Summary
מאמר זה מתאר שלוש הכנות מערכת עצבים באמצעות עלוקות: הקלטה תאית מהנוירונים בגרעיני הגחון, culturing נוירונים מגרעיני הגחון, והקלטה מתיקון של עור מעוצבבים למפה שדות חושיים.
Abstract
העלוקה המים המתוקים, Hirudo medicinalis, הוא אורגניזם מודל צדדי כי נעשה שימוש כדי לענות על שאלות מדעיות בתחומים של נוירופיזיולוגיה, neuroethology, וביולוגיה התפתחותית. מטרת דו"ח זה היא לבסס את ניסיוני בטכניקות ממערכת העלוקה למאמר אחד שיהיה שימוש לפיזיולוגים עם מומחיות בהכנות מערכת עצבים אחרות, או לסטודנטים לביולוגיה עם ניסיון אלקטרופיזיולוגיה קטן או לא. אנו מדגימים כיצד לנתח את העלוקה להקלטת intracellularly ממעגלים עצביים שזוהו בגנגליון. הבא אנו מראים כיצד תאים בודדים של פונקציה ידועה ניתן להסיר מהגנגליון להיות מתורבת בצלחת פטרי, ואיך להקליט מאלו נוירונים בתרבית. ואז אנחנו מדגימים כיצד להכין פיסת עור מעוצבבים לשמש למיפוי שדות חושיים או מוטוריים. הכנות עלוקה אלה עדיין נמצאים בשימוש נרחב לטיפול בתכונות חשמליות בסיסיות של רשתות תקשורת עצביותKS, התנהגות, synaptogenesis, ופיתוח. הם גם מודול הכשרה מתאים למעבדות הוראת מדעי המוח או פיזיולוגיה.
Introduction
הכנת העלוקה היא שימושית חוקר את הפונקציה של זיהוי, מוטורי (חושית ובין תאי עצב במערכת העצבים המרכזי של בעלי החיים (CNS). הרכוש שימושי של נוירונים עלוקה הוא שהצורה של פוטנציאל הפעולה שלהם ומאפייני biophysical אופייניות עבור נתנו סוג התא ניתן להסיר (כלומר P, N, T, Rz). נוירונים יתר על כן מבעלי החיים והתרבית במדיום מתאים שבו התאים לשמור על המאפיינים החשמליים שלהם במשך זמן רב ככל 45 ימים 1,2.
יתרון בולט של הגנגליון העלוקה ללימוד איך לעשות קלטות אלקטרו הוא שתאים אופייני ובאמינות מסודר בגנגליון בצורה שמאפשרת זיהוי של סוגי תאים שונים מהגנגליון לגנגליון ומבעלי החיים לבעלי חיים. המיקום והמורפולוגיה של תאי עצב בגרעיני עלוקה הייחודיים צוינו על ידי Retzius כבר 1891 3. ידע של הזהות אלקטרוני ותפקוד של הנוירון הוא יתרון עבור חוקרים מעגלים עצביים ועל ביצוע ניסויים בסוג תא נתון. בשל somata הגדול יחסית של תאי העצב בתוך הגנגליון הם נראים עם מיקרוסקופ לנתח, וsomata יכול להיות משופד באופן סלקטיבי עם microelectrodes להקלטת התכונות החשמליים שלהם.
צבעים ומולקולות גדולות יהיו ניתן להזריק לתוך תאים בודדים ומאפייני ערוץ שנחקרו על ידי מהדק תיקון. זרמים יוניים שיוצרים צורות השונות של פוטנציאל הפעולה האופייני בתאי עצב שונים זוהו 4-7. מחקירות בדפוס של עצבוב והסתעפות של נוירונים בודדים בתוך מערכת העצבים המרכזית, הקשרים סינפטיים שוחזרו בתרבות עם נוירונים שזוהו 2,8. מחקרים בגרעיני העלוקה סיפקו תובנה הפיתוח של מעגלים פונקציונליים שניתן למדוד עם אלקטרופיזיולוגיה, כמו גם עם וולדואר התנהגות בעלי חיים לימודים. CNS העלוקה כיהן גם כהכנה חשובה לחקר מנגנונים מעורבים עם תיקון עצבי והתחדשות בכל בעלי החיים ובתרבות 4-6,9-12.
