Summary
이 문서는 거머리를 사용하여 세 가지 신경계 준비 사항 : 세포 내 기록을 복부 신경절에있는 신경 세포에서, 복부 신경절에서 뉴런을 배양하고, 감각 필드를 매핑하는 신경 지배 피부의 패치에서 기록.
Abstract
민물 거머리, Hirudo medicinalis는, 신경 생리학, neuroethology 및 발달 생물학 분야에서 과학적인 문제를 해결하기 위해 사용 된 다양한 모델 생물이다. 이 보고서의 목적은 다른 신경계 준비에 전문성을 갖춘 생리에 사용이 될 것입니다, 또는 거의없는 전기 생리학 경험 생물학 학생에 하나의 문서에 거머리 시스템의 실험 기술을 통합하는 것입니다. 우리는 신경절에서 확인 된 신경 회로에서 세포 내 기록에 대한 거머리를 해부하는 방법을 보여줍니다. 다음으로 우리는 알려진 기능의 개별 세포가 배양 접시에서 배양하는 신경절, 어떻게 문화에 그 뉴런에서 기록에 제거 할 수있는 방법을 보여줍니다. 그 다음 우리는 감각 모터 필드를 매핑에 사용되는 신경 지배 피부의 패치를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 거머리의 준비는 아직 널리 신경이 networ의 기본적인 전기적 특성을 해결하는 데 사용됩니다KS, 행동, 시냅스, 개발. 또한 신경 생리학 교육 연구소에 대한 적절한 교육 모듈이다.
Introduction
힐 준비가 식별 (감각, 모터 및 동물의 중추 신경계 (CNS) 내에서 간 신경 세포의 기능을 조사하는 데 유용합니다. 거머리 신경 세포의 유용한 속성은 자신의 활동 전위 및 생물 물리학 적 특성의 모양이 특징적인 점이다 세포 분류 관련 (즉 P, N, T,는 Rz). 더욱이 신경 세포만큼 사십오일 1,2 그들의 전기적 특성을 유지할 수있는 적합한 배지에서 배양 동물로부터 제거 될 수있다.
전기 생리학 녹음을하는 방법을 학습에 대한 거머리 신경절의 뚜렷한 장점은 세포가 특징적으로 안정적으로 할 수있는 패턴의 신경절에 배치되는 것입니다 신경절에서 신경절 및 동물에서 동물로 별개의 세포 유형의 식별. 독특한 위치와 거머리 신경절에있는 신경 세포의 형태는 이미 1891 3 등 Retzius에 의해 관찰되었다. 일에 대한 지식전자 ID 및 신경 세포의 기능은 신경 회로를 조사하는 주어진 세포 유형과 실험을하기에 유리하다. 인해 그들이 해부 현미경으로 볼 수 있으며, 인 somata 선택적 그들의 전기적 특성을 기록하기위한 미소 전극과 찔 수 신경절 뉴런 사이의 비교적 대형 인 somata한다.
염료 및 큰 분자는 각각의 세포 및 패치 클램프에 의해 연구 채널 속성에 주입 할 수있다. 다양한 신경 세포의 특징적인 활동 전위의 다양한 형태로 발생시키는 이온 전류는 4-7 확인되었습니다. 신경 분포의 패턴과 CNS 내의 개별 신경 세포의 분기 조사에서 시냅스 연결이 확인 된 뉴런 2.8와 문화를 재현하고있다. 거머리 신경의 연구도 ë으로뿐만 아니라 전기 생리학으로 측정 할 수있는 기능 회로의 개발에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다전자 동물 행동 연구. 거머리 CNS는 전체 동물의 문화 4-6,9-12에있는 신경 세포의 수리 및 재생과 관련된 메커니즘을 연구하기위한 귀중한 준비를 역임했다.
