Summary
Bu makale sülükler kullanılarak üç sinir sistemi hazırlıkları anlatmaktadır: Hücre içi kayıt ventral gangliada nöronların, ventral ganglionlar nöronları kültüre ve duyusal alanları haritaya innerve deri bir yama kayıt.
Abstract
Tatlı su sülük, Hirudo medicinalis, nörofizyoloji, neuroethology ve gelişimsel biyoloji alanlarında bilimsel soruları için kullanılan çok yönlü bir model organizmadır. Bu raporun amacı, diğer sinir sistemi hazırlıkları uzmanlığı ile fizyolog için kullanım olacak, ya da çok az veya hiç elektrofizyoloji deneyimi ile biyoloji öğrencilerine bir tek madde haline sülük sistemden deneysel teknikleri konsolide etmektir. Biz ganglion tanımlanan sinirsel devreler gelen hücre kayıt için sülük incelemek nasıl gösterilmektedir. Daha sonra fonksiyonu bilinen tek tek hücreler bir Petri kabındaki kültür edilmesi ganglion ve nasıl kültürde bu nöronlardan kaydetmek için kaldırılabilir şeklini göstermektedir. Sonra duyusal veya motor alanlarını haritalama için kullanılacak innerve deri bir yama nasıl hazırlanacağını gösteriyor. Bu sülük hazırlıklar hala yaygın nöral networ temel elektriksel özelliklerini adreslemek için kullanılırks, davranış, sinaptogenez ve geliştirme. Onlar da nörobilim veya fizyoloji öğretim laboratuvarları için uygun bir eğitim modülü vardır.
Introduction
Sülük hazırlanması tanımlanabilir (duyusal, motor ve hayvanın merkezi sinir sistemi (CNS) içinde arası nöronların fonksiyonu araştırmak için yararlıdır. Sülük nöronların yararlı özelliği eylem potansiyelleri ve biyofiziksel özellikleri şekli için karakteristik olmasıdır belirli bir hücre tipi (örneğin, P, N, T, Rz). Ayrıca nöron hücreler, 45 gün kadar uzun 1,2 olarak onların elektriksel özelliklerini muhafaza ettiği bir uygun ortam içinde kültürlenen hayvan ve kaldırılabilir.
Elektrofizyolojik kayıtları yapmak için öğrenmek için sülük ganglion belirgin bir avantajı hücreleri karakteristik ve güvenilir sağlayan bir desen ganglion düzenlenmiş olmasıdır ganglion ganglion ve hayvandan hayvana farklı hücre tiplerinin belirlenmesi. Eşsiz konumu ve sülük gangliada nöronların morfolojisi gibi erken 1891 3 olarak retzius tarafından kaydedildi. Th Bilgie kimlik bir nöronun fonksiyonu sinir devreleri araştırmak için ve belirli bir hücre tipi ile deneyler yapmak için avantajlıdır. Nedeniyle, bir mikroskopla görülebilir ve somata seçici elektriksel özelliklerini kayıt için mikro elektrod ile kazığa edilebilir bir ganglion içinde nöronların nispeten büyük somata için.
Boyalar ve büyük moleküllerin tek tek hücreler ve yama kelepçe tarafından incelenmiştir kanal özellikleri içine enjekte edilebilir. Çeşitli nöronlarda karakteristik aksiyon potansiyellerinin çeşitli şekillerde doğuran İyonik akımları 4-7 tespit edilmiştir. Inervasyonunun desen ve CNS içindeki bireysel nöronların dallanma araştırmalardan, sinaptik bağlantıları tespit nöronlar 2,8 ile kültür çoğaltılamaz edilmiştir. Sülük gangliyonlarında Çalışmalar whol yanı sıra elektrofizyoloji ile ölçülebilir fonksiyonel devrelerinin gelişimi içgörü sağladıE hayvan davranış çalışmaları. Sülük MSS ayrıca tüm hayvan ve kültür 4-6,9-12 nöronal tamir ve rejenerasyon ile ilgili mekanizmaların araştırılması için değerli bir hazırlık olarak hizmet vermiştir.