במוחם של יונקים הוא משימה מרתיעה כדי להסביר את ההתנהגות במונחים של התכונות וקשרים של נוירונים שזוהו פרט. באופן עקרוני אפשר לקוות שהמחקר של מערכות מורכבות פחות כגון העלוקה יכול לעזור להגדיר את המנגנונים בסיסיים המשמשים בבעלי חיים גבוהים יותר. הקשרים המשמשים שעומדים בבסיס דפוס לשחות 13,14 וקצביות של הלב 15 היו מאופיינים גם בעלוקה. היכולת של נוירונים מסוימים עלוקה כדי ליצור שתי תקשורת החשמלית וכימית היא מסקרן. קשרים חלקם דו כיוונית ואילו אחרים הם חד כיווני כימיים אבל כיוונית חשמלי 7. הבנת הקשרים סינפטיים בתוך בעלי החיים, כמו גם ליצור מחדש את אותו typדואר של חיבורים בצלחת תרבות הם כלים רבי עוצמה לחקירת synaptogenesis 16-18, כמו גם פרופיל תרופתי של סינפסות 19. טכניקות ההקלטה וגירוי תאיים המתוארות כאן לספק בסיס למבחנים תרופתיים ומחקר בneuroethology ופיתוח.
בנוסף, חוט עצב הגחון המגזרי יכול להיות גזור עם פיסת עור מעוצבבים. עם היכולת לשמור על פיסת עור ותאי העצב בחיים, יכולים להיות נחקר שדות פתוחים חושיים על ידי הקלטת אותות חשמליים מהגוף התא (כלומר סומה) של נוירונים חושיים בתוך הגנגליון בטן המתאים במערכת העצבים המרכזית. וכך אפשר להעריך את הרגישות של הסופים חושיים על ידי יישום בדרגות שונות של כוח על העור ולמפות שדות פתוחים: מגע קל, לחץ, ורעיל (כואב) גירויים 20,21.
יתרון של הכנת עור הגנגליון עלוקה זו הוא כי ca אחדn לצייר אנטומית את מפת השדה פתוחה ולעקוב אחר התהליכים עצביים לנוירון זיהה מייד את תגובות החשמל מתועדות. שלושה ניסויי העלוקה מתוארים להלן כולם יכולים להיות סיימו מספר פעמים עם דגימה אחת, מה שהופך את מודול הוראה זו עלות אפקטיבית למעבדות אקדמיות.
Protocol
1. הכנת אלקטרודות ותמיסת מלח הפתרון
- הכן תמיסת מלח ואלקטרודות פיסיולוגיות לפני החיה גזור. הפתרון של העלוקה רינגר מורכב מהפעולות הבאות: 115.3 mM NaCl, 1.8 מ"מ CaCl 2, 4.0 מ"מ KCl, 10 מ"מ טריס / חומצת maleic או HEPES. התאם את ה-pH 7.4.
- הכן את חוט Ag-Cl על ידי טבילת חוטי כסף ניקו לכמות קטנה של אקונומיקה ל20 דקות או עד לחוט יש לסיים אפור כהה חלק. לשטוף את החוט במים מזוקקים לפני השימוש. לאחר מכן הנח את החוט לתוך בעל micropipette המתחבר למגבר.
- הכן אלקטרודת זכוכית חדה של זכוכית בורוסיליקט באמצעות חולץ פיפטה. התנגדות אלקטרודה צריכה להיות על סדר 20 MΩ.
- לגבות את פיפטה עם 3 פתרון אצטט M אשלגן ולהכניס בלתוך מחזיק micropipette.
- לאלקטרודה תאית להכין פיפטה זכוכית חדה כפי שתואר לעיל, לשבור את הקצה לאחור על ידישפשוף אחר פיפטה חדה ליד הקצה החד. אז אפטור ללטש את הקצה, כך שזה לא לקרוע את connectives. אלקטרודות תאי פלסטיק יעבדו גם כל עוד יש קשר טוב בין האלקטרודה והעצב.