포유류의 뇌에서는 속성과 개별 식별 뉴런의 연결 측면에서 행동을 설명하는 것은 어려운 작업입니다. 원칙적으로 하나는 거머리 덜 복잡한 시스템의 연구는 고등 동물에 사용되는 기본 메커니즘을 정의하는 데 도움이 될 수 있기를 바랍니다 수 있습니다. 수영 패턴 (13, 14)과 심장 (15)의 리듬의 기초가 사용되는 연결은 잘 거머리 특징으로하고 있습니다. 양쪽 전기 화학 통신을 형성하는 일부 거머리 뉴런의 능력은 흥미 롭다. 다른 사람이 단방향 화학적하지만 양방향 전기적으로 7하는 동안 일부 연결은 양방향이다. 동물 내에서 시냅스 연결을 이해뿐만 아니라 같은 일반을 다시배양 접시에 연결 전자는 시냅스 16-18뿐만 아니라 시냅스 (19)의 약리학 적 프로파일을 조사하기위한 강력한 도구입니다. 여기에 설명 된 세포 내 기록 및 자극 기술은 neuroethology 개발에 약물 분석 및 연구를위한 기초를 제공한다.
또, 분절성 복부 신경 코드는 신경 지배 피부 패치로 해부 될 수있다. 살아있는 피부 패치 및 뉴런을 유지하는 기능, 감각 수용 필드는 CNS에서 각각 복부 신경절 내의 감각 신경의 세포체 (즉 소마)로부터 전기 신호를 기록하여 탐색 할 수있다. 이것 하나는 피부에 힘을 다양한 각도를 적용하여 감각 엔딩의 민감도를 평가하고 수용 필드를 매핑 할 수 있습니다 가벼운 터치, 압력 및 유해 (고통) (20, 21)를 자극.
이 거머리 신경절 피부 준비의 장점은 하나의 캘리포니아N 해부학 적으로 수용 필드 맵을 그리고 전기 응답이 기록되고 일단 확인 된 신경 세포의 연결 과정을 추적. 후술 세 거머리 실험 전체 학술 실험실이 비용 효과적인 교육 모듈을 만드는 하나의 시편, 여러 번으로 완료 될 수있다.
Protocol
1. 전극과 생리 식염수 용액의 제조
- 동물을 해부하기 전에 생리 식염수 및 전극을 준비합니다. 115.3 밀리미터의 NaCl, 1.8 mM의 염화칼슘, 4.0 밀리미터의 KCl, 10 mM 트리스 / 말레 산 또는 HEPES를 : 거머리 링어의 솔루션은 다음과 같이 구성됩니다. 7.4으로 산도를 조정합니다.
- 와이어가 부드러운 다크 그레이 마감이 될 때까지 20 분 동안 표백제 소량으로 청소 실버 와이어를 찍기 또는하여 자세로-C1 와이어를 준비합니다. 사용하기 전에 증류수로 와이어를 씻으십시오. 그런 앰프에 연결 마이크로 피펫 홀더에 와이어를 배치합니다.
- 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리의 날카로운 유리 전극을 준비합니다. 전극 저항은 20 MΩ의 주문에 있어야한다.
- 3 M의 아세트산 칼륨 용액을 피펫 찰 및 마이크로 피펫 홀더에의 삽입합니다.
- 세포 외 전극 용으로 다시 팁을 휴식, 상술 한 바와 같이 날카로운 유리 피펫을 준비날카로운 가장자리 근처에 다른 날카로운 피펫을 바르고. 그 다음은 connectives를 찢어지지 않도록 끝을 연마 화재. 플라스틱 세포 전극은 한 전극과 신경 사이 좋은 접촉이로 작동합니다.
- 흡입 용 고무 튜브와 주사기가 장착되어 있습니다 (자세로-C1 와이어) 마이크로 피펫 홀더에 세포 외 기록 전극을 삽입합니다. 적어도 실버 와이어의 수준에 전극에 식염수를 그리는 주사기를 사용합니다.