Memeli beyinlerinde bu özellikleri ve bireysel tespit nöronların bağlantıları açısından davranışlarını açıklamak için zor bir iştir. Prensip olarak böyle bir sülük gibi daha az karmaşık sistemlerin çalışma yüksek hayvanlarda kullanılan temel mekanizmaları tanımlamak için yardımcı olabilir umut olabilir. Yüzmek desen 13,14 ve kalp ritmini 15 altında yatan kullanılan bağlantıları de sülük karakterize edilmiştir. Hem elektriksel ve kimyasal iletişimi oluşturmak için bazı sülük nöronların yeteneği merak uyandırıcı. Diğer kimyasal olarak tek yönlü, çift yönlü, ancak elektriksel 7 ise bazı bağlantıları iki yönlüdür. Hayvan içinde sinaptik bağlantıları anlama yanı sıra aynı tipik değer yenidenbir kültür çanak bağlantıları e sinaptogenez 16-18 gibi sinaps 19 farmakolojik profil araştırmak için güçlü araçlardır. Burada anlatılan hücre içi kayıt ve stimülasyon teknikleri neuroethology ve geliştirme farmakolojik deneyler ve araştırmalar için bir temel sağlar.
Buna ek olarak, segmental ventral sinir kablosu innerve deri bir yama ile disseke edilebilir. Canlı bir deri yaması ve nöronları korumak için yeteneği ile, duyu açık alanları CNS'de ilgili karın ganglion içinde duyu nöronlarının hücre gövdesi (yani soma) elektrik sinyalleri kayıt ile problanabilir. Böylece tek bir ciltte yürürlüğe değişen derecelerde uygulayarak duyusal uçlarının duyarlılığını değerlendirmek ve açık alanları eşleyebilirler: hafif dokunma, basınç, ve zararlı (ağrılı) 20,21 uyaranlara.
Bu sülük ganglion-cilt hazırlama bir avantajı, bir can anatomik açık alan harita çizmek ve elektriksel tepkiler kaydedilmiş ediliyor kez tanımlanan nöron nöronal süreçleri iz. Aşağıda açıklanan üç sülük deneyler, her akademik laboratuvarlar için bu maliyetli bir öğretim modülü kılan tek bir numune ile birden çok kez tamamlanabilir.
Protocol
1.. Elektrotlar ve Tuzlu Çözüm hazırlanması
- Hayvan kesilmiş önce fizyolojik tuzlu su ve elektrotlar hazırlayın. 115.3 mM NaCI, 1.8 mM CaCl2, 4.0 mM KCI, 10 mM Tris / maleik asit veya HEPES: Leech Ringer çözeltisi aşağıdaki gibidir. PH'ı 7.4 'e ayarlayın.
- Telin pürüzsüz bir koyu gri renge sahip olana kadar 20 dakika boyunca çamaşır suyu küçük bir miktar temizlenmiş bir gümüş tel daldırma ya da bir Ag-Cl tel hazırlayın. Kullanmadan önce distile su ile tel yıkayın. Sonra amplifikatör takılan bir mikropipet tutucu içine tel yerleştirin.
- Bir pipet çektirmenin kullanarak borosilikat cam keskin bir cam elektrot hazırlayın. Elektrot direnci 20 MQ sırasına olmalıdır.
- 3 M potasyum asetat çözeltisi ile pipet dolgu ve mikropipet tutucu içine eklemek.
- Dışı bir elektrot için geri ucunu kırmak, yukarıda açıklandığı gibi keskin bir cam pipet hazırlamakkeskin kenarında keskin bir pipet ovuşturarak. Sonra connectives gözyaşı kalmaması ucu lehçe yangın. Plastik hücre dışı elektrodlar da sürece, elektrot ve sinir arasında iyi bir temas yoktur olarak çalışacaktır.
- Emiş için bir kauçuk tüp ve şırınga ile donatılmıştır (Ag-Cl tel ile) bir mikropipet tutucu içine ekstraselüler kayıt elektrodu takın. En az gümüş tel seviyesine elektrotun içine tuzlu su çekmek için şırınga kullanın.