- הכנס את האלקטרודה ההקלטה תאית לבעל micropipette (עם חוט Ag-Cl) שמצוידת בצינור גומי ומזרק לשאיבה. השתמש במזרק לצייר מלוח לתוך האלקטרודה לפחות לרמה של חוט הכסף.
- הגדר את החומרה (מגבר ומבודד גירוי) ופרמטרי הקלטת תוכנה על ידי ביצוע המדריך ליחידת הקלטת אות הספציפית שלך. ראה Leksrisawat et al. 22 כדי להציג פרטים על ציוד המשמשים בניסויים שתוארו להלן.
2. הגחון גנגליון Dissection
- לנתח את העלוקה בצלחת גדולה מרופד אלסטומר סיליקון עם הפתרון של העלוקה רינגר. אם בעל החיים נמתח longitudinally זהיהיה קל יותר להסיר את חוט עצב הגחון (ראה איור 1 א).
- עם 10 # או # 11 אזמל גודל, לעשות חתך אורכי עם חתכים רדודים מאוד בקו אמצע הגחון. כ 2/3rd אמצע לחתוך הגחון מוצג באיור 1 ב. נסה לא לחתוך את הגרב השחור (סינוס דם הגחון) עד שהחיה נפתחה באופן מלא וסינוסים הדם נמתח ללא סטיות. סינוס דם זו מפעיל את אורכו של בעל החיים לאורך קו האמצע הגחון. VNC הוא הכיל בתוכו של כלי דם זה.
- לאחר העור נחתך לכל אורכו של בעל החיים להשתמש במספרי איריס הקנס לכינוי סינוס הדם (איור 2). Slip להב אחד איריס המספריים בסדר תחת סינוס ומעט להעלות את הלהב כדי להפריד אותו מרקמת העצב. חותכים את הסינוס האורך של VNC, תוך הימנעות שורשי עצבים, עצבים מגזרי, או connectives בין הגרעינים.
- בשלב בא, להסיר חלק מעצב בחוט הגחון על ידיחיתוך שורשי דיסטלי למקום שבי כלי הדם מצטרפים לשורשים. חזור על תהליך זה עבור כל הגנגליון לאורכו של חוט עצב הגחון.
- העבר את הקטע של גרעיני אחד או שתיים לצלחת פטרי קטנה יותר. הגרעינים או גנגליון אחד צריך להיות מוצמדים מתוח עם קצת רפוי.
- הצמד את connectives ושורשים כך נדן גליה הגנגליון נמתח מעט כדי למנוע את גופי תא נוירון לנוע סביב כאשר impaling דרך נדן גליה ואל תוך תא העצב של עניין. צריכה להיות ממוקמות הסיכות דרך סינוס השחור לשורשים ובאמצע שני connectives כדי למזער את הנזק של האקסונים (איור 3).
- מניחים את צלחת פטרי עם הכנה מתחת למיקרוסקופ ולאבטח אותו עם שעווה בתחתית המנה, כדי למנוע תנועה.
- תתמקד בזהירות את אלומת האור באמצעות מראה וקבל אור כדי לראות את הנוירונים כמו באיור 4 א (מוצג באופן סכמטי באיור 4
- כדי להפוך את ההקלטה תאית של Rz, T, P, ונוירונים N, הנח בזהירות את קצה האלקטרודה מעל התא של עניין ובעדינות להוריד את הקצה עד גומה נתפס בנדן גליה.
- הקש על בעל אלקטרודה או מניפולטור (בזהירות רבה), כך ש" אבא "קצה האלקטרודה לתא של עניין.
- הזרק פולסים קצרים (30-40 אלפיות שנייה) של זרם חיובי (1-10 NA) לתוך התא לעורר פוטנציאל פעולה.
3. נוירונים Culturing מגחון גנגליון ההכנה
- הצמד את הצד הגחוני הגרעינים בצלחת נקייה המכילה L-15 עם סרום עוברי עגל (FCS) (איור 3). הצמד את השורשים כך שגרעיניהם מעט מתוחים כפי שנעשה לעיל עבור הקלטות תאיים. עם מספריים עדינים, ניק כמוסת גליה בקצה אחד, להחליק להב מספריים אחת מתחת לכמוסה, ולאחר מכן חצה את הקפסולה גליהכפי שמוצג באיור 5 א.