- 특정 신호 기록 장치의 사용 설명서에 따라 하드웨어 (앰프와 자극 절연체) 및 소프트웨어 기록 매개 변수를 설정합니다. 아래에서 설명하는 실험에 사용되는 장비에 대한 세부 정보를 볼 수 Leksrisawat 등. 22을 참조하십시오.
2. 복부 신경절의 해부
- 거머리 링거액과 함께 큰 실리콘 엘라스토머 늘어선 접시에 거머리를 해부하다. 동물은 그 길이 방향으로 할 것이다 늘어 나면복부 신경 코드 (그림 1A 참조)를 제거하는 것이 더 쉽습니다.
- # 10 또는 # 11 크기 메스, 복부 정중선에서 매우 얕은 인하와 함께 세로 절개를합니다. 복부 컷의 중간 2/3rd에 대한 그림 1B에 표시됩니다. 꼬임없이 동물이 완전히 개방되고, 혈액 동 연신 될 때까지 검은 색 스타킹 (복부 혈액 동)을 건드리지 않게하십시오. 이 혈액 동은 복부 정중선을 따라 동물의 길이를 실행합니다. VNC는이 혈관의 내부에 포함된다.
- 피부 닉에 혈액 동 (그림 2) 미세 홍채 가위를 사용하는 동물의 전체 길이를 절단 한 후. 동에서 미세 홍채 가위 중 하나 블레이드 슬립 약간 신경 조직에서 분리 할 수있는 날을 올립니다. 신경 뿌리, 분절 신경 또는 신경 사이의 connectives을 피하면서 동에게 VNC의 길이를 잘라.
- 다음으로 복부 신경 코드의 일부를 제거혈관 뿌리 합류 위치로 원위 뿌리 절단. 복부 신경 코드의 길이를 따라 각 신경절에 대해이 과정을 반복합니다.
- 작은 페트리 접시에 하나 또는 두 개의 신경절의 세그먼트를 전송합니다. 신경 또는 하나의 신경절은 일부 여유와 긴장 고정해야합니다.
- 신경절 아교 칼집이 약간 아교 칼집을 통해 관심의 신경 세포에 impaling 때 주위에 이동하는 신경 세포 기관을 방지하기 위해 뻗어되도록 connectives과 뿌리를 핀. 핀은 뿌리 블랙 부비동 통해 축삭 손상 (도 3)를 최소화하기 위해이 connectives의 중간에 배치해야한다.
- 현미경 준비와 페트리 접시를 놓고 이동을 방지하기 위해 접시의 바닥에 왁스로 고정.
- 조심스럽게 그림 4A와 같이 신경 세포를 확인하기 위해 거울과 빛 콘덴서를 사용하여 광선을 초점 (개략적으로 그림 (b)에 나타낸 바와
- 는 Rz, T, P, 및 N 뉴런의 세포 내 녹화를 만들기 위하여주의 깊게 관심의 세포에 전극의 끝 부분을 배치하고 부드럽게 보조개가 아교 칼집에서 볼 때까지 끝을 내립니다.
- 전극 홀더 또는 조작 (매우 신중하게)되도록를 눌러 그 셀에 전극의 끝 "아빠".
- 활동 전위를 불러 일으키는 세포로 양의 전류 (1-10 NA)의 짧은 펄스 (30 ~ 40 밀리 초)을 주입한다.
3. 복부 신경절 준비에서 배양 된 뉴런
- 소 태아 혈청 (FCS) (도 3)와 L-15를 함유하는 깨끗한 접시 신경절 복부 측면을 핀. 세포 내 녹화를 위해 위의 수행으로 신경이 약간 늘어 지도록 뿌리를 핀. 미세 가위, 닉 한 끝에 아교 캡슐은 다음 아교 캡슐 가로 질러, 캡슐 미만 가위 블레이드 슬립도 5a에 도시 된 바와 같이.