- Özel sinyal kayıt ünitesi için kılavuzunu takip ederek donanım (amplifikatör ve uyaran izolatör) ve yazılımı kayıt parametrelerini ayarlamak. Aşağıda tarif edilen deneylerde kullanılan ekipman ile ilgili bilgileri görüntülemek için Leksrisawat et al. 22, bkz.
2. Ventral Ganglion Diseksiyon
- Sülük Ringer solüsyonu ile büyük bir silikon elastomer kaplı tabak sülük ayır. Hayvan, uzunlamasına uzatılmış olur ise,ventral sinir kablosu (bkz. Şekil 1A) kaldırmak için daha kolay olacak.
- # 10 veya # 11 boyutu neşter ile, ventral orta hat çok sığ kesintileri ile uzunlamasına bir kesi yapmak. Ventral orta kesim 2/3rd hakkında Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Kırıksız hayvan tamamen açılır ve kan sinüs gerilir kadar siyah çorap (ventral kan sinüs) kesmemeye çalışın. Bu kan sinüs ventral orta hat boyunca hayvanın uzunluğu çalışır. VNC bu damar içinde ihtiva edilmektedir.
- Cilt nick kan sinüs (Şekil 2) ince iris makas kullanımı hayvanın tam uzunlukta kesilmiştir sonra. Sinüsün altında ince iris makas biri bıçak Kayma ve biraz sinir dokusu ayırmak için bıçak yükseltmek. Sinir kökleri, segmental sinirler, ya ganglionlar arasında connectives kaçınarak sinüs VNC uzunlukta kesin.
- Sonraki tarafından ventral sinir kablosu parçası kaldırmakkan damarı kökleri birleştiği yere uzak kesme kökleri. Ventral sinir kablosunun uzunluğu boyunca her bir gangliyon için bu işlemi tekrar edin.
- Daha küçük bir Petri kabı, bir ya da iki gangliyon bir segment aktarın. Ganglion veya tek ganglion bazı bolluğu ile gergin tutturulmuş gerekmektedir.
- Ganglion glial kılıf biraz glial kılıftan ve ilgi nöron içine impaling zaman etrafında hareket nöron hücre gövdeleri önlemek için gergin böylece connectives ve kökleri pin. Pimler kökleri için siyah sinüs içinden ve aksonların hasarı (Şekil 3) en aza indirmek için iki bağlaçlar ortasına yerleştirilmelidir.
- Mikroskop altında hazırlanması ile Petri yerleştirin ve hareket etmesini önlemek için çanak alt balmumu ile sabitleyin.
- Dikkatlice Şekil 4A'da olarak nöronlar görmek için bir ayna ve ışık kondansatör kullanılarak ışık ışınının odak (şematik olarak Şekil 4B'de gösterilen
- Rz, T, P, N ve nöronların hücre içi kayıt yapmak için dikkatli bir şekilde ilgi konusu hücrenin üzerine elektrodun ucu ile hafifçe bir çukur glial kılıf görülür kadar alt ucu.
- Elektrot tutucu veya manipülatör (çok dikkatli) ve böylece dokunun ilgi hücreye elektrot ucu "çıkar".
- Aksiyon potansiyelleri uyandırmak için hücreye pozitif akım (1-10 nA) kısa darbeleri (30-40 msn) enjekte edilir.
3. Ventral Ganglion Hazırlık Kültürleme Nöronlar
- Fetal sığır serumu (FCS) (Şekil 3) ile L-15 ihtiva eden temiz bir tabak içinde ganglia ventral tarafı yukarı Pin. Hücre içi kayıtları için yukarıda yapıldığı gibi ganglionlar biraz gerilir böylece kökleri pin. Ince makas ile, nick bir ucunda glial kapsül, sonra glial kapsül kesen, kapsül altında bir makas bıçak kaymaŞekil 5A'da gösterildiği gibi.
