheter, det vill säga grupper av nervceller dela tät och stark synaptiska sammankoppling som postulerade av Donald Hebb flera årtionden sedan.

Andra resultat av intresse som kan uppnås med flera samtidigt patch-fastklämd neurons inkluderar kvantifiering av rekrytering av hämning av övertröskel aktivitet i olika antal excitatoriska celler ^2. En allmänt förekommande formen av hämning i neocortex ⁵ förmedlas av Martinotticeller (figurerna 8a och b, anpassade från Berger et al.) Som tar emot input från pyramidala celler och integrera det i sin tur påverkar, med viss fördröjning, andra pyramidala celler. Vi visade att efter korta skurar av tillsatta aktivitet på så lite som fyra pyramidala celler, varje Pyramidal Cell i ett lokalt mikrokrets tar emot denna form av hämning (figur 8c, c, och f). Vi visade också att dessa inhibitoriska postsynaptiska potentialer tenderar att mätta när åtta eller fler pyramidala celler stimuleras samtidigt (Figur 8E).

En översikt över de delar av systemet kan ses i figur 9. Programvaran gränssnitt och hårdvara are som visas i figur 9a och b samt styrgränssnittet i figur 9c vägleda elektroderna mot celler för inspelning under mikroskop mål (figur 9d).

Figur 1. Beräkning av antalet anslutningar som observerats i ett experiment som en funktion av antalet nervceller samtidigt inspelade visar en kvadratisk tillväxt. Numeriska beräkningar (topp). Illustrativ schema där ytterligare neuroner i samma nätverk sättes successivt (botten).

Figur 2. Koordinat system av varje elektrod manipulator (gul) och mikroskop (röd).

Figur 3. Skärmdump av en pipett i strategi för tilldelade cell med överlagd strategi vektor, cellpositioner och skal.

Figur 4. Diagram som visar pneumatiskt system för pipett tryckreglering.

Figur 5. Kommandon på det mänskliga gränssnittet enhet som centraliserar kontroller som används under patch-clamp experiment.

Figur 6. Exempel på tre nätverk avdirekta synapsförbindelser mappade i enskilda experiment

Figur 7. Gemensam granne effekt. (A) Par av nervceller som samtidigt ansluter till minst en annan neuron i den samplade nätet (blå) uppvisar en signifikant ökad sannolikhet att sammankopplade. (B) Par av nervceller som delar flera gemensamma grannar oftare än väntat av en slump i näten i urvalet. (c) Anslutnings sannolikhet inom par av nervceller ökar som en funktion av antal vanliga grannar som delas av paret.

Figur 8. Kvantifiering av rekrytering Martinotticeller. (a) Grafisk representation av en pyramidal cell (röd) som bildar synapser på en Martinotticell (blå), som i sin tur bildar synapser på en andra Pyramidal Cell (svart). (b) Supra-tröskeln stimulering av Pyramidal cell ( rött) leder till rekrytering av Martinotti Cell (blå) genom integrering av lätta excitatoriska postsynaptiska potentialer. Den Rekryterad Martinotticell hämmar sedan den andra Pyramidal Cell (svart). (C) Diagram representerar stimulering av allt fler patch-fastklämd pyramidala celler och effekterna på en annan Pyramidal Cell. (D) Genomsnitt hämmande postsynaptiska potentialer som spelats in från en Pyramidal Cell som en funktion av antalet andra närliggande pyramidala celler som stimuleras. Anpassad från Berger et al. ² (e) Amplituden hos disynaptic inhibering i en lokal krets tenderar att mätta när nio eller flera pyramidala celler är Stimulated anger maximal rekrytering Martinotticeller i förmodligen nått vid denna punkt. (f) Den fraktion av celler som får disynaptic hämning snabbt stiger till 1 som allt fler pyramidala celler stimuleras.

Figur 9. Illustration av ensemble av systemet. (A) Grafiskt användargränssnitt med huvudfönstret live-videovisning, log fönster och grafisk representation. (B) mikroskop och manipulatorer. (C) HID-enhet med kontroller för experimentell procedur. (D) Glas mikropipetter i läge för att spela in flera nervceller.