- 15 분 동안 진탕의 요리와 장소에 콜라게나 / 디스 파제 100 μL 나누어지는를 추가합니다. 노출 된 세포 기관 주변의 문화 매체를 이동하여 세포를 검사합니다. 세포가 최소한의 흡입으로 나올 때까지 또 다른 15 분 이상에 대한 통에 세포를 반환합니다.
- 부드럽게 신경절 세포를 추출하는 주사기에 부착 된 피펫을 사용합니다. 이 전지 본체의 직경보다 약간 크도록 사격 피펫 팁 닦아. 성인에서 거머리는 Rz 세포의 경우, 직경이 약 50 ㎛이어야한다.
- 이것은 피펫 내부 나와 세포의 가능성을 감소할수록 필라멘트없이 직경이 다른 피펫의 다양한 준비한다. 치핑에서 팁을 보호하기 위해 바닥에 목화 공을 사용하여 80 % 에탄올 (EtOH로)를 포함하는 병에 피펫을 저장합니다. 세포를 흡입하기 전에 매체 피펫 밖으로 EtOH로 세척해야합니다.
- 효소 처리 후 씻어효소 함유 배 (FCS)와 L-15와 매체를. 관심의 세포를 확인하고 조심스럽게 주사기 (그림 6A)를 잡아 당겨 피펫으로 그립니다. (FCS와 함께) L-15가 포함 된 다른 접시에 흡입 된 세포를 방전.
- 지금까지, 모든 절차는 비 멸균했다. 멸균 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 멸균 페트리 접시 안에 다른 위치에 (FCS와 함께) 멸균 L-15의 3 ~ 4 큰 방울을 넣습니다.
- 그 (것)들을 세척하고 드롭 주위를 불고, 이전에 언급 한 방울 중 하나에 세포를 피펫. 매체의 3 ~ 4 방울에 일련의이 과정을 반복합니다.
- (FCS와 함께) L-15로 가득 깨끗한 배양 접시에 세포를 놓습니다.
- 실온에서 1-24 시간 동안 세포를 품어. 그 후 깨끗한 세포가 도금 될 수있다. 몇 시간 또는의 세포를 떠나 밤새 세포 외 기질은 쉽게 떨어져 온다. 더 이상 프로세스를 생성하는 즉시 세포를 접시.
- 마이크로 웰 디에게 코트에 멸균 기판을 사용하여 쉬하고 실험을 배양하기 전에 (야간) 완전히 건조 할 수 있습니다.
- 접시 코팅 한 후, L-15 배지 소량 후 멸균 수로 가볍게 접시 씻어. FCS없이 L-15 솔루션을 사용하는 것을 기억 세포가 접시를 준수 할 수 있도록 추가되었습니다. 셀은 기판에 접착 한 후 배지를 온화 FCS와 L-15로 변경 될 수있다. 세포가 몇 시간 FCS와 L-15 배지 전환 한 다음, 도금 후에 사용되는 경우에 필요한 것은 아니다.
- 빠른 시냅스 (그림 6B)를 유도하기 위해 도금시에 서로 옆에 셀을 배치합니다. 뉴런의 짝에 24 시간 측정 생리 활성 후.
- (제 2의 세포 내 전극을 사용하여 쌍을 이루는 세포에서 세포 내 전극과 기록 응답을 통해 한 신경 세포를 자극) 세포의 배양 쌍으로 RP 또는 시냅스 응답을 기록하는 세포 내 전기 생리학 기술을 사용합니다.
- 상술 한 바와 같이 탄성 중합체 줄 지어 접시에 아래 거머리 등의 측면을 핀.
- 절단 된 신경절의 반대편에 뿌리를 한쪽으로 피부 (그림 (b)의 확대도 7a를) 핀 또는 신체의 모든 뿌리 신경절 (그림 7C)에 거머리의 복부 측면에 창을 그대로 벽.