- הוספת 100 aliquot μl של Collagenase / Dispase לצלחת ומניחים על שייקר ל15 דקות. בחן את התאים על ידי העברת התקשורת בתרבות סביב גופי תא החשופים. להחזיר את התאים לייקרו לעוד דקות 15 או יותר עד שהתאים לצאת עם יניקה מינימאלית.
- השתמש פיפטה מצורפת מזרק כדי לחלץ בעדינות תאי גנגליון. אש ללטש קצה פיפטה כך שהוא מעט גדול יותר מקוטר גוף תא. לתאי Rz בעלוקה מבוגר, הקוטר צריך להיות כ 50 מיקרומטר.
- להכין מגוון של טפטפות עם קטרים שונים ללא חוט להט כמו זה מקטין את הסיכויים של תאי דבק בתוך פיפטה. אחסן את טפטפות בבקבוק המכיל 80% אתנול (EtOH) באמצעות כדור צמר גפן בתחתית כדי להגן על הטיפים מסתתים. זכור לשטוף את EtOH מתוך פיפטה עם מדיום לפני aspirating תאים.
- לאחר טיפול אנזים, לשטוף החוצהבינוני עם L-15 (עם FCS) 2x המכיל אנזים. זהה את התאים של עניין ובעדינות למשוך אותם לתוך פיפטה ידי משיכת המזרק (איור 6 א). פריקת התאים להישאף לתוך צלחת אחרת המכילה L-15 (עם FCS).
- עד עכשיו, כל ההליכים היו לא סטרילי. בצע את השלבים הבאים במנדף סטרילי. הנח 3-4 טיפות גדולות של L-15 סטרילי (עם FCS) במיקומים שונים בתוך צלחת פטרי סטרילית.
- פיפטה את התאים לתוך אחד את הטיפות לפני שהוזכרו, נושבת סביבם בטיפה לשטוף אותם. חזור על פעולה זו בסדרה ב 3 או 4 טיפות של מדיום.
- מקום תאים בצלחת פטרי נקייה מלאה L-15 (עם FCS).
- דגירה התאים עבור 1-24 שעה בטמפרטורת חדר. לאחר מכן יכולים להיות מצופים התאים נקיים. מאת עוזב את התאים לכמה שעות או לילה המטריצה תאית יורדת בקלות. פלייט התאים באופן מיידי כדי ליצור תהליכים ארוכים יותר.
- השתמש במצע סטרילי למעייל di microwell sh ולאפשר לו להתייבש לחלוטין (לילה) לפני culturing ניסויים.
- לאחר הצלחת כבר מצופה, לשטוף את הצלחת בעדינות עם מים סטריליים ולאחר מכן עם כמות קטנה של מדיום L-15. זכור להשתמש בפתרון L-15 ללא FCS נוספו כדי לאפשר לתאים לדבוק הצלחת. הבינוני ניתן לשנות בעדינות כדי L-15 עם FCS אחרי התאים יש דבק למצע. אם התאים הם לשמש כמה שעות לאחר ציפוי, אז מיתוג הבינוני עד L-15 עם FCS אינו הכרחי.
- מקם את התאים סמוכים זה לזה בעת ציפוי כדי לגרום synaptogenesis המהירה (איור 6). לאחר פעילות פיזיולוגית 24 מדד שעות בזיווגים של נוירונים.
- השתמש בטכניקות אלקטרו תאיים להקליט RP או תגובות הסינפטי בזוגות בתרבית של תאים (לעורר נוירון 1 עד תגובות האלקטרודה ושיא תאית מהתא לזווג באמצעות אלקטרודה תאית 2).
- הצמד את צד גב העלוקה למטה בצלחת מרופדת אלסטומר כפי שתואר לעיל.
- הצמד את העור לצד אחד עם שורשים בצד השני של הגנגליון הכרות האחר (איור 7 א, מוגדלים באיור 7 ב) או להפוך את חלון בהיבט הגחון של העלוקה מעל הגנגליון (איור 7C) עם כל השורשים לגוף קיר שלם.
