Summary
우리는 살아있는 효모 세포에서 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 모니터링하기 위해, GFP를 기반으로하는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다.
Abstract
미토콘드리아는 에너지 대사와 세포의 수명과 프로그램 된 세포의 죽음으로 제어하는 칼슘 항상성에서 많은 세포 과정에있는 역할을한다. 이러한 프로세스는 영향의 산화 환원 상태와 미토콘드리아 ATP 생산에 의해 영향을받습니다. 여기, 우리는 효모 세포를 생활에 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 감지 할 수있는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태는 미토콘드리아의 매트릭스를 대상으로 산화 환원에 민감한 녹색 형광 단백질 (roGFP)를 사용하여 측정됩니다. 미토 roGFP 차례로 단백질의 여기 스펙트럼을 변경 가역 및 환경에 따라 산화와 환원을 거쳐 위치 147과 GFP의 204의 시스테인이 포함되어 있습니다. MitGO-ATeam은 F 오의 ε 소단위가 F 1-ATP 합성 효소를 사이에 끼워 넣으면되는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 프로브는 기증자와 수용체 플루오을 무서워rescent 단백질. 을 가지고 단백질의 형태 변화 ε 소단위 결과로 ATP의 결합은 가까운 곳에서 기증자와 수용체를 무서워하고 기증자의 수용체에 형광 공명 에너지 전달을 허용합니다.
Introduction
미토콘드리아는 아미노산, 지방산, 헴, 철, 황 클러스터 및 피리 미딘의 ATP 생산 생합성에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 칼슘 항상성에 중요한 역할을하고, 세포 사멸 조절합니다. 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 루게릭 병, 헌팅턴의 질병 등 노화 및 노화 관련 질병에 미토콘드리아 1 증가 증거 링크 2. 개인이 자신의 전체 삶을 살 수 있지만 퇴행성 신경 질환과 관련된 미토콘드리아 단백질에 돌연변이가 질병의 증상은 생활에서 나중에 발생합니다. 이것은 변경이 등장하는 병리 질환을 허용 연령 미토콘드리아에서 발생 나타냅니다. 사실, 미토콘드리아 피트니스은 전체 세포의 건강과 수명 효모와 포유 동물 세포와 연관되어 있습니다. 여기서 3,4, 우리는 mitoc의 두 가지 중요한 기능을 평가하기 위해 유전자 인코딩, 비례 형광 바이오 센서를 사용하는 방법에 대해 설명합니다효모 세포를 살아있는 hondria : 산화 환원 상태와 ATP 수준.
유산소 에너지 동원 미토콘드리아의 기능이 제대로 설정됩니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태는 NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, 글루타티온 / 글루타티온 아황산 (GSH / GSSG)와 활성 산소 종 (reactive oxygen species, ROS) 등 세포 기관에 종을 감소시키고 산화의 제품입니다. 미토콘드리아 또는 저산소증 연결을 풀기는 미토콘드리아의 호흡 활동에 영향을 미치는 NAD의 비율 + 세포 소기관에서 NADH로 변경합니다. 미토콘드리아 막에있는 전자 수송 사슬의 복합체뿐만 아니라, 아민의 탈 아미노 반응에서 외부 미토콘드리아 막에있는 모노 아민 산화 효소를 통해 5, 손상 지질, 단백질, 핵산 간의 비효율적 인 전자 전달에서 생산이됩니다 ROS, 6,7,8 노화 및 노화 관련 퇴행성 신경 질환에 연결되었습니다. ROS는 M의 신호 전달에 중요한 역할을itochondria, GSH의 산화를 통해. 예를 들어, NADH 탈수소 효소는 ROS 생산에 기여뿐 아니라 글루타티온 풀 9,10와의 상호 작용을 통해 조절된다. α-Ketoglutarate 탈수소 효소와 aconitase, TCA 사이클의 구성 요소는 환경에게 11,12 산화 감소 활동을 나타냅니다.
사실, aconitase 활동의 산화 환원에 의존 규제 박테리아 포유류 13,14에 보존됩니다. 따라서, 산화 환원 상태와 미토콘드리아의 ATP 수준을 모니터링하는 것은 질병 병리에서의 기능과 역할을 이해하는 데 매우 중요합니다.
