Summary
यह लेख जोंक का उपयोग कर तीन तंत्रिका तंत्र की तैयारी का वर्णन: intracellular रिकॉर्डिंग उदर ganglia में न्यूरॉन्स से, उदर गैन्ग्लिया से संवर्धन न्यूरॉन्स, और संवेदी क्षेत्रों को मैप करने innervated त्वचा के एक पैच से रिकॉर्डिंग.
Abstract
मीठे पानी जोंक, Hirudo medicinalis, Neurophysiology, neuroethology, जीव विज्ञान और विकास के क्षेत्र में वैज्ञानिक सवालों का पता करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक बहुमुखी मॉडल जीव है. इस रिपोर्ट का लक्ष्य अन्य तंत्रिका तंत्र की तैयारी में विशेषज्ञता के साथ physiologists को फायदा नहीं होगा, या कम या कोई इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अनुभव के साथ जीव विज्ञान के छात्रों के लिए है कि एक ही लेख में जोंक प्रणाली से प्रयोगात्मक तकनीकों को मजबूत करने के लिए है. हम नाड़ीग्रन्थि में पहचान तंत्रिका सर्किट से intracellularly रिकॉर्डिंग के लिए जोंक काटना कैसे प्रदर्शित करता है. अगला हम जानते समारोह की व्यक्तिगत कोशिकाओं को एक पेट्री डिश में संवर्धित किया जाना है नाड़ीग्रन्थि, और कैसे संस्कृति में उन न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड करने से हटाया जा सकता है कि कैसे दिखा. तो फिर हम संवेदी या मोटर क्षेत्रों मानचित्रण के लिए प्रयोग की जाने वाली innervated त्वचा के एक पैच तैयार करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है. ये जोंक की तैयारी अभी भी व्यापक रूप से तंत्रिका networ के बुनियादी बिजली के गुणों का पता करने के लिए उपयोग किया जाता हैएस, व्यवहार, synaptogenesis, और विकास. उन्होंने यह भी तंत्रिका विज्ञान या शरीर क्रिया विज्ञान शिक्षण प्रयोगशालाओं के लिए एक उपयुक्त प्रशिक्षण मॉड्यूल हैं.
Introduction
जोंक तैयारी पहचान योग्य (संवेदी, मोटर और जानवर के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर अंतर - न्यूरॉन्स के समारोह की जांच के लिए उपयोगी है. जोंक न्यूरॉन्स की उपयोगी संपत्ति उनके कार्रवाई क्षमता और biophysical गुणों का आकार एक के लिए विशेषता यह है कि सेल प्रकार दिया (यानी पी, एन, टी, RZ). इसके अलावा न्यूरॉन्स कोशिकाओं के रूप में लंबे समय के 45 दिनों 1,2 रूप के लिए उनके बिजली विशेषताओं को बनाए जिसमें एक उपयुक्त माध्यम में पशु और सुसंस्कृत से हटाया जा सकता है.
Electrophysiological रिकॉर्डिंग बनाने के लिए सीखने के लिए जोंक नाड़ीग्रन्थि की एक विशिष्ट लाभ कोशिकाओं विशेषता से और मज़बूती से अनुमति देता है कि एक पैटर्न में नाड़ीग्रन्थि में व्यवस्थित कर रहे हैं कि है नाड़ीग्रन्थि से नाड़ीग्रन्थि करने और जानवर से जानवर के लिए अलग सेल प्रकार की पहचान. अद्वितीय स्थान और जोंक ganglia में न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान के रूप में जल्दी 1891 के रूप में 3 Retzius द्वारा नोट कर रहे थे. वें का ज्ञानई पहचान और एक न्यूरॉन के समारोह तंत्रिका सर्किट की जांच के लिए और एक दिया सेल प्रकार के साथ प्रयोग करने के लिए लाभप्रद है. कारण वे एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ दिखाई दे रहे हैं, और somata चुनिंदा उनके बिजली के गुणों की रिकॉर्डिंग के लिए microelectrodes साथ impaled जा सकता है एक नाड़ीग्रन्थि भीतर न्यूरॉन्स के अपेक्षाकृत बड़े somata के लिए.
रंगों और बड़े अणुओं व्यक्ति की कोशिकाओं और पैच दबाना द्वारा अध्ययन चैनल गुणों में इंजेक्ट किया जा सकता है. विभिन्न न्यूरॉन्स में विशेषता कार्रवाई क्षमता की विभिन्न आकृतियों को जन्म दे कि आयोनिक धाराओं 4-7 पहचान की गई है. स्फूर्तिदान के पैटर्न और सीएनएस के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की शाखाओं में बंटी में जांच से, synaptic कनेक्शन की पहचान की न्यूरॉन्स 2,8 के साथ संस्कृति में reproduced किया गया है. जोंक ganglia में अध्ययन whol के साथ के साथ ही इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी से मापा जा सकता है कि कार्यात्मक सर्किट के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान की हैई पशुओं के व्यवहार के अध्ययन. जोंक सीएनएस भी पूरी पशुओं में और संस्कृति 4-6,9-12 में neuronal मरम्मत और उत्थान के साथ शामिल तंत्र की जांच के लिए एक मूल्यवान तैयारी के रूप में सेवा की है.