- לאחר קבלת הקלטה תאית יציבה באחד מתאי החישה (T, P, N) להשתמש במוט זכוכית קטן שכבר אש מלוטשת כדי לגעת בעור באותו הקטע באורח קל. אם נוירון מוקלט מהוא תא N אז לחץ יותר יצטרך להיות מיושם על העור. ברוב המקרים, תא N רק להגיב אם העור הוא צבט עם פינצטה. מסיבה זו יש לנסות תאים אלה האחרונים כאחד עלול לגרום נזק לעור או לעקור את הקידוד מחדש תאיים על ידי הפרעה להכנה בצורה כזאת.
- אחד צריך להיותתוכל לשרטט את העור וגנגליון עם פרטים די מספיק מהר, כי מפה של שבו נגע בם ניתן להשתמש כדי לקבוע את השדה פתוח לנוירון מסוים. לאחר הקלטה מכמה T ו-P תאים ככל האפשר משני צידי גנגליון לנסות תאי N.
- על מנת לבחון אם יש העצב סנסורי תהליכים שעוברים דרך connectives באופן מקורי או הזנב ולאחר מכן את השורשים במגזר הצמוד לעור, ניתן לחתוך connectives בין הגרעינים והשדות פתוחים מחדש לגבי התפשטות של זיהוי. בעיקרון אחד בוחן אם חלה ירידה כלשהי בשדה פתוח.
5. הזרקת פלורסנט צבעים
- הכן הגנגליון עלוקה כפי שתואר לעיל.
- מלא microelectrode עם פתרון של צהוב-CH לוציפר (3.0%) וליתיום כלוריד (300 מ"מ).
- לדקור את אחד מתאי חישה או תאי Rz בצד הגחון של גנגליון כפי שתוארלעיל.
- הזרק צבע לתוך התא על ידי העברת זרם שלילי (3nA) באמצעות אלקטרודה ל15 דקות. הגדר את משך הדופק ל100 אלפית שניים ואת התדירות עד 2 הרץ.
- דמיינו את הנוירונים צבע מלא על ידי מרגש לצבוע עם מנורת כספית ומערכת סינון FITC / ה-GFP.
Representative Results
הקלטות תאית מתא העצב חושי בגנגליון העלוקה מתאפיינות עקבות מתח זמנם ברורות שמוצגים באיור 4C. פוטנציאל קרום תא נח בתאי הגנגליון עלוקה בריאים הוא -45 ל-60 mV. אם פוטנציאלים הם (פחות שליליים) קטנים אחד צריך לשנות את אלקטרודת הזכוכית, או אם הפוטנציאל הוא עדיין נמוך, לעבור לחלק אחר של חוט העצב. פוטנציאל פעולה ספונטני עם משרעת קטנה עשוי להצביע על כך שהאלקטרודה היא בהנוירון מוטורי. אם זה קורה בקיר הגנגליון גוף הזרקה נוכחית יכולה לשמש כדי לקבוע אם תא העצב מעצבב את כל השרירים עדיין מחוברים לעור. נוירון ספינאה annulus המוטורי (AE) הוא בצד הגחון של גנגליון (איור 4) וזה יגרום לannuli (רכסים או מגזרים) לעלות על ידי הפעלת שריר ספינאה annulus.
הזרקה נוכחית לתאי חישה צריכה לעורר פוטנציאל פעולהים עם צורות הגל האופייניים שמוצגים באיור 4C. אם הגל נראה שונה זה יכול להיות בגלל גשר לא מאוזן או פיצוי קיבול לקזז. יש להתייעץ במדריך שמלווה את יחידת רכישת אות לקבלת פרטים על איך לאזן את הגשר בתוך תא. שים לב לחפצי הגירוי בתחילת והסיום של פולסים הנוכחיים באיור 4C. כך החפצים נראים כאשר הגשר הוא מאוזן.