- 15 dakika süre ile bir çalkalama çanağı ve yere kollajenaz / dispaz 100 ul bir kısım ekleyin. Maruz kalan hücre gövdeleri etrafında kültür ortamı hareket hücreleri inceleyin. Hücreler az emilerek dışarı gelene kadar başka bir 15 dakika veya daha uzun süre çalkalayıcıya hücreleri dönün.
- Yavaşça ganglion hücreleri çıkarmak için bir şınngaya bağlanmış bir pipet kullanın. Bu hücre gövdesi çapından biraz daha büyüktür, böylece yangın pipet cila. Yetişkin bir sülük R 'nin hücreleri için, çapı yaklaşık 50 um olmalıdır.
- Bu pipet içindeki yapışma, hücrelerin şansını azaltır olarak bir iplik olmaksızın farklı çaplarda pipetler çeşitli hazırlayın. Yonga arasındaki ipuçları korumak için alt kısmında bir pamuk ile% 80 etanol (EtOH) ihtiva eden bir şişe içinde pipetler saklayın. Hücreleri aspire önce orta ile pipet dışarı EtOH'nin yıkamayı unutmayın.
- Enzim muamelesinden sonra, yıkayınenzim-ihtiva eden 2x (FCS), L-15, orta. Ilgi hücreleri belirlemek ve yavaşça şırınga (Şekil 6A) çekerek pipet içine çekmek. (FCS) ile L-15 içeren başka bir yemeğin içine aspire hücreleri boşaltın.
- Şimdiye kadar, tüm işlemler steril olmayan edildi. Steril bir kaput aşağıdaki adımları uygulayın. Steril bir Petri kabı içinde, farklı yerlerde (FCS) ile steril L-15 3-4 büyük damla yerleştirin.
- Yıkayın damla etrafında üfleme, daha önce adı geçen damla birine hücreleri Pipet. Orta 3 ya da 4 damla seri olarak bu işlemi tekrar edin.
- (FCS), L-15 ile doldurulmuş bir temiz Petri kabındaki hücrelere yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 1-24 saat boyunca inkübe hücreleri. Daha sonra temiz hücreler kaplı olabilir. Birkaç saat veya hücreleri bırakarak bir gece boyunca hücre dışı matris kolayca kapalı gelir. Uzun süreçleri oluşturmak için hemen hücreleri Plate.
- Bir mikro Di kaplamak için steril substrat kullanarak sh ve deneyler kültürleme önce (gece) tamamen kurumasını bekleyin.
- Çanak kaplanmış sonra, L-15 ortamı içinde bir miktar daha sonra steril su ile hafifçe çanak yıkayın. FCS olmadan L-15 çözümü kullanmak unutmayın hücreleri çanak uymak için izin eklendi. Hücreler, alt-tabakaya yapıştırılır sonra ortam yavaşça FCS, L-15 için değiştirilebilir. Hücreler, birkaç saat FCS, L-15 için orta geçiş sonra, kaplama sonrası kullanılacak ise gerekli değildir.
- Hızlı sinaptogenez (Şekil 6B) ikna etmek için kaplama sırasında birbirine hücreleri yerleştirin. Nöronların eşleşmelerde 24 saat ölçü fizyolojik aktivite sonrası.
- (2. hücre içi elektrot kullanarak eşleştirilmiş hücresinden hücre içi bir elektrot ve kayıt yanıtları ile 1 nöron teşvik) hücrelerinin kültüre çiftleri RP veya sinaptik yanıtları kaydetmek içi elektrofizyolojik tekniklerini kullanın.
- Yukarıda tarif edildiği gibi bir elastomer kaplı tabak içinde aşağı sülük dorsal tarafına Pin.
- Kesik ganglion diğer tarafında kökleri ile bir tarafa deri (Şekil 7B'de büyütülmüş Şekil 7A) pim veya vücuda tüm kökleri ile bir ganglion (Şekil 7C) üzerinden sülük ventral bir pencere yapmak sağlam duvar.