- 감각 세포 (T, P, N) 불에 살짝 같은 세그먼트의 피부에 닿는 연마 된 작은 유리 막대를 사용 중 하나의 안정적인 세포 녹음을 얻은 후. 에서 기록중인 신경 세포가 N 셀이면 더 많은 압력은 피부에 도포 될 필요가있을 것이다. 피부는 핀셋으로 협지되는 경우 대부분의 경우에, N 세포에만 반응 할 것이다. 하나는 피부를 손상 시키거나하는 방식으로 제조를 방해하여 세포 내 레코딩 변위 하듯이 때문에 이들 세포는 마지막 시도되어야한다.
- 하나는해야한다신속하게 충분한 정보와 함께 피부 신경절을 스케치 할 수있는 그 감동을 하나의 특정 신경 세포의 수용 필드를 결정하는 데 사용할 수있는지도. 신경절의 양쪽에 최대한 많은 P 및 T 세포에서 녹음 한 후 N 세포를 시도한다.
- 감각 신경이 주동이 또는 꼬리 방식으로 다음 피부에 인접한 세그먼트의 뿌리 중 connectives 여행을 통해 프로세스가있는 경우에 조사하기 위해,에 관해서 신경 사이의 connectives는 절단 할 수 있고, 수용 필드는 재검토 검출 확산. 수용 분야의 손실이 있었다 경우 기본적으로 하나 검토하고 있습니다.
5. 형광 염료를 주입
- 상술 한 바와 같이 거머리 신경절을 준비합니다.
- 루시퍼 노란색-CH (3.0 %)과 염화 리튬 (300 ㎜)의 용액으로 미세 전극을 입력합니다.
- 설명 된 신경절의 복부 측 또는 감각 세포는 Rz 세포 중 하나를 꿰 뚫기위.
- 15 분의 전극을 통해 음의 전류 (3NA)을 전달하여 셀에 염료를 주입한다. 100 밀리 초에 펄스 지속 시간, 2 Hz에서 주파수를 설정합니다.
- 수은등과 FITC / GFP 필터 세트와 흥분 염료에 의해 염색 채워진 뉴런 시각화.
Representative Results
거머리 신경절에있는 감각 신경의 세포 내 기록은 그림 4C에 도시들은 별개의 전압과 시간의 흔적을 특징으로한다. 건강한 거머리 신경절 세포 휴식 세포막 전위는 -45 -60 MV이다. 전위가 작은 것 (이하 네거티브)되는 경우에 하나의 유리 전극을 변경해야하거나, 전위가 여전히 낮은 경우, 신경 코드의 또 다른 세그먼트로 이동. 작은 진폭 자발적인 활동 전위는 전극은 운동 신경 세포에 있음을 나타낼 수 있습니다. 이 신경절 몸 벽에 발생하면 전류 주입은 신경 세포가 여전히 피부에 붙어있는 근육 중 하나를 innervates 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 고리 건설자의 운동 신경 세포 (AE)는 신경절 (그림 4B)의 복부 측면에 그것은 고리 건설자의 근육을 활성화하여 상승하는 환상 체 (능선 또는 세그먼트)의 원인이됩니다.
감각 세포에 전류를 주입하는 활동 전위를 연상한다도 4c에 도시 한 특성을 가진 파형들. 파형이 다르게 보일 경우는 불균형 다리 또는 오프셋 용량 보정으로 인해 수 있습니다. 하나는 세포 내부 다리의 균형을하는 방법에 대한 자세한 내용은 신호 수집 장치와 함께 제공되는 설명서를 참조해야합니다. 도 4C의 전류 펄스의 시작과 끝에 자극 아티팩트를 주목하라. 이 다리는 균형을 때 유물이 보는 방법입니다.