생화학 적 방법은 산화 환원 상태 또는 전체 세포의 ATP 수준을 평가하는 데 사용 또는 미토콘드리아 고립되었다. 전체 세포 또는 산화 환원 상태를 평가하기 위해 널리 사용되는 방법은 미토콘드리아 격리는 산화 환원 쌍 GSH / GSSG 15의 수준을 측정하는 기준으로합니다. 루시페린 - 루시퍼 시스템은 일반적으로 미토콘드리아 측정하는 데 사용됩니다미토콘드리아 투과 전체 세포 또는 고립 된 하나의 ATP 수준. 16,17,18,19,20이 분석에서, 루시 페라 제는 양에 비례 ATP에 바인딩과의 산화 루시페린에서 발광을 촉진. 21 방출되는 빛의 강도 반응 혼합물에서 ATP. 22
이러한 방법은 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 신경 질환을 가진 환자는 비정상적으로 낮은 ATP 수준을 가지고 찾는 등의 미토콘드리아 기능에 대한 기본적인 정보를 공개했다. 23 그러나 그들은 이미지의 생활 그대로 셀에 사용할 수 없습니다. 또한, 전체 세포 분석에 근거한 방법은 산화 환원 상태 나 세포의 구획 ATP 수준의 평균을 제공합니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태 나 ATP 수준은 세포 내 분획 중 변경 될 수 있기 때문에 고립 된 세포 소기관의 측정은 잠재적 인 문제가 있습니다. 마지막으로, 우리의 실험실과 다른 사람들로부터 최근의 연구 나타냅니다 그각각의 세포 내 미토콘드리아는 다시 어머니와 딸 세포의 수명에 영향을 미치는 기능, 이기종입니다. 3 따라서, 세포 내 해상도로 살아있는 세포의 미토콘드리아 ATP 수준과 산화 환원 상태를 측정 할 필요가있다.
모두 GFP를 기반으로하는 미토콘드리아 기능에 대한 바이오 센서는 여기에 설명. 산화 환원에 민감한 GFP (roGFP) 24,25 표면 노출 시스테인이 분자에 추가되는 GFP의 변형입니다. roGFP는 야생 형 GFP와 같은 두 개의 여기 피크 (~ 400 nm의 ~ 480 nm의)와 ~ 510 nm에서 하나의 발광 피크가 있습니다. ~ 400 nm에서 여기에서 증가 roGFP 결과 시스테인의 산화. 그 시스테인의 감소는 ~ 480 nm의 여기를 하시 더군요. 따라서, 480 nm의 400 nm에서 roGFP의 흥분에 따라 510 nm의 방출의 비율은 형광 환경의 산화 환원 상태를 반영 감소 산화 roGFP의 상대적인 양을 보여준다.
두 적이roGFP의 이온이 널리 사용됩니다 roGFP1 및 roGFP2. 모두 동일한 시스테인 삽입이 포함되어 있습니다. roGFP1는 야생형 GFP 기반으로하고 roGFP2는 wtGFP 24에 비해 400 nm에서 480 nm의 효율성이 여기에서 더 효율적 여기가 S65T GFP를 기반으로합니다. roGFP1는 roGFP2 및 동적 범위가 축소 된 범위로 더욱 확장보다 민감한 작은 산도있다. 따라서, roGFP1 더 감소와 같은 미토콘드리아로 구획 또는 세포질, 그리고 엔도 등의 변수 산도와 구획을 모니터링에 더 유용 할 수 있습니다. roGFP2은 밝은 신호, 일부 연구에서, roGFP1 24,26보다 더 큰 동적 범위를 제공합니다. 애기 장대의 연구는 산화 환원 상태의 변화에 대응하는 데 필요한 시간은 두 센서 (t ½ 산화, 65, 95 초와 T ½ 각각 roGFP1 및 roGFP2 감면, 272 및 206 초, 분)에 대해 유사한 것을 나타냅니다. 26
MitGO-ATeam2은 최소로 침략적인, 믿을 수있다신진 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의에 미토콘드리아 ATP를 측정하는 센서. GO-ATeam 기증자와 수용체 형광 단백질 (GFP와 오렌지 (OFP) 단백질의 형광, 각각) FRET F O 사이에 F 1-ATP 합성 효소의 ε 소단위로 구성된 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 프로브. 27 를 가지고있는 단백질의 구조적 변화 ε 소단위 결과로 ATP의 결합은 수용체에 근접 기증자를 무서워하고 기증자의 수용체에 에너지 전달을 허용합니다. GO-ATeam, GO-ATeam1과 GO-ATeam2의 두 가지 변형이 있습니다. GO-ATeam2은 일반적으로 낮은 미토콘드리아에서 세포질에 비해 [ATP]. 27를 측정하는 것이 더 적합하다, GO-ATeam1보다 MgATP에 대한 높은 친화력을 가지고
미토콘드리아의 산화 환원 상태를 조사하기 위해, 우리는 ATP9 리더 시퀀스 융합 roGFP1로 구성된 융합 단백질 (미토 roGFP1) 구축ND는 강한 글리 세르 알데히드 -3 - 인산 탈수소 효소 (GPD) 발기인 (p416GPD, Addgene)의 제어하에 플라스미드 중심체 기반 (낮은 사본 번호) 효모 식에 표현했다. 우리는 모델 곰팡이 사카 cerevisiae의 노화의 맥락에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 조사하는 roGFP1를 사용했습니다. 우리는 roGFP1 노화 과정과 영양분 님의 질문에 답변 발생하지만, 효모 세포에 명백한 부정적인 영향을 미치지 않습니다 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화를 감지 할 수있는 찾을 수 있습니다. 우리는 또한 개인 생활 효모 세포 내 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화, 세포 내 공간 해상도를 가진 바이오 센서의 중요성을 강조 발견을 참조하십시오.