- Duyusal hücrelerin (T, P, N) ateş hafifçe aynı segmentte cilde dokunmak cilalı olmuştur küçük bir cam çubuk kullanmak birinde istikrarlı bir hücre içi kayıt alındıktan sonra. Kaydedilmiş olan bir N nöron hücre ise, daha fazla baskı cilde tatbik edilmesi gerekir. Cilt cımbız ile bloke olursa Çoğu durumda, N hücre tek yanıt verir. Bir cilde zarar verebilir veya böyle bir şekilde hazırlanmasını bozarak hücre içi recoding deplase olabilir Bu nedenle bu hücreler, son olarak denenmelidir.
- Bir olmalıdırhızlı yeterli ayrıntıları ile cilt ve ganglion kroki mümkün dokundu biri belirli bir nöron için alıcı alanını belirlemek için kullanılan nerede bir harita. Bir ganglionun her iki yüzüne mümkün olduğu kadar çok T ve P hücrelerinden kayıt sonra N hücreleri deneyin.
- Duyusal nöronlar, rostral ve kaudal bir şekilde ve daha sonra deriye bitişik segmentinde köklerinden dışarı bağlaçlar ile seyahat süreçleri varsa incelemek amacıyla, getirmedi ganglia arasındaki bağlaçları kesilebilir ve açık alanların bir kez daha ele algılama yayıldı. Açık alanda herhangi bir kaybı olmamıştır Temelde tek inceliyor.
5. Floresan Boyalar enjekte
- Yukarıda tarif edildiği gibi bir sülük ganglion hazırlayın.
- Lucifer sarı-CH (% 3.0) ve lityum klorür (300 mM) bir solüsyonu ile bir mikroelektrot doldurun.
- Tarif edildiği gibi ganglion ventral tarafındaki duyusal hücreler ya da Rz hücrelerden birini Impaleyukarıda.
- 15 dakika boyunca elektrot yoluyla negatif akım (3NA) geçirilerek hücre içine boya enjekte edilir. 100 msn darbe süresini ve 2 Hz frekansı ayarlayın.
- Bir cıva lambası ve bir FITC / GFP filtre seti ile heyecan verici boya ile boya dolu nöronlar görselleştirmek.
Representative Results
Sülük ganglionunda sensor nöronlarının hücre içi ikinci kayıtları Şekil 4C'de gösterilen kendi ayrı gerilim-zaman-izleri ile karakterize edilir. Sağlıklı sülük ganglion hücrelerinde dinlenme hücre membran potansiyelinin -45 -60 mV olur. Potansiyelleri daha küçük (daha az negatif) ise bir cam elektrot değiştirmek gerekir, ya da potansiyel hala düşük ise, sinir kablosu başka bir segmente geçmek. Küçük genlikli spontan aksiyon potansiyelleri elektrot bir motor nöron olduğunu gösteriyor olabilir. Bu, ganglion-gövde duvarında olduğu takdirde bir akım enjeksiyon nöron hala deri bağlı kasların her innerve olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Anulusu kurucu motor nöron (AE) ganglion (Şekil 4B) ventral tarafında ve halka kurucu kas aktive ederek yükselmeye halkalarının (sırtlar veya segment) neden olacaktır.
Duyusal hücrelerin içine akım enjekte aksiyon potansiyeli uyandırmak gerekirŞekil 4C'de gösterilen karakteristik dalga şekilleri ile s. Dalga farklı bakarsanız bir dengesiz köprü veya ofset kapasitans tazminat nedeniyle olabilir. Bir hücrenin içindeki köprü dengelemek için nasıl ilgili ayrıntılar için sinyal toplama ünitesi eşlik kılavuzuna danışmalısınız. Şekil 4C'de akım darbelerinin başında ve sonunda uyarıcı eserler dikkat edin. Bu köprü dengeli olduğunda eserler bakmak nasıl.