거머리 신경절에서 뉴런의 차 문화는 접시에 전기 화학적 시냅스를 형성한다. 초기 배양 된 세포의 전기적 특성들은 생체에 정확히 동일하지 않다. 그러나 몇 일 후에 자극은 신경절에 기록 된 것과 거의 구별 할 수 없다. 이것은는 Rz 세포의 한 쌍의 그림 (c)에서 보여줍니다. 문화에 7 시간 후 시냅스 전위의 진폭은 1-2 MV했다. 문화 싸이에서 56 시간 후naptic 전위는 10 MV (그림 6C에서 최고 흔적)보다 더 컸다. 활동 전위의 모양도 문화 56hr 후 변경합니다. 기재된 조건 하에서, 이러한 세포는 몇 일 동안 생존한다.
세포 간 통신은 신경 뿌리 또는 connectives을 자극하고 신경절의 뉴런에서 기록에 의해 설명 될 수있다. 이러한 신경을 자극하는 것은 다른 신경절 세포에 강력한 시냅스 전위 활동 전위를 생성합니다. 그림 (b)의 흔적은 동물에서 제거하고 접시에서 고정했다 신경절에 Retzius 세포에서 기록되었다. 블랙 트레이스에 결합 세포 외 전극인가 드레시 홀드 자극하여 유발시켰다. 자극 전압의 증가는 활동 전위 (빨간색 추적을) 발사 셀을 일으켰습니다. 염료 또는 말 무 과산화 효소 형광 자신의 형태를 연구하는 이들 세포에 주입 할 수있다. 루시퍼 노란색이는 Rz에 주입전극을 통해 음의 전류를 전달하여 신경 세포. 대안.도 9a는 분사가 시작된 직후에 염료를 도시 공기압의 퍼프를 사용하여 염료를 주입하는 것이다. 삼십 분 후에 염료는 이미 신경 뿌리 (그림 9B)으로 확산했다. 염료의 분류는, 애플리케이션에 따라 간극 결합을 통과 할 수있다 예를 들어 작은 분자량의 염료가 전기적 시냅스를 식별하는 데 사용된다.
그림 1. . 복부 거머리 해부 (A) 동물 철저 거머리 식염수로 채워진 엘라스토머 늘어선 접시에 복부 쪽을 고정합니다 (B) 앞쪽에 걸쳐 얕은 절개 :. 후방 축이 중간 선에 바로 옆되어 신경 손상을 방지하기 위해서 코드. 검은 혈액 동 (contaiNS 복부 신경 코드)를 쉽게 볼 수있다. 칼집에 비해 흰색 하나 노출 신경절을 참고. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 블랙 부비동의 해부. 혈관 (화살표) 조심스럽게 복부 신경 코드 (이중 화살표)를 노출 한면에 차단해야한다. 해부 및 녹화 요리 사이에 전송할 때 복부 신경 코드를 조작 할 수있는 핸들로 사용하기 위해 분절 뿌리 주위에 그대로 혈관의 세그먼트를 남겨주세요. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
복부 신경 코드의 그림 3. 격리 된 부분. 분절 뿌리에 남아있는 혈관의 조각에 의해 분절 connectives의 끝에서 복부 신경 코드를 고정은 전기 생리학 기록에 대한 신경을 노출합니다. 신경의 스트레칭 긴장은 하나가 식별 세포 기관을 볼 수 있으며, 날카로운 유리 전극과 아교 시스의 쉬운 침투를 허용 할 것이다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 거머리 신경절 세포 해부학. (A) 이상적으로 Retzius 세포 (R) 및 기타 대형 세포 기관 (P-키를 눌러현미경과 빛 콘덴서가 제대로 설정되어있는 경우 우레은 T-터치, N-통각, AE-환형 건설자)는 명확하게 볼 수 있습니다. (B) 신경절 세포의 개략도. somas의 위치에 약간의 차이로 인해 신경절이 뻗어 긴장된 고정하는 방법으로 각 신경절에 발생합니다. 