स्तनधारी दिमाग में यह गुण और व्यक्तिगत पहचान की न्यूरॉन्स के कनेक्शन के मामले में व्यवहार की व्याख्या करने के लिए एक चुनौतीपूर्ण काम है. सिद्धांत रूप में ऐसा ही एक जोंक के रूप में कम जटिल प्रणालियों का अध्ययन उच्च पशुओं में इस्तेमाल बुनियादी तंत्र को परिभाषित करने के लिए मदद कर सकता है उम्मीद कर सकते हैं. तैरने के पैटर्न 13,14 और दिल 15 की rhythmicity आबाद जो उपयोग किया जाता है कि कनेक्शन अच्छी तरह से जोंक में विशेषता किया गया है. दोनों बिजली और रासायनिक संचार फार्म के लिए कुछ जोंक न्यूरॉन्स की क्षमता पेचीदा है. दूसरों यूनिडायरेक्शनल रासायनिक लेकिन द्विदिश विद्युत 7 रहे हैं, जबकि कुछ कनेक्शन द्विदिश हैं. पशु भीतर synaptic कनेक्शन को समझना है और साथ ही एक ही typ पुनः बनानेएक संस्कृति डिश में कनेक्शनों की ई synaptogenesis 16-18 के साथ ही synapses 19 के औषधीय रूपरेखा की जांच के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं. यहाँ वर्णित intracellular रिकॉर्डिंग और उत्तेजना तकनीक neuroethology और विकास में औषधीय assays और अनुसंधान के लिए एक आधार प्रदान करते हैं.
इसके अलावा, कमानी उदर तंत्रिका कॉर्ड innervated त्वचा के एक पैच के साथ विच्छेदित किया जा सकता है. जिंदा त्वचा के एक पैच और न्यूरॉन्स रखने की क्षमता के साथ, संवेदी ग्रहणशील क्षेत्रों सीएनएस में संबंधित पेट नाड़ीग्रन्थि भीतर संवेदी न्यूरॉन्स सेल शरीर (यानी सोमा) से विद्युत संकेतों की रिकॉर्डिंग के द्वारा जांच की जा सकती. जिससे एक त्वचा पर बल की डिग्री बदलती लगाने से संवेदी अंत की संवेदनशीलता का आकलन और ग्रहणशील क्षेत्रों नक्शा कर सकते हैं: हल्के स्पर्श, दाब, और हानिकारक (दर्दनाक) 20,21 उत्तेजनाओं.
इस जोंक नाड़ीग्रन्थि त्वचा तैयारी का एक लाभ यह है कि एक सीएn anatomically ग्रहणशील क्षेत्र नक्शा तैयार और बिजली प्रतिक्रियाएं दर्ज किया जा रहा है एक बार पहचान न्यूरॉन को neuronal प्रक्रियाओं का पता लगा. नीचे वर्णित तीन जोंक प्रयोगों सभी शैक्षणिक प्रयोगशालाओं के लिए यह एक लागत प्रभावी शिक्षण मॉड्यूल बनाता है जो एक भी नमूना, के साथ कई बार पूरा किया जा सकता है.
Protocol
1. इलेक्ट्रोड और नमकीन घोल तैयार करना
- पशु विच्छेदित होने से पहले शारीरिक खारा और इलेक्ट्रोड तैयार. 115.3 मिमी NaCl, 1.8 मिमी 2 CaCl, 4.0 मिमी KCl, 10 मिमी Tris / Maleic एसिड या HEPES: जोंक घंटी समाधान निम्न में से होते हैं. 7.4 पीएच को समायोजित करें.
- तार एक चिकनी डार्क ग्रे खत्म कर दिया है जब तक 20 मिनट के लिए ब्लीच की एक छोटी राशि में एक साफ चांदी के तार की सूई या द्वारा एक एजी सीएल तार तैयार करें. उपयोग करने से पहले आसुत जल के साथ तार धो लें. फिर एम्पलीफायर में प्लग कि एक micropipette धारक में तार जगह है.
- एक विंदुक खींचने का उपयोग borosilicate ग्लास का एक तेज कांच इलेक्ट्रोड तैयार करें. इलेक्ट्रोड प्रतिरोध 20 MΩ के आदेश पर किया जाना चाहिए.
- 3 एम पोटेशियम एसीटेट समाधान के साथ विंदुक backfill और micropipette धारक में में डालें.
- एक बाह्य इलेक्ट्रोड के लिए से वापस टिप तोड़ने, ऊपर वर्णित के रूप में एक तेज कांच विंदुक तैयारतेज धार के पास एक और तेज पिपेट मलाई. तो फिर यह संयोजियों आंसू नहीं करता तो टिप पॉलिश आग. प्लास्टिक कोशिकी इलेक्ट्रोड भी रूप में लंबे समय इलेक्ट्रोड और तंत्रिका के बीच अच्छे संपर्क के रूप में वहाँ काम करेंगे.