Sülük ganglion nöronlarının birincil kültürleri çanak elektriksel ve kimyasal sinaps oluşturur. Başlangıçta kültürlenmiş hücrelerinin elektriksel özellikleri de in vivo olarak aynı değildir. Bununla birlikte, birkaç gün sonra darbeleri ganglion kaydedilen olanlardan hemen hemen ayırt edilemez. Bu Rz hücre bir çift Şekil 6C'de gösterilmiştir. Kültür içinde 7 saat sonra sinaptik potansiyellerin genliği 1-2 mV olmuştur. Kültür sy 56 saat sonranaptic potansiyelleri 10 mV (Şekil 6C üst izleri) daha büyük. Aksiyon potansiyelinin şekli de kültürde 56hr sonra değişir. Tarif edilen koşullar altında, bu hücreler, birkaç gün boyunca geçerli değildir.
Hücreler arası iletişim, sinir kökleri veya bağlayıcıları uyarıcı ve ganglion neurons kayıt ile gösterilebilir. Bu sinirleri uyarıcı farklı ganglion hücrelerinin sağlam sinaptik potansiyelleri ve aksiyon potansiyelleri oluşturur. Şekil 8B'de izleri hayvan çıkarılır ve bir çanak içinde tutturulmuş olan bir ganglion bir Retzius hücreden kaydedildi. Siyah iz bağ için hücre dışı bir elektrot ile uygulanan bir eşik altı uyaran tarafından uyarılmış oldu. Uyaran gerilimi artan bir aksiyon potansiyeli (kırmızı iz) yangın hücreyi neden oldu. Boyalar ya da yaban turpu peroksidazı Floresan kendi morfolojisi incelemek için, bu hücre içine enjekte edilebilir. Lucifer sarı bir Rz enjekte edildielektrot boyunca negatif akımı geçirilerek nöron. Alternatif bir. Şekil 9A, enjeksiyon başladıktan kısa bir süre sonra boyayı göstermektedir hava basıncı Puffs kullanılarak boya enjekte etmektir. Otuz dakika sonra, boya zaten sinir kökleri (Şekil 9B) içerisine nüfuz eden. Boya türü uygulamaya bağlıdır boşluk bağlantıları üzerinden geçebilir, örneğin küçük molekül ağırlıklı boyalar elektrik sinaps tanımlamak için kullanılır.
Şekil 1. . Ventral sülük diseksiyonu (A) Hayvan iyice sülük tuzlu su ile dolu bir elastomer astarlı çanak ventral yüzü yukarı tutturulmuş (B) anterior kapsayan sığ bir kesi:. Posterior eksen orta hatta sadece yanal yapılır sinir zarar görmemesi için kord. Siyah kan sinüs (konteynerins ventral sinir kablosu) kolaylıkla görülebilir. Kılıfa göre beyaz bir açıktaki ganglion unutmayın. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Siyah sinüs diseksiyonu. Kan damarı (ok) dikkatle ventral sinir kablosu (çift ok) maruz bir tarafta kesilmelidir. Diseksiyon ve kayıt yemekler arasında aktarma sırasında ventral sinir kablosu işlemek için bir kolu olarak kullanılmak üzere segmental kökleri etrafında sağlam kan damarının kesimleri bırakın. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Ventral sinir kablosu Şekil 3.. İzole bölüm. Segmental kökleri üzerinde kalan kan kap parçaları ile ve segmental eklemlerin uçlarında ventral sinir kablosu bağlantılarını elektrofizyolojik kayıtlar için ganglionlar ortaya koyar. Gangliyon germe bir gergin bir tanımlanabilir hücre organları görmek için izin verir ve keskin bir cam elektrot ile glial kılıf daha kolay nüfuz sağlayacaktır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Sülük ganglion hücre anatomisi. (A) İdeal Retzius hücreleri (R) ve diğer büyük