תרבויות עיקריות של נוירונים מהגנגליון העלוקה יוצרות סינפסות חשמליות וכימיות בצלחת. בתחילה את התכונות חשמליות של התאים בתרבית הם לא בדיוק אותו דבר כמו שהם in vivo. עם זאת, לאחר כמה ימי הדחפים הם כמעט שאין להבחין בין אלו שנרשמו בגנגליון. זו באה לידי הביטוי באיור 6C עם זוג תאי Rz. לאחר 7 שעות בתרבות משרעת של פוטנציאלים סינפטיים הייתה 1-2 mV. לאחר 56 שעות בסאי תרבותפוטנציאלי naptic היו גדולים יותר מאשר 10 mV (עקבות עליונה באיור 6C). צורתו של פוטנציאל הפעולה משתנה גם לאחר 56hr בתרבות. בתנאים שתוארו תאים אלה הם בת קיימא במשך כמה ימים.
תקשורת בין תאית ניתן להדגים על ידי גירוי שורש עצבים או connectives והקלטה מתא העצב בגנגליון. גירוי עצבים אלה יוצר פוטנציאל חזק סינפטי ופוטנציאל פעולה בתאי הגנגליון שונים. עקבות באיור 8B נרשמו מתא Retzius בגנגליון שהוסר מהחיה והצמיד את בצלחת. העקבות שחורות מעוררות על ידי גירוי התת מיושם עם אלקטרודה תאית לחיבור. הגדלת מתח הגירוי גרמה לתא לירות פוטנציאל פעולה (זכר אדום). ניתן להזריק ניאון צבעים או peroxidase צנון סוס לתוך תאים אלה ללמוד המורפולוגיה שלהם. הצהוב לוציפר הוזרק לRzנוירון על ידי העברת זרם שלילי באמצעות אלקטרודה. אלטרנטיבה היא להזריק את הצבע באמצעות נשיפות של לחץ אוויר. איור 9 א מציג את צבען זמן קצר לאחר ההזרקה התחילה. שלושים דקות לאחר מכן לצבוע כבר מתפזר לתוך שורשי עצבים (איור 9 ב). הסוג של צבע תלוי ביישום, צבעי משקל מולקולריים לדוגמא קטנות שיכול לעבור דרך צמתים פער משמשים לזיהוי סינפסות חשמליות.
איור 1. . נתיחת עלוקה הגחון () החיה הוא ניצח ביסודיות צד גחון בצלחת מרופדת אלסטומר מלא מלוח עלוקה חתך רדוד פורש הקדמי (ב '):. ציר אחורי נעשה רק לרוחב קו האמצע כדי למנוע נזק לעצבים כבל. סינוס הדם השחור (שcontaiNS בקלות ניתן לראות את חוט עצב הגחון). שים לב לגנגליון נחשף אחד שהוא לבן בהשוואה לנדן. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. Dissection של סינוס השחור. כלי הדם (חץ) יש לחתוך בזהירות בצד אחד כדי לחשוף את חוט עצב הגחון (חץ כפול). עזוב את הקטעים של כלי הדם שלמים סביב השורשים מגזרי לשימוש כידית כדי לתפעל את חוט עצב הגחון בעת העברה בין הנתיחה ומנות הקלטה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. סעיף בודד של חוט עצב הגחון. הצמדת חוט עצב הגחון על ידי שברי כלי דם שנותרו על השורשים המגזריות ובקצות connectives המגזרי חושף את הגרעינים עבור קלטות אלקטרו. מתוח מתיחה של הגרעינים מאפשר לאדם לראות את גופי תא הניתנים לזיהוי ויאפשר חדירה קלה יותר של נדן גליה עם אלקטרודת זכוכית חדה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. האנטומיה סלולרית של הגנגליון העלוקה. (א) באופן אידיאלי תאי Retzius (R) וגופים אחרים גדולים תא (P-עיתונותיור, T-Touch, ספינאה