- सक्शन के लिए एक रबर ट्यूब और सिरिंज के साथ लगाया जाता है कि (एजी सीएल तार) के साथ एक micropipette धारक में कोशिकी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड डालें. कम से कम चांदी के तार के स्तर पर इलेक्ट्रोड में खारा आकर्षित करने के लिए सिरिंज का प्रयोग करें.
- अपने विशिष्ट संकेत रिकॉर्डिंग इकाई के लिए मार्गदर्शन का पालन करके हार्डवेयर (एम्पलीफायर और उत्तेजना अलगाने) और रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर मानकों सेट. नीचे वर्णित प्रयोगों में इस्तेमाल उपकरणों पर विवरण देखने के लिए Leksrisawat एट अल. 22 देखें.
2. उदर नाड़ीग्रन्थि विच्छेदन
- जोंक घंटी समाधान के साथ एक बड़े सिलिकॉन elastomer लाइन पकवान में जोंक काटना. पशु यह अनुलंबीय जाएगा फैला है तोउदर तंत्रिका कॉर्ड (चित्रा 1 ए देखें) को हटाने के लिए आसान हो सकता है.
- # 10 या # 11 आकार स्केलपेल के साथ, उदर midline में बहुत उथले कटौती के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाते हैं. उदर कटौती के बीच 2/3rd बारे चित्रा 1 बी में दिखाया गया है. सनक के बिना पशु पूरी तरह से खोला जाता है और रक्त साइनस बढ़ाया है जब तक काला मोजा (उदर रक्त साइनस) के माध्यम से कटौती नहीं की कोशिश करें. यह रक्त साइनस उदर midline के साथ जानवर की लंबाई चलाता है. Vnc यह रक्त वाहिनियों की अंदर निहित है.
- त्वचा निक के लिए रक्त साइनस (चित्रा 2) ठीक परितारिका कैंची का उपयोग पशु की पूरी लंबाई में कटौती किए जाने के बाद. साइनस के तहत ठीक परितारिका कैंची की एक ब्लेड स्लिप और थोड़ा तंत्रिका ऊतक से अलग करने के लिए ब्लेड बढ़ा. तंत्रिका जड़ों, कमानी नसों, या गैन्ग्लिया के बीच संयोजियों से परहेज करते हुए साइनस VNC की लंबाई में कटौती.
- अगला, द्वारा उदर तंत्रिका कॉर्ड का हिस्सा हटानेरक्त वाहिनियों की जड़ों में मिलती है, जहां के लिए बाहर जड़ें काटने. उदर तंत्रिका कॉर्ड की लंबाई के साथ प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं.
- एक छोटे पेट्री डिश के लिए एक या दो गैन्ग्लिया के एक खंड स्थानांतरण. ganglia या एकल नाड़ीग्रन्थि कुछ सुस्त साथ तना हुआ टिकी जाने की जरूरत है.
- नाड़ीग्रन्थि glial म्यान से थोड़ा glial म्यान के माध्यम से और ब्याज के न्यूरॉन में impaling जब घूम से न्यूरॉन सेल शरीर को रोकने के लिए बढ़ाया है ताकि संयोजियों और जड़ों पिन. पिन जड़ों के लिए काला साइनस के माध्यम से और axons की क्षति (चित्रा 3) को कम से कम दो संयोजियों के बीच में रखा जाना चाहिए.
- खुर्दबीन के नीचे तैयारी के साथ पेट्री डिश प्लेस और आंदोलन को रोकने के लिए डिश के तल पर मोम के साथ सुरक्षित.
- ध्यान चित्रा -4 ए के रूप में न्यूरॉन्स को देखने के लिए एक दर्पण और प्रकाश कंडेनसर का उपयोग कर प्रकाश बीम फोकस (रेखाचित्र के रूप में चित्रा 4 बी में दिखाया गया है
- RZ, टी, पी, और एन न्यूरॉन्स की एक intracellular रिकॉर्डिंग करने के लिए, ध्यान से ब्याज की सेल से अधिक इलेक्ट्रोड की नोक प्लेस और धीरे एक डिंपल glial म्यान में देखा जाता है जब तक टिप कम है.
- इलेक्ट्रोड धारक या जोड़तोड़ (बहुत ध्यान से) इतना है कि ठोकर ब्याज की सेल में इलेक्ट्रोड टिप "चबूतरे".
- कार्रवाई क्षमता पैदा करने के लिए सेल में सकारात्मक वर्तमान (1-10 एनए) के कम दालों (30-40 मिसे) इंजेक्षन.
3. वेंट्रल गेंग्लियोन तैयारी से संवर्धन न्यूरॉन्स
- भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) (चित्रा 3) के साथ एल -15 युक्त एक स्वच्छ थाली में गैन्ग्लिया उदर पक्ष पिन अप. Intracellular रिकॉर्डिंग के लिए ऊपर किया रूप गैन्ग्लिया थोड़ा फैला रहे हैं कि इतना जड़ों पिन. ठीक कैंची के साथ, निक एक छोर पर glial कैप्सूल, तो glial कैप्सूल में कटौती, कैप्सूल के तहत एक कैंची ब्लेड पर्चीचित्रा 5A में दिखाया गया है.