이러한 뉴런의 소마의 기록 (C) 활동 전위가 특징적인 파형이있다. 이 스파이크는 세포 (전압과 시간의 흔적을 오버레이 사각형 펄스)에 양의 전류를 주입하여 유발 하였다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 개별 세포 기관을 제거하는 신경절을 Desheathing. (A) 아교 시스주의 깊게 관심 손상 세포를 방지하기 위해 신경절 가로 질러해야합니다. 빨간색 선이는 Rz 뉴런의 소마 타격 피하기 위해 컷을 나타냅니다. 칼집을 열면 소화 효소에게 결합 조직의 매트릭스에 액세스 할 수 있습니다. (B) 아교 칼집이 열린 후에 신경절 밖으로 불룩 건강한 세포 기관은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 거머리 신경절에서 뉴런을 배양. (A) 세포가 마이크로 피펫을 사용하여 신경절에서 흡입과 문화 매체를 포함하는 요리로 전송됩니다. (B) 서로 근처에 여러 셀을 배치는 식별 뉴런 사이의 시냅스의 속도를 증가시킬 것이다. 여기에 스투두 개의 뉴런의 MPS는 시냅스를 형성했다. (C) 뉴런 문화 전시 약간 다른 전기적 특성에. 상단 트레이스는 세포가 도금 된 후 인접 셀 7 시간, 56 시간 자극에 의해 유발 된 시냅스 잠재력을 보여줍니다. 바닥 흔적은 직접적는 Rz 셀 중 하나에 전류를 주입함으로써 유발 하였다. 시냅스 전위 진폭의 증가를주의 문화의 56 시간 후 활동 전위 파형을 변경합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 7. 매핑 수용 필드의 거머리 신경절 체벽 준비. (A) 한 가지 방법은 1-3 신경절과 함께 몸 벽의 전체 섹션을 제거하는 것입니다. 여기서 한쪽 뿌리 ㄴ했다EEN 컷과 신경절은 측으로 고정되어 있습니다. (B)는 높은 배율에서 신경절을 고정. (C) 또 다른 방법은 수용 필드를 매핑하는 동안 그대로 신경절에서 몸의 벽과 기록의 작은 창을 만드는 것입니다 . (DG)가 감각 뉴런의 각각은 기계적 자극에 대한 특징적인 응답을 나타낸다. (D) 가벼운 터치가 아니라 P 또는 N 세포의 T 세포 활성을 되살린다. (E) T 세포 반응은 강한에 응답하여 차단 자극, P 세포의 활성화에 방법을 제공. 자극이 강한 N 세포를수록 (FG)가 활성화되고는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
FigurE 8. 거머리 신경절에서 활성을 유발. connectives의 세포 외 자극은 신경 코드에서 시냅스 전달을 조절하는 데 사용된다. (A)가 이것은 connectives 중 하나로 흡입 전극을 부착하고 작은 전압을인가함으로써 수행된다. 날카로운 유리 전극 (화살표) 신경절에 Retzius 셀을 impaling 볼 수 있습니다. (B) 시냅스 전위 (블랙) 뒤에 자극 이슈와 활동 전위 (빨간색)를 표시하는 전압과 시간의 흔적이. 더 보려면 여기를 클릭하십시오 이미지 .