N-nociceptive, AE-annulus) יהיה גלוי לעין אם מיקרוסקופ וקבל אור מוגדרים כראוי. (ב ') בתצוגה סכמטית של תאים בגנגליון. הבדלים קלים במיקום של somas יתרחשו בכל גנגליון עקב איך הגנגליון נמתח והצמיד מתוח. יש פוטנציאלי פעולה (ג) נרשמו מסומה של הנוירונים האלה צורות גל אופייניות. קוצים אלה עוררו על ידי הזרקה נוכחית חיובי לתוך התא (הדופק המרובע שכיסה את עקבות מתח פעמית). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. Desheathing הגנגליון להסיר גופי תא בודדים. () נדן גליהיש לחתוך בזהירות מעבר לגנגליון, כדי למנוע פגיעה בתאים של עניין. הקו האדום מציין לחתוך כדי להימנע מפגיעת סומה של הנוירונים Rz. פתיחת הנדן נותנת אנזימי העיכול לגשת למטריצת רקמת חיבור. (ב) גופי תא בריאים הבולטים מחוץ לגנגליון לאחר נדן גליה כבר נפתח. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
תאי איור 6. Culturing נוירונים מהגנגליון העלוקה. () הם להישאף מגנגליון באמצעות micropipette והועברו לצלחת המכילה תקשורת ותרבות. (ב) הצבת מספר תאים סמוכים זה לזה יגדיל את שיעור synaptogenesis בין הנוירונים הניתנים לזיהוי. הנה סטוחברי פרלמנט של שני נוירונים יצרו סינפסה. (C) נוירונים בתערוכת תרבות תכונות חשמליות שונות במקצת. העקבות העליונים להראות פוטנציאלים סינפטיים עוררו על ידי גירוי תא 7 שעות הסמוכות ו56 שעות לאחר התאים היו מצופים. העקבות התחתונה היו מעוררות על ידי הזרקה נוכחית ישירות לתוך אחד תאי Rz. שים לב לעלייה במשרעת פוטנציאל הסינפטי ולשנות בצורת גל פוטנציאל הפעולה לאחר 56 שעות בתרבות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 7. קיר הכנת הגנגליון גוף העלוקה לשדות פתוחים מיפוי. () גישה אחת היא להסיר את הקטע שלם של קיר הגוף יחד עם 1-3 הגרעינים. כאן השורשים בצד אחד יש בלחתוך een וגנגליון כבר ניצח בחוץ בצד. (ב ') ניצח את הגנגליון בהגדלה גבוהה יותר. (C) גישה נוספת היא ליצור חלון קטן בקיר הגוף והשיא מהגרעינים שלמים תוך מיפוי שדה פתוח . (DG) לכל אחד מתאי העצב התחושתיים מפגין תגובה אופיינית לגירוי מכאני. (ד ') במגע קל מעורר פעילות בתאי T, אך לא בתאי P או N. (ה') בתגובת תא T מכבה בתגובה לחזקה יותר גירויים, נותן דרך הפעלה של תא P. כגירוי מקבל תאי N חזקים יותר הופך להיות פעיל (FG). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Figurדואר 8. עורר פעילות בגנגליון העלוקה. גירוי תאי של connectives ניתן להשתמש כדי לנהוג בשידור סינפטי בחוט העצב. (א) הדבר נעשה על ידי הצמדת האלקטרודה יניקה לאחד connectives והחלת מתח קטן. אלקטרודת הזכוכית החדה (חץ) ניתן לראות impaling תא Retzius בגנגליון. (ב) עקבות מתח בזמן מראים את חפץ הגירוי ואחריו הסינפטי פוטנציאלי (שחור) ופוטנציאל פעולה (אדום). לחצו כאן לצפייה גדולה יותר תמונה.