- 15 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर पकवान और जगह के लिए Collagenase / Dispase के 100 μl विभाज्य जोड़ें. उजागर सेल शरीर के चारों ओर संस्कृति मीडिया हिल द्वारा कोशिकाओं की जांच. कोशिकाओं न्यूनतम चूषण के साथ बाहर आ गए जब तक एक और 15 मिनट या उससे अधिक समय के लिए एक प्रकार के बरतन कोशिकाओं लौटें.
- धीरे नाड़ीग्रन्थि से कोशिकाओं को निकालने के लिए एक सिरिंज से जुड़ी एक विंदुक का प्रयोग करें. यह सेल शरीर व्यास की तुलना में थोड़ा बड़ा है कि इतनी आग पिपेट टिप पॉलिश. एक वयस्क जोंक में Rz कोशिकाओं के लिए, व्यास लगभग 50 माइक्रोन होना चाहिए.
- इस पिपेट अंदर चिपके कोशिकाओं की संभावना कम हो जाती है के रूप में एक रेशा के बिना विभिन्न व्यास के साथ pipettes की एक किस्म तैयार करें. छिल से सुझावों की रक्षा करने के लिए नीचे एक कपास की गेंद का उपयोग कर 80% इथेनॉल (EtOH) युक्त एक बोतल में pipettes स्टोर. कोशिकाओं aspirating से पहले मध्यम साथ विंदुक के बाहर EtOH धोने के लिए याद रखें.
- एंजाइम उपचार के बाद, बाहर धोनेएंजाइम युक्त 2x (एफसीएस) के साथ एल -15 के साथ मध्यम. ब्याज की कोशिकाओं की पहचान और धीरे सिरिंज (चित्रा 6A) खींच कर पिपेट में उन्हें आकर्षित. (एफसीएस) के साथ एल -15 में शामिल है जो एक और डिश में aspirated कोशिकाओं निर्वहन.
- अब तक, सभी प्रक्रियाओं गैर बाँझ थे. एक बाँझ हुड में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन. एक बाँझ पेट्री डिश के अंदर विभिन्न स्थानों पर (एफसीएस) के साथ बाँझ एल 15 के 3-4 बड़े बूँदें रखें.
- उन्हें धोने के लिए ड्रॉप में चारों ओर उन्हें उड़ाने से पहले उल्लेख किया बूंदों में से एक में कोशिकाओं पिपेट. मध्यम से 3 या 4 बूँदें में श्रृंखला में इस दोहराएँ.
- (एफसीएस) के साथ एल -15 से भरा एक स्वच्छ पेट्री डिश में कोशिकाओं की जगह.
- कमरे के तापमान पर 1-24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. बाद में साफ कोशिकाओं चढ़ाया जा सकता है. कुछ घंटों या के लिए कोशिकाओं छोड़ने करके रातोंरात बाह्य मैट्रिक्स आसानी से उतर आता है. अब प्रक्रियाओं उत्पन्न करने के लिए तुरंत कोशिकाओं थाली.
- एक microwell di कोट करने के लिए बाँझ सब्सट्रेट का उपयोग श और यह प्रयोगों संवर्धन से पहले (रातोंरात) पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति देते हैं.
- पकवान लेपित किया गया है के बाद, एल -15 माध्यम की एक छोटी राशि के साथ फिर बाँझ पानी के साथ धीरे पकवान धोने और. एफसीएस बिना एल -15 समाधान का उपयोग करने के लिए याद रखें कोशिकाओं पकवान का पालन करने की अनुमति देने के लिए गयी. कोशिकाओं सब्सट्रेट का पालन किया है के बाद मध्यम धीरे एफसीएस साथ एल 15 को बदला जा सकता है. कोशिकाओं के कुछ ही घंटों एफसीएस साथ एल 15 को मध्यम स्विचन तो, चढ़ाना के बाद इस्तेमाल किया जाए तो आवश्यक नहीं है.
- तेजी से synaptogenesis (चित्रा 6B) उत्पन्न करने के लिए चढ़ाना के समय में एक दूसरे के बगल कोशिकाओं रखें. न्यूरॉन्स की pairings में 24 घंटा उपाय शारीरिक गतिविधि के बाद.
- (एक 2 intracellular इलेक्ट्रोड का उपयोग बनती सेल से एक intracellular इलेक्ट्रोड और रिकॉर्ड प्रतिक्रियाओं के माध्यम से 1 न्यूरॉन उत्तेजित) कोशिकाओं की सुसंस्कृत जोड़े में आरपी या synaptic प्रतिक्रियाओं को दर्ज करने के लिए intracellular electrophysiological तकनीकों का प्रयोग करें.
- ऊपर वर्णित के रूप में एक elastomer लाइन डिश में नीचे जोंक पृष्ठीय पक्ष पिन.
- कटे नाड़ीग्रन्थि के दूसरे पक्ष पर जड़ों के साथ एक तरफ त्वचा (चित्रा 7B में बढ़ाया चित्रा 7A,) पिन या शरीर के लिए सभी जड़ों के साथ एक नाड़ीग्रन्थि (चित्रा 7C) पर जोंक के उदर पहलू पर एक खिड़की बना बरकरार दीवार.