Figur 10. Binomial probability fördelningsfunktioner som beskriver den del av experiment som lyckas spela in ett visst antal celler som ges användningen tolv elektroder. Jämförelse mellan avkastningen av experiment som utförs med hjälp av visuell feedback av erfarna användare visas i blått och av mindre erfarna användare i icke-ideala förhållanden i rött.

Discussion

En omedelbar fråga uppstår oftast när det gäller graden av framgång i förfarandet som vi beskrev. För höga andelen framgångsrika förberedelser är viktigt. Pipetter måste ha spetsöppningar som är lämpliga för cellerna varelser registrerats. Filtrering av den intracellulära lösningen för att undvika igensatta pipetter är också viktigt. Extremt rena, nyligen drog pipetter är ett annat krav. En binomialfördelning är den enklaste modellen som kan användas för att förstå hur dessa frågor påverkar det slutliga utbytet. Det är rimligt att förvänta sig en försöksledaren med erfarenhet och rätt utrustning för att nå en framgång på 80% eller mer i inspelningen enskilda nervceller med visuell återkoppling. Nybörjare kan förväntas uppnå mycket lägre framgångsrika, särskilt om viktiga förberedelsesteg förbises. Hur dessa priser översätter i antal celler som registrerats per experiment kan ses i figur 10. Ytterligare ökningar av antalet samtidigt patch-musslaped nervceller kommer sannolikt att kräva miniatyrisering av manipulatorer och ökat tillförlitligheten i förfarandet, vilket i sin tur kräver betydande uppmärksamhet på detaljer, men är fullt möjligt.

Mångsidigheten hos det system som presenteras här är fortfarande utforskas och nya tillämpningar har ofta visat sig, i synnerhet i utforskandet av relationen mellan cellulära signaler och enskild neuron aktivitet ^7. Anatomiska överväganden blir allt viktigare eftersom avståndet mellan inspelade celler ökar. Trots detta system definitivt möjliggör undersökning av långsiktiga och mellanlager anslutning varhelst anslutningar förblir intakt efter skivning förfarande.

Mikromanipulator kontroll

Aktivera automatisk positionering med micromanipulators kraftigt accelererar processen med multielektrod patch-clamp och ökar dess tillförlitlighet att minska förekomsten avmänskliga fel. Olika tillverkare ger olika lösningar för att etablera en anslutning från datorn till manipulatorer. Ett vanligt alternativ är en serie-eller USB-port. För att säkerställa snabb kommunikation dedikerade vi en seriell port för varje manipulator controller. Den mest användbar funktion i automatisk positionering är förmodligen att eliminera de flesta lateral och vertikal rörelse av elektroder inne i vävnaden och begränsar dess distorsion. När rörelsen hos elektroderna inne i vävnaden sker nästan uteslutande utmed den axiella riktningen, är mekanisk interferens minimeras. Sidorörelser är endast nödvändigt att då och då undvika blodkärl och celler.

Visualisera elektrodpositioner

Det är mycket användbart att kunna spåra positionen för varje elektrod under ett experiment. I en traditionell inställning förlora en elektrod kan snabbt bli problematisk. Vid användning av ett stort antal elektroder är det intemöjligt att hålla alla elektroder inom synfältet hela tiden. Förlitar sig på en grafisk representation är det mest intuitiva alternativet och hjälper till att hålla koll på utvecklingen av experimentet omedelbart visar vilka elektroder har redan placerats i sin slutliga utformning och vilka som inte har också.

Video förvärv och overlay

Möjligheten att visa live-video från mikroskopet synfältet på ett programfönster är mycket användbart. Den skyltfönster var programmerad att reagera på musklick som möjliggör lagring av positioner av intresse (cell somata) samt snabb uppdatering av de relativa positionerna mellan mikroskop och elektroder ta bort ackumulerade fel när de visas. Vi genomförde också en överlagring av praktisk information om live-video som den metod förloppet för varje elektrod mot utvalda celler eller märkning av dessa celler (Figur 3). Registrering of funktioner och överlagring av extra bilder som siffror från anatomiska atlaser har också genomförts för att hjälpa var regioner av intresse är inte omedelbart klart.

Förstärkare

Datorstyrda mikroskopet förstärkare kan tillåta kontroll att ske från andra program också. Detta ökar drastiskt hastigheten och tillförlitligheten med vilken flera celler kan spelas in samtidigt och eliminerar den största källan till mänskliga fel. Efter datorstödd positionering och pipett tryckreglering är det steg som ger de mest märkbara vinster i tid, men de vinster i tillförlitlighet är ännu viktigare.