그림 9. 거머리의 신경 세포에 염료를 주입. (A) 루시퍼 노란색은 현재 죽 전달하여 체세포에 주입 할 수있다기록 미세 우. 수은 램프와 FITC 필터 세트는 다음 형광을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. (B) 염료는 Rz으로 확산하고있다는 주사 후 약 30 분 축삭. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
실험이 세트의 목적은 1) 가르치고 전시 세포 내 기록의 기본 원칙을 식별 뉴런과 2) 성인 거머리를 사용하여 이러한 특정 신경 세포 유형에서 발생할 수있는 전기 신호의 특성 모양을 인식하는 것이 었습니다. 이 신경 생리 학적 연구를 위해 거머리를 이용하여 조사의 풍부한 역사는 연구는 신경 회로 및 개발 과정뿐만 아니라 시냅스 수리 및 재생 10시 유전자 조절의 문제를 해결에서 진행되고있다. 신경 조절은 특히 생물 기원 아민의 경로를 통해, 또한 거머리에서 성공적인 연구 방향이었다. 생리 식염수를 통해 신경계의 도파민 및 기타 약물 에이전트를 추가함으로써, 도파민은 의사 결정 문제 (24, 25)를 크롤링 (23)와 모터 패턴에 관련된 신경 네트워크를 변조 것으로 나타났습니다. 이 실험 방법은 바보입니다르 (저렴) 교육 연구소에 변조를 통합 할 수있는 방법, 그리고 식염수의 이온 화장 조정은 네른스트 골드만 지킨 - 카츠 방정식을 가르 칠 수있는 효과적인 방법입니다.
신경절 준비로 성공하기는 신경절 이전 세포 내 전극과 소마를 찌를 시도에 팽팽하게하는 것이 중요합니다. 아교 패킷에 아래로 밀어, 그렇지 않으면 소마 이동합니다. 문화에 신경을 제거하는 신경절을 desheathing 때 제거 될 때 somas가 손상되지 않도록 신경절에 걸쳐 절단 할 때뿐만 아니라, 관심있는 지역을 피하십시오. 또한, 효소의 과도한 배양은 신경 세포를 제거하기에 너무 깨지기 쉬운 존재가 발생할 수 있습니다. 그것은 효소의 각 배치는 자신의 행동에 약간 다르기 때문에 최적의 배양 시간을 달성하기 위해 몇 가지 시행 착오가 필요합니다.
배양 배지를 최적화하기 위해 추가 조사는이 기술을 향상시킬 수 있었다. 바리인슐린, 당, 또는 성장 인자의 존재와 같은 OU에 요인, 문화의 이상 유지 보수를 위해 검사 할 수 있습니다. 세포는는 Rz 세포에서 세로토닌 합성으로 송신기를 합성하는 자신의 능력을 유지하는지 확인하려면, 중립 붉은 얼룩이 세로토닌 프로세스에 라벨을 적용 할 수 있습니다. 부상 및 재생 조직에 또한 미세 아교 침공 부상 후 핵 얼룩 일에 의해 정량화 될 수있다.
이 준비가 재생 및 수리뿐만 아니라 신경 회로를 검사에서 제공하는 많은 혜택을 가지고 있지만, 시냅스의 다양한 수용체 아형의 약물 분자 식별이 완전히 특징되지 않았습니다. 표현 시퀀스 태그 라이브러리는 26 사용할 수 있으며, 의약 거머리의 게놈은 현재 27 조립되고 있지만, 일부 모델 준비에 비해 거머리의 주요 제한은 특정 세포 유형에 선택적 유전자의 게놈을 수정할 수있는 기능입니다. 배아의 t에서그의 제한은 유전자 발현을 조절하는 28 DNA 또는 dsRNA를 주입함으로써 해결되었다. 유전자 총 기술은 최근에 거머리 신경 무척추 넥신 (innexin) 단백질을 표현하기 위해 사용되었다. Hirudo verbana (HVE-inx6)에서 innexin의 식 의약 거머리 29 자궁외 간극 결합의 형성에 충분하다. 의약 거머리 또는 H. 그것은 30이었다로 버베나는 향후 몇 년 동안 생리와 전기 시냅스의 진화에 대한 우리의 이해를 진행해야합니다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
| Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
| Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
| Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
| Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
- Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
- Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. , Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
- Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
- Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).
- Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).
- Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).
- Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Multifunctional pattern-generating circuits. Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).
- Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
- Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
- Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
- Kristan, W. B. The Neurobiology of Swimming in the leech. Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).
- Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
- Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
- Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. , McGill University. (1995).
- Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
- French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
- Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
- Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
- Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
- Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
- Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
- Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407 (2010).
- Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
- Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).
- Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
- Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