- संवेदी कोशिकाओं (टी, पी, एन) आग हल्के से एक ही खंड में त्वचा को छूने के लिए पॉलिश किया गया है कि एक छोटे से गिलास छड़ी का उपयोग में से एक में एक स्थिर intracellular रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के बाद. से दर्ज किया जा रहा न्यूरॉन एक एन सेल है तो अधिक दबाव त्वचा पर लागू करने की आवश्यकता होगी. त्वचा चिमटी के साथ pinched है अगर ज्यादातर मामलों में, एन सेल ही जवाब देंगे. एक त्वचा को नुकसान या इस तरीके से तैयारी परेशान द्वारा intracellular recoding विस्थापित हो सकता है के रूप में इस कारण से इन कोशिकाओं को आखिरी कोशिश की जानी चाहिए.
- एक होना चाहिएजल्दी से पर्याप्त पर्याप्त विवरण के साथ त्वचा और नाड़ीग्रन्थि स्केच करने में सक्षम है कि छुआ एक एक विशेष न्यूरॉन के लिए ग्रहणशील क्षेत्र का निर्धारण किया जा सकता है, जहां से एक नक्शा. एक नाड़ीग्रन्थि के दोनों किनारों पर यथासंभव अधिक से अधिक टी और पी कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग के बाद एन कोशिकाओं का प्रयास करें.
- संवेदी न्यूरॉन्स एक विजय - स्तम्भ या दुम ढंग से और फिर त्वचा के लिए आसपास के क्षेत्र में जड़ें बाहर संयोजियों यात्रा के माध्यम से प्रक्रियाओं है कि अगर आपके पास जांच करने के लिए, के संबंध में गैन्ग्लिया के बीच संयोजियों काटा जा सकता है और ग्रहणशील क्षेत्रों reexamined पता लगाने के प्रसार. ग्रहणशील क्षेत्र में किसी भी हानि हुई है, तो बुनियादी तौर पर एक जांच कर रही है.
5. फ्लोरोसेंट रंजक इंजेक्शन लगाने
- ऊपर वर्णित के रूप में एक जोंक नाड़ीग्रन्थि तैयार करें.
- लूसिफ़ेर पीले सीएच (3.0%) और लिथियम क्लोराइड (300 मिमी) के एक समाधान के साथ एक microelectrode भरें.
- वर्णित के रूप में नाड़ीग्रन्थि के उदर पक्ष पर संवेदी कोशिकाओं या Rz कोशिकाओं की एक कोंचनाऊपर.
- 15 मिनट के लिए इलेक्ट्रोड के माध्यम से नकारात्मक वर्तमान (3nA) पारित करके सेल में डाई इंजेक्षन. 100 मिसे के लिए नाड़ी की अवधि और 2 हर्ट्ज आवृत्ति सेट करें.
- एक पारा दीपक और एक FITC / GFP फिल्टर सेट के साथ रोमांचक डाई से डाई से भरे न्यूरॉन्स कल्पना.
Representative Results
जोंक नाड़ीग्रन्थि में संवेदी न्यूरॉन्स से intracellular रिकॉर्डिंग चित्रा 4C में दिखाया गया है उनके अलग वोल्टेज समय निशान की विशेषता है. स्वस्थ जोंक नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं में आराम कर रही कोशिका झिल्ली संभावित -45 -60 के लिए एम वी है. क्षमता छोटे (कम नकारात्मक) हैं तो एक गिलास इलेक्ट्रोड में परिवर्तन होना चाहिए, या संभावित अभी भी कम है, तो तंत्रिका कॉर्ड के दूसरे खंड पर चलते हैं. छोटे आयाम के साथ सहज कार्रवाई क्षमता इलेक्ट्रोड एक मोटर न्यूरॉन में है कि संकेत मिल सकता है. इस नाड़ीग्रन्थि शरीर दीवार में होता है एक मौजूदा इंजेक्शन न्यूरॉन अभी भी त्वचा से जुड़ी मांसपेशियों के किसी भी innervates निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वलय निर्माता मोटर न्यूरॉन (एई) नाड़ीग्रन्थि (चित्रा 4 बी) के उदर पक्ष पर है और यह वलय निर्माता मांसपेशियों को सक्रिय करने की वृद्धि करने annuli (लकीरें या वर्ग) का कारण होगा.
संवेदी कोशिकाओं में वर्तमान इंजेक्शन लगाने के कार्य क्षमता पैदा करना चाहिएचित्रा 4C में दिखाया विशेषता waveforms के साथ है. Waveforms अलग देखें तो यह एक असंतुलित पुल या ऑफसेट समाई मुआवजा के कारण हो सकता है. एक एक सेल के अंदर पुल कैसे संतुलन के लिए पर जानकारी के लिए संकेत अधिग्रहण इकाई के साथ जुडा हुआ है कि मैनुअल से परामर्श करना चाहिए. चित्रा 4C में वर्तमान दालों की शुरुआत और अंत में उत्तेजना कलाकृतियों सूचना है. इस पुल संतुलित है जब कलाकृतियों कैसे लग रहे है.