hücre gövdeleri (P-presmikroskop ve ışık kondansatör düzgün ayarlanmış ise ure, T-touch, N-nosiseptif, AE-halka erector) açıkça görülebilir olacaktır. (B) ganglion hücrelerinin şematik görünümü. Mis yere hafif farklılıkları nedeniyle ganglion gergin ve gergin sabitleninceye kadar her ganglion ortaya çıkar. Bu nöronların soma kaydedilen (C) Aksiyon potansiyeli karakteristik dalga şekilleri vardır. Bu ani hücre (gerilim-zaman izlerini bindirilirken kare darbe) içine pozitif akım enjekte tarafından uyarılmış. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 5. Bireysel hücre organları kaldırmak için ganglion Desheathing. (A) glial kılıfdikkatli bir şekilde ilgi zarar hücreleri önlemek için ganglion arasında kesilmelidir. Kırmızı çizgi Rz nöronların soma çarpmamak için bir kesimini göstermektedir. Kılıf Açılış sindirim enzimleri bağ doku matriksinin erişmenizi sağlar. (B) glial kılıf açıldıktan sonra ganglion dışarı şişkin Sağlıklı hücre gövdeleri. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 6,. Sülük gangliyon nöronları kültürlenmesi. (A) Hücreleri bir mikropipet kullanılarak gangliyondan aspire edildi ve kültür ortamı ihtiva eden bir çanak aktarılır. (B) birbirine yakın çok sayıda hücre yerleştirilmesi tanımlanabilir nöronlar arasındaki sinaptogenez oranını artıracaktır. İşte stuİki nöron mps bir sinaps oluşmuştur. (C) Nöronlar kültür sergi biraz farklı elektriksel özellikler de. Üst izleri Hücreler kaplandıktan sonraki bitişik hücre 7 saat ve 56 saat uyararak uyarılmış sinaptik potansiyelleri göstermektedir. Alt izleri doğrudan Rz hücrelerden birine akımını enjekte tarafından uyarılmış. Sinaptik potansiyel genliği artış dikkat ve kültür 56 saat sonra aksiyon potansiyeli dalga değiştirmek. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 7. Eşleme açık alanlar için sülük ganglion-vücut duvarı hazırlanması. (A) bir yaklaşım, 1-3 gangliyon ile birlikte gövde duvarının bütün bir bölümü ortadan kaldırmaktır. Burada, bir tarafta kökleri b vareen kesim ve ganglion tarafına dışarı tutturulmuş edilmiştir. (B) daha yüksek büyütmede ganglion dışarı tutturulmuş. (C) bir başka yaklaşım, açık alan eşleme ise sağlam gangliyonlarından vücut duvarı ve kayıt küçük bir pencere oluşturmak için . (DG), duyusal nöronların her bir mekanik uyarıcıya tepki karakteristik sergiler. (D) bir hafif dokunma, ancak P veya N hücrelerde T hücrelerinde faaliyet uyandırır. (E) T hücresi tepkisi daha güçlü bir tepki olarak kapanır uyaranlar, P hücresinin aktivasyonu yol veriyor. Uyaran güçlü N hücreleri alır gibi (FG) aktive olur. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Figüre 8. sülük ganglion aktivitesi Uyarılmış. bağlaçlar hücre dışı uyarım sinir kablosu sinaptik iletim sürmek için kullanılabilir. (A) Bu bağlaçlar birine bir emme elektrodu bağlamak ve küçük bir gerilim uygulanarak yapılır. Keskin cam elektrot (ok) ganglion bir Retzius hücreyi impaling görülebilir. (B) bir sinaptik potansiyel (siyah), ardından uyaran objeyi ve aksiyon potansiyeli (kırmızı) gösteren Gerilim-time izleri. büyük görmek için buraya tıklayın görüntü .