Oscilloskop

Att se till att testsignaler kan visualiseras i realtid på lämplig omfattning och tidsmässig upplösning förbättrar avsevärt den effektivitet med vilken en försöksledaren kan utföra experimentella steg. Genom att koppla oscilloskopet settings till förstärkare lägen (t.ex. ström eller spänning klämma) vi sett till att tidskritiska steg avrättades och visualiseras med liten ansträngning som exempelvis att hålla cellerna vid lämpliga membranpotentialer direkt efter att nå cellen bifogade konfiguration. Korrekt visualisering säkerställdes genom att skicka lämpliga skalning och kopplingskommandon via den seriella porten i oscilloskopets egna protokoll för att passa amplituden och förskjutning av testsignalerna inom oscilloskopets skärm.

Pipettera tryckreglering

Eftersom antalet elektroder som används i ett experiment ökar, se till att positivt tryck appliceras permanent för att hålla toppen på glaselektroder ren blir mer krävande till den grad att utgöra ett viktigt hinder. Tillräckligt med positivt och negativt tryck (några hundra mbar) kan alstras genom enkla membranpumpar. För att stabilisera trycket var dessa pumpar kopplade till reservoirs av ca 100 ml, vars öppnande och stängande styrdes med pneumatiska ventiler. Ventilerna i sin tur var datorstyrda med hjälp av ett datainsamlingskort. Diagrammet av den pneumatiska kretsen kan ses i figur 4. Tryckregulatorn utför en viktig roll inte bara säkerställer pipettspetsar förbli ren, men också tillåter bildningen av gigaohm tätningar snabbt, på observationen av groparna på cellmembranet som pipetter röra cellerna ytterligare påskynda förfarandet.

Den mänskliga gränssnittsenhet

De flesta experimentella uppställningar har kontrollerna av experimentell utrustning vitt spridda över ett stort område. Vi koncentrerade de vanligaste kontrollerna på en trådlös handkontroll (Figur 5) kraftigt minska den tid och ansträngning som krävs för att spela in varje cell, men viktigast av allt, att eliminera källor till mänskliga fel som ofta kan ge stora experiment till en för tidig eND.

Programmeringsspråk

Vi hade mycket lite val när det gäller programmeringsspråk för denna applikation eftersom det enda språk som stöds integrering av all nödvändig utrustning var C / C + +. En stor fördel med C / C + + är möjligheten att implementera flera processtrådar och fullt dra nytta av prestandaförbättring tillåts av multipel-core processorer.

Elektro datainsamling

Det system som vi beskrev lämnar valet av elektrofysiologiska inspelning programvara och datainsamlingssystem upp till försöksledaren. Utbyte av kommunikation mellan data-förvärv programvara och vår ansökan kan ske över seriella portar eller via uttag kommunikation över nätverket.

Framtidsperspektiv

Mer än 30 år sedan Sakmann och Neher s banbrytande experiment, är patch-clamp teknik stilensam om att tillhandahålla data med en viss kombination av signalupplösning och samplingsfrekvens som erfordras för en bred variation av experiment, i synnerhet l de som involverar detekteringen av enskilda postsynaptiska strömmar eller potentialer. Genom att utveckla ett datorbaserat system som möjliggör inspelning av många nervceller samtidigt som vi syftar till att utöka de experimentella möjligheterna för patch-clamp teknik. Kombination av dessa nya möjligheter med den senaste utvecklingen inom experimentell neurovetenskap ^8-13 kan öppna vägen mot en djupare förståelse av neuronala kretsar med oöverträffad hastighet och detaljer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	40X Immersion Objective
Manipulators	Luigs Neumann	SM-5	Serial protocol used
Amplifiers	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK used
Camera	Till Photonics	VS 55	BNC analog output
Framegrabber	Data Translation	DT3120	SDK used
Oscilloscopes	Tektronix	TDS 2014	Serial communication
Data acquisition	InstruTECH	ITC 1600
Data acquisition	National Instruments	PCI-6221	Library used (.dll)
Pressure valve	SMC	SMC070C-6BG-32
Pressure sensor	Honeywell	24PCDFA6G
Membrane pump	Schego	Optimal