जोंक नाड़ीग्रन्थि से न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों पकवान में बिजली और रासायनिक synapses के रूप में. प्रारंभ में संवर्धित कोशिकाओं के विद्युत गुणों वे विवो में हैं बिल्कुल के रूप में ही नहीं हैं. हालांकि कुछ दिनों के बाद उद्यमी नाड़ीग्रन्थि में दर्ज उन से लगभग अप्रभेद्य हैं. इस Rz कोशिकाओं की एक जोड़ी के साथ चित्रा 6C में प्रदर्शन किया है. संस्कृति में 7 घंटे के बाद synaptic क्षमता के आयाम 1-2 एम वी था. संस्कृति एसवाई में 56 घंटे के बादnaptic क्षमता 10 एम वी (चित्रा 6C में शीर्ष निशान) से बड़ा थे. संभावित कार्रवाई का आकार भी संस्कृति में 56hr के बाद बदल जाता है. वर्णित शर्तों के तहत इन कोशिकाओं को कई दिनों के लिए व्यवहार्य हैं.
कहनेवाला संचार तंत्रिका जड़ों या संयोजियों उत्तेजक और नाड़ीग्रन्थि में न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. इन उत्तेजक नसों अलग नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं में मजबूत synaptic क्षमता और कार्रवाई क्षमता उत्पन्न करता है. चित्रा 8B में निशान जानवर से हटा दिया है और एक थाली में बाहर टिकी किया गया था कि एक नाड़ीग्रन्थि में एक Retzius सेल से दर्ज किए गए. काला ट्रेस संयोजी के लिए एक बाह्य इलेक्ट्रोड के साथ लागू एक subthreshold उत्तेजना के द्वारा पैदा किया गया था. उत्तेजना वोल्टेज बढ़ाने से एक कार्य क्षमता (लाल ट्रेस) आग में सेल का कारण बना. रंगों या घोड़े की मूली peroxidase फ्लोरोसेंट उनकी आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इन कोशिकाओं में इंजेक्ट किया जा सकता है. लूसिफ़ेर पीले एक Rz में इंजेक्ट किया गया थाइलेक्ट्रोड के माध्यम से एक नकारात्मक मौजूदा गुजर द्वारा न्यूरॉन. एक वैकल्पिक. चित्रा 9A इंजेक्शन शुरू हुआ बाद शीघ्र ही डाई से पता चलता है हवा के दबाव के कश का उपयोग डाई इंजेक्षन है. तीस मिनट बाद डाई पहले ही तंत्रिका जड़ों (चित्रा 9B) में दूर तक फैला हुआ था. डाई के प्रकार, आवेदन पर निर्भर करता है अंतराल जंक्शनों के माध्यम से पारित कर सकते हैं कि जैसे छोटे आणविक वजन रंजक विद्युत synapses की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है.
चित्रा 1. . उदर जोंक विच्छेदन (ए) पशु अच्छी तरह से जोंक खारा से भरा एक elastomer लाइन पकवान में उदर पक्ष टिकी है (बी) पूर्वकाल फैले उथले चीरा:. पीछे अक्ष midline के लिए सिर्फ पार्श्व किया जाता है तंत्रिका को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए कॉर्ड. काला रक्त साइनस (जो contaiएनएस उदर तंत्रिका कॉर्ड) आसानी से देखा जा सकता है. म्यान की तुलना में सफेद है कि एक उजागर नाड़ीग्रन्थि नोट. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. काले साइनस के विच्छेदन. रक्त वाहिका (तीर) को ध्यान से उदर तंत्रिका कॉर्ड (डबल तीर) का पर्दाफाश करने के लिए एक तरफ कटौती की जानी चाहिए. विच्छेदन और रिकॉर्डिंग व्यंजन के बीच स्थानांतरित जब उदर तंत्रिका कॉर्ड हेरफेर करने के लिए संभाल के रूप में उपयोग के लिए कमानी जड़ों के आसपास बरकरार रक्त वाहिनियों के क्षेत्रों को छोड़ दें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
उदर तंत्रिका कॉर्ड के चित्रा 3. पृथक अनुभाग. कमानी जड़ों पर शेष रक्त वाहिका टुकड़े करके और कमानी संयोजियों के सिरों पर उदर तंत्रिका कॉर्ड लगाए electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए गैन्ग्लिया को उजागर करता है. गैन्ग्लिया के खींच तना हुआ एक पहचान योग्य सेल शरीर को देखने के लिए अनुमति देता है और एक तेज कांच इलेक्ट्रोड के साथ glial म्यान का एक आसान प्रवेश की अनुमति होगी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. जोंक नाड़ीग्रन्थि के सेलुलर शरीर रचना. (ए) आदर्श रूप में Retzius कोशिकाओं (नि.) और