איור 9. הזרקת צבע לתוך הנוירונים עלוקה. () צהוב לוציפר יהיה ניתן להזריק לתוך סומה ידי העברת thro הנוכחיאיכס microelectrode ההקלטה. מנורת כספית ולהגדיר מסנן FITC לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להמחיש את הקרינה. דיי (ב) יש מתפזר לתוך Rz אקסונים על 30 דקות לאחר ההזרקה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
המטרה של קבוצה זו של ניסויים הייתה 1) ללמד ולהציג את עקרונות היסוד של הקלטות תאיים מתא עצב הניתן לזיהוי ו2) להכיר בצורות האופייניות של אותות חשמליים שיכול לנבוע מסוגים עצביים בפרט אלה באמצעות עלוקות מבוגרים. יש היסטוריה עשירה של חקירות באמצעות העלוקה לחקירות נוירופיזיולוגיות ומחקר מתמשך בהתמודדות עם שאלות של מעגלים עצביים וויסות הגנים במהלך התפתחות, כמו גם במהלך תיקון והתחדשות 10 הסינפטי. Neuromodulation, במיוחד דרך מסלולים האמינים ביוגני, הייתה גם כיוון מחקר מוצלח בעלוקה. על ידי הוספת דופמין וסוכנים תרופתיים אחרים למערכת העצבים דרך תמיסת מלח, זה כבר הוכיח כי דופמין מודולציה רשתות עצביות מעורבות ב23 ודפוסים מוטוריים לזחילת התנהגות 24,25 קבלת החלטות. גישה ניסויית זה היא פתיle דרך לשלב אפנון למעבדה ההוראה (ולא יקר), והתאמת האיפור היוני של תמיסת מלח היא דרך יעילה ללמד משוואות נרנסט וגולדמן הודג'קין כץ.
כדי להצליח עם הכנות הגנגליון חשוב לי הגנגליון מתוח לפני שתנסה לתקוע סומה עם אלקטרודה תאית. אחרת סומה תעבור כאשר דוחף כלפי מטה על מנות גליה. בנוסף, כאשר desheathing הגנגליון להסרת תאי עצב לתרבות, להימנע מהאזור של עניין, כאשר חוצה את הגנגליון כך somas אינם פגומים כפי שהם יוסרו. כמו כן, דגירה מוגזמת באנזימים עלולה לגרום לתאי העצב להיות שבירים מדי כדי להסירו. זה דורש קצת ניסוי וטעייה כדי להגיע לזמן דגירה אידיאלי כי כל מנה של אנזימים שונה במקצת במעשיהם.
חקירה נוספת כדי לייעל את התקשורת והתרבות יכולה לשפר את הטכניקה הזו. ואריגורמים מפוקפקים, כגון הנוכחות של אינסולין, סוכרים, או גורמי גדילה יכולים להיבחן לתחזוקה ארוכה יותר של תרבויות. כדי לקבוע אם תאים לשמור על כושר שלהם כדי לסנתז משדרים, כגון סינתזת סרוטונין בתאי Rz, מכתים אדום ניטראלי יכול להיות מיושם על תווית תהליכי serotonergic. פלישה גם microglial לרקמה פגועה והתחדשות ניתן לכמת על ידי ימי כתמים גרעיניים לאחר פציעה.
למרות שיש הכנה זו יתרונות רבים להציע בבחינת התחדשות ותיקון, כמו גם מעגלים עצביים, זיהוי התרופתי ומולקולרי של תת קולט השונים בסינפסות לא היה מאופיין במלואו. ספריית תג רצף הביעה נגיש 26, והגנום העלוקה הרפואי בימים אלה התאספו 27, אך המגבלה העיקרית בעלוקה בהשוואה לכמה הכנות מודל היא היכולת לשנות את הגנום לגנים סלקטיבית בתאים מסוגים מסוימים. בt עובריםהגבלתו טופלה על ידי הזרקת DNA או dsRNA לווסת ביטוי גנים 28. לאחרונה טכניקת אקדח הגן נעשתה שימוש כדי להביע connexin חסר חוליות (innexin) חלבונים בתאי עצב עלוקה. ביטוי של innexin מHirudo verbana (hve-inx6) מספיק להיווצרות של צמתים פער מחוץ לרחם בעלוקה הרפואית 29. העלוקה או המרפא H. ורבנה כפי שהיו 30 הוא בטוח כדי לקדם את הבנת הפיסיולוגיה והאבולוציה של סינפסות חשמליות בשנים הבאות שלנו.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
| Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
| Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
| Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
| Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
- Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
- Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. , Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
- Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
- Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).
- Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).
- Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).
- Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Multifunctional pattern-generating circuits. Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).
- Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
- Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
- Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
- Kristan, W. B. The Neurobiology of Swimming in the leech. Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).
- Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
- Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
- Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. , McGill University. (1995).
- Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
- French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
- Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
- Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
- Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
- Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
- Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
- Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407 (2010).
- Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
- Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).
- Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
- Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