Şekil 9,. Sülük nöronların içine enjekte boya. (A) Lucifer sarı bir uçtan bir uca geçen akım ile soma enjekte edilebilirkayıt mikroelektrot öf. Bir cıvalı lamba ve FITC filtre set daha sonra floresan görselleştirmek için kullanılabilir. (B) Boya Rz'ye içine dağılmış olan enjeksiyondan sonra yaklaşık 30 dk aksonlar. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Discussion
Bu deney setinin amacı 1) öğretmek ve sergi hücre içi kayıtları temel ilkelerini tanımlanabilir nöronlardan gelen ve 2) yetişkin sülükler kullanılarak bu özel nöronal türlerinden kaynaklanan elektrik sinyallerine karakteristik şekilleri tanımak oldu. Orada nörofizyolojik araştırmalar için sülük kullanan araştırmaların zengin bir tarih ve araştırma sinir devresi ve gelişimi sırasında hem de sinaptik onarım ve rejenerasyon 10 sırasında gen regülasyonu sorularını ele devam etmektedir. Nöromodülasyon, özellikle biyojenik amin yollar aracılığıyla, aynı zamanda sülük başarılı bir araştırma yönünde olmuştur. Tuzlu su çözeltisi ile sinir sistemine dopamin ve diğer farmakolojik ajanlar ekleyerek, dopamin karar verme davranışı 24,25 tarama için 23 ve motor modelleri dahil sinir ağları modüle gösterilmiştir. Bu deneysel yaklaşım, bir ahmak olduğunule (ve ucuz) öğretim laboratuvara modülasyonu dahil yolu, ve tuzlu su çözeltisinin iyonik makyaj ayarlayarak Nernst ve Goldman-Hodgkin-Katz denklemleri öğretmek için etkili bir yoldur.
Ganglion hazırlıkları ile başarılı olmak için, önce ganglion hücre içi bir elektrot ile bir soma kurcalamak için çalışırken gergin olması önemlidir. Glial paket aşağı iterek aksi takdirde soma hareket edecektir. Kültür nöronlar kaldırmak için ganglion desheathing zaman kaldırılır gibi somas zarar değil bu yüzden ganglion kesen Buna ek olarak, ilgi bölge önlemek. Ayrıca, enzimlerin aşırı inkübasyon nöronlar kaldırılması için çok kırılgan olması ile sonuçlanabilir. Bu enzimlerin her parti kendi eylemlerinin biraz farklı olduğu için ideal bir inkübasyon süresi elde etmek için bazı deneme ve yanılma gerektirir.
Kültür ortamını optimize etmek için daha fazla araştırma bu tekniği geliştirmek olabilir. Variinsülin, şeker, ve büyüme faktörlerinin varlığı gibi faktörleri lı, kültürlerin uzun bakım için incelenebilir. Hücreleri, Rz hücrelerinde serotonin sentezi gibi vericileri, sentezleme kapasitelerini muhafaza olmadığını belirlemek için, nötr kırmızı boyama işlemleri serotonerjik etiketlemek için uygulanabilir. Yaralı ve yenileyici dokuya da mikrogliyal işgali bir yaralanma sonrası nükleer lekeleri gün ile tayin edilebilir.
Bu hazırlık rejenerasyon ve onarım hem de sinir devresi incelerken sunmak için çok faydası vardır, ancak, sinapslarda, çeşitli reseptör alt-tiplerinin farmakolojik ve molekül kimlik tam olarak karakterize edilmemiştir. Bir sentezlenmiş dizi etiket kitaplığı 26 mevcuttur, ve tıbbi sülük genomdur 27 monte edilmektedir, ancak örnek preparatları ile karşılaştırıldığında sülük ana sınırlama spesifik hücre tiplerinde seçici gen için genomunu değişime uğratmaya yarayan yeteneğidir. Embriyolar TOnun sınırlama gen ifadesini 28 düzenleyen DNA veya dsRNA'yı enjekte tarafından ele alınmıştır. Gen tabancası tekniği son zamanlarda sülük nöronlarda omurgasız konneksin (innexin) proteinleri ifade etmek için kullanılmıştır. Hirudo verbana (Hve-inx6) bir innexin sentezlenmesi tıbbi sülük 29 ektopik boşluk bağlantıları oluşumu için yeterlidir. Tıbbi sülük veya H. 30 olduğu gibi verbena önümüzdeki birkaç yıl içinde fizyoloji ve elektriksel sinapsların evrim anlayışımızı ilerletmek için emin olabilirsiniz.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
| Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
| Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
| Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
| Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
- Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
- Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. , Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
- Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
- Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).
- Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).
- Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).
- Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Multifunctional pattern-generating circuits. Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).
- Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
- Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
- Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
- Kristan, W. B. The Neurobiology of Swimming in the leech. Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).
- Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
- Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
- Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. , McGill University. (1995).
- Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
- French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
- Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
- Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
- Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
- Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
- Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
- Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407 (2010).
- Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
- Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).
- Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
- Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