अन्य बड़े सेल निकायों (पी प्रेसमाइक्रोस्कोप और प्रकाश कंडेनसर ठीक तरह से स्थापित कर रहे हैं ure, टी स्पर्श, एन nociceptive, एई वलय निर्माता) स्पष्ट रूप से देखा जा सकेगा. (बी) नाड़ीग्रन्थि में कोशिकाओं के योजनाबद्ध देखें. SOMAS के स्थान में मामूली अंतर के कारण नाड़ीग्रन्थि फैला है और तना हुआ टिकी है कैसे करने के लिए प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि में घटित होगा. इन न्यूरॉन्स की सोमा से दर्ज (सी) लड़ाई क्षमता विशेषता waveforms है. इन spikes सेल (वोल्टेज समय निशान overlaying वर्ग पल्स) में सकारात्मक वर्तमान इंजेक्शन लगाने के द्वारा पैदा किया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5. व्यक्ति सेल निकायों को दूर करने के नाड़ीग्रन्थि Desheathing. (ए) glial म्यानध्यान से ब्याज के हानिकारक कोशिकाओं से बचने के लिए नाड़ीग्रन्थि भर में कटौती की जानी चाहिए. लाल रेखा Rz न्यूरॉन्स की सोमा मार से बचने के लिए एक कट इंगित करता है. म्यान खुलने पाचक एंजाइम संयोजी ऊतक मैट्रिक्स तक पहुँच देता है. (बी) glial म्यान खोल दिया गया है के बाद नाड़ीग्रन्थि से बाहर उभड़ा स्वस्थ कोशिका निकायों. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 6. जोंक नाड़ीग्रन्थि से संवर्धन न्यूरॉन्स. (ए) कक्ष एक micropipette का उपयोग नाड़ीग्रन्थि से aspirated और संस्कृति मीडिया वाले एक डिश के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. (बी) एक दूसरे के पास कई कोशिकाओं रखकर पहचान योग्य न्यूरॉन्स के बीच synaptogenesis की दर में वृद्धि होगी. यहाँ स्टूदो न्यूरॉन्स के सांसदों एक synapse गठन किया है. (सी) न्यूरॉन्स संस्कृति प्रदर्शनी थोड़ा अलग बिजली के गुणों में. शीर्ष निशान कोशिकाओं चढ़ाया गया के बाद आसन्न सेल 7 घंटा और 56 घंटा उत्तेजक द्वारा पैदा synaptic क्षमता दिखा. नीचे निशान सीधे Rz कोशिकाओं में से एक में मौजूदा इंजेक्शन लगाने के द्वारा पैदा किया गया. Synaptic संभावित आयाम में वृद्धि के नोट और संस्कृति में 56 घंटे के बाद कार्रवाई संभावित तरंग में बदल जाते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 7. मानचित्रण ग्रहणशील क्षेत्रों के लिए जोंक नाड़ीग्रन्थि शरीर दीवार तैयारी. (ए) एक दृष्टिकोण 1-3 गैन्ग्लिया के साथ साथ शरीर दीवार का एक पूरा खंड को दूर करने के लिए है. यहां एक तरफ जड़ों ख हैeen कटौती और नाड़ीग्रन्थि बाहर की ओर टिकी किया गया है. (बी) एक उच्च बढ़ाई नाड़ीग्रन्थि बाहर टिकी. (सी) एक और दृष्टिकोण एक ग्रहणशील क्षेत्र मानचित्रण, जबकि बरकरार गैन्ग्लिया से शरीर दीवार और रिकॉर्ड में एक छोटी सी खिड़की बनाने के लिए है . (डीजी) संवेदी न्यूरॉन्स की हर एक यांत्रिक प्रोत्साहन के लिए एक विशेषता प्रतिक्रिया दर्शाती है. (डी) एक हल्के स्पर्श लेकिन नहीं पी या एन कोशिकाओं में टी कोशिकाओं में गतिविधि उदाहरण भी देते हैं. (ई) टी सेल प्रतिक्रिया को मजबूत करने के लिए प्रतिक्रिया में बंद हो जाता है उत्तेजनाओं, पी सेल की सक्रियता के लिए रास्ता दे रही है. प्रोत्साहन मजबूत एन कोशिकाओं हो जाता है (FG) सक्रिय हो जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Figurई 8. जोंक नाड़ीग्रन्थि में गतिविधि पैदा की. संयोजियों के बाह्य उत्तेजना तंत्रिका कॉर्ड में synaptic प्रसारण ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (क) इस संयोजियों में से एक के लिए एक चूषण इलेक्ट्रोड संलग्न और एक छोटा सा वोल्टेज लगाने के द्वारा किया जाता है. तेज कांच इलेक्ट्रोड (तीर) नाड़ीग्रन्थि में एक Retzius सेल impaling देखा जा सकता है. (बी) एक synaptic क्षमता (काला) के बाद प्रोत्साहन विरूपण साक्ष्य और एक संभावित कार्रवाई (लाल) दिखा वोल्ट समय निशान. बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें छवि .
चित्रा 9. जोंक न्यूरॉन्स में डाई इंजेक्शन. (ए) लूसिफ़ेर पीले वर्तमान अपरोक्ष गुजर द्वारा सोमा में इंजेक्ट किया जा सकता हैरिकॉर्डिंग microelectrode ऊ. एक पारा दीपक और FITC फिल्टर सेट तो प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (बी) डाई Rz में दूर तक फैला दिया है इंजेक्शन के बाद लगभग 30 मिनट axons. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Discussion
प्रयोगों के इस सेट का उद्देश्य 1) को पढ़ाने और प्रदर्शन intracellular रिकॉर्डिंग के मौलिक सिद्धांतों पहचान योग्य न्यूरॉन्स से और 2) वयस्क जोंक का उपयोग विशेष रूप से इन neuronal प्रकार से पैदा कर सकते हैं कि विद्युत संकेतों की विशेषता आकृतियों को पहचान करने के लिए किया गया था. वहाँ neurophysiological जांच के लिए जोंक का उपयोग कर जांच की एक समृद्ध इतिहास है और अनुसंधान तंत्रिका circuitry और विकास के दौरान और साथ ही synaptic मरम्मत और उत्थान 10 के दौरान जीन विनियमन के सवालों के समाधान में चल रही है. Neuromodulation, विशेष रूप से biogenic amine रास्ते के माध्यम से, यह भी जोंक में एक सफल शोध दिशा किया गया है. खारा समाधान के माध्यम से तंत्रिका तंत्र के लिए डोपामाइन और अन्य औषधीय एजेंटों को जोड़ कर, यह डोपामाइन निर्णय लेने व्यवहार 24,25 रेंगने के लिए 23 और मोटर पैटर्न में शामिल तंत्रिका नेटवर्क modulates कि दिखाया गया है. इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक भोला आदमी हैLe (और सस्ती) शिक्षण प्रयोगशाला में मॉडुलन शामिल करने का रास्ता है, और खारा समाधान के आयनिक श्रृंगार एडजस्ट नेर्न्स्ट और गोल्डमैन है Hodgkin-Katz समीकरणों को पढ़ाने के लिए एक कारगर तरीका है.
नाड़ीग्रन्थि तैयारी के साथ सफल होने के लिए यह नाड़ीग्रन्थि पिछले एक intracellular इलेक्ट्रोड के साथ एक सोमा प्रहार करने का प्रयास करने के लिए तना हुआ होना बहुत जरूरी है. Glial पैकेट पर नीचे धक्का जब अन्यथा सोमा कदम होगा. संस्कृति के लिए न्यूरॉन्स को दूर करने के लिए नाड़ीग्रन्थि desheathing जब वे निकाल रहे हैं के रूप में SOMAS क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं तो नाड़ीग्रन्थि पार काटने जब इसके अलावा, ब्याज के क्षेत्र से बचें. इसके अलावा, एंजाइमों में अत्यधिक ऊष्मायन न्यूरॉन्स हटा दिया जाना भी कमजोर किया जा रहा है में हो सकता है. यह एंजाइमों के प्रत्येक बैच उनके कार्यों में थोड़ा अलग है क्योंकि एक आदर्श ऊष्मायन समय हासिल करने के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता है.
संस्कृति मीडिया अनुकूलन करने के लिए आगे की जांच के लिए इस तकनीक में सुधार सकता है. वारीइंसुलिन, शक्कर, या वृद्धि कारकों की उपस्थिति के रूप में ous कारकों, संस्कृतियों के लंबे समय तक रखरखाव के लिए जांच की जा सकती है. कोशिकाओं Rz कोशिकाओं में सेरोटोनिन संश्लेषण के रूप में ट्रांसमीटरों, synthesize करने के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखने के लिए तय अगर, तटस्थ लाल धुंधला serotonergic प्रक्रियाओं लेबल करने के लिए लागू किया जा सकता है. घायल और regenerating ऊतकों को भी microglial आक्रमण एक चोट के बाद परमाणु दाग दिनों द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
इस तैयारी उत्थान और मरम्मत के साथ ही तंत्रिका circuitry की जांच में की पेशकश करने के कई फायदे हैं हालांकि, synapses पर विभिन्न रिसेप्टर subtypes के औषधीय और आणविक पहचान पूरी तरह से नहीं किया गया विशेषता है. एक व्यक्त अनुक्रम टैग पुस्तकालय 26 उपलब्ध है, और औषधीय जोंक जीनोम वर्तमान में 27 इकट्ठा किया जा रहा है, लेकिन कुछ मॉडल तैयारी की तुलना में जोंक में मुख्य सीमा विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में चयनात्मक जीनों के लिए जीनोम को संशोधित करने की क्षमता है. भ्रूण टी मेंउसकी सीमा जीन अभिव्यक्ति 28 को विनियमित करने के लिए डीएनए या dsRNA इंजेक्शन लगाने के द्वारा संबोधित किया गया है. जीन बंदूक तकनीक हाल ही में जोंक न्यूरॉन्स में दब्बू connexin (innexin) प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Hirudo verbana (hve-inx6) से एक innexin की अभिव्यक्ति औषधीय जोंक 29 में अस्थानिक अंतराल जंक्शनों के गठन के लिए पर्याप्त है. औषधीय जोंक या एच. यह 30 के रूप में थे verbena अगले कुछ वर्षों में शरीर विज्ञान और विद्युत synapses के विकास की हमारी समझ अग्रिम करने के लिए यकीन है.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
| Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
| Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
| Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
| Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
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