MitGO-ATeam2은 GO-ATeam2의 아미노 말단에 삽입 시토크롬 C 산화 효소의 소단위 VIIIA의 미토콘드리아 신호 순서가 GO-ATeam2의 변형입니다. 27 우리는 mitGO-ATeam2 프로브를 (친절 H.의 연구실에서 제공하는 수정 노지, 연구소 오F 과학 및 낮은 복사 플라스미드는 효모 발현 벡터 pAG415GPD-ccdB (Addgene, 캠브리지, MA, USA)에 Xba1 및 HindIII 사이트를 통해 그것을 서브 클로닝하여 효모에있는 사용을위한 산업 연구, 오사카 대학, 일본), 강한 제정 GPD 프로모터를 포함. 우리는 신진 효모 mitGO-ATeam2을 표현하고 미토콘드리아의 ATP 수준의 생리적 변화를 측정 할 수있는 효과적인 프로브 역할은 미토콘드리아에 독점적 지역화 DNA-결합 염료 DAPI, 함께 counterstaining하여 찾을 수 있습니다.
roGFP과 GO-ATeam은 유전자 인코딩됩니다 모두. 그 결과로, 그들은 도입 안정적으로 유지 그대로 세포 및 산화 환원 상태 나 개인, 살아있는 세포의 ATP 수준에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 또한, 두 바이오 센서는 생리 학적 조건에서 산화 환원 상태 나 발생 ATP 수준의 변화를 모니터링합니다. 28 두 프로브도 비례합니다. 그 결과로,이 프로브로 만든 측정은 차에 의해 영향을받지 않습니다바이오 센서 농도 또는 샘플의 조명이나 두께 nges. 마지막으로, 두 바이오 센서는 세포 내 공간 해상도를 제공합니다. 사실, roGFP은 미토콘드리아, ER을 대상으로하고 있으며, 엔도와 24 퍼 옥시 솜, 그리고 pH를 거의 독립적으로 이러한 세포 소기관의 각각의 산화 환원 상태의 변화를 감지 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 바이오 센서와 효모 세포의 변화
- 리튬 아세테이트 방법 27을 사용하여 플라스미드 베어링 미토 roGFP 또는 mitGO-ATeam2하여 원하는 효모 균주를 변환 할 수 있습니다.
- 플라스미드 매개 바이오 센서와 변환을 확인하고 플라스미드의 손실을 방지하기 위해 선택하고 적절한 선택적 합성 완전 배지 (미토 roGFP을위한 SC-우라, 또는 mitGo-ATeam2을위한 SC-레우)에 형질 전환을 유지한다. 형광 프로브가 여기에서 설명한 것보다 다른 플라스미드에 클로닝 된 경우, 적절한 선택 배지를 사용합니다. 그들은 형광 바이오 센서를 표현할 수 있는지 확인하고 정상 미토콘드리아 형태를 전시하는 형광 현미경에 의해 형질 전환을 시각화.
2. 이미징을위한 세포 및 준비의 성장
세포의 기능 및 약물 치료에 대한 반응은 세포 밀도와 대사 활동에 크게 의존하고 있습니다. 최상의 결과를 얻을 때 세포적극적으로 (- 1 × 10 7 세포 / ML 중반 로그 단계 ~ 0.5) 분할됩니다. 일관된 밀도의 중간 로그 상 문화를 생성하는 가장 신뢰할 수있는 방법은 고정 된 상 사전 문화에서 접종하는 것입니다.
- 정지 상 사전 문화를 준비 접시에서 변형 세포의 단일 식민지를 선택하고 선택 리퀴드 미디어 (50 ML 원뿔 바닥 튜브 5 mL를) 접종. 600 nm의 (OD 600)에서 문화의 광학 밀도가 고원 (24-48 시간)를 도달 할 때까지 225 rpm으로 진탕 30 ° C에서 성장.
- 관찰 중반 로그 단계 문화를 준비 50 ML 원뿔 바닥 튜브 선택 배지 5 mL를 접종 사전 문화의 적절한 볼륨을 사용합니다. YPD 미디어 autofluorescent이며, 이러한 연구에 사용할 수 없습니다. 합성 전체 포도당을 기준 드롭 아웃 (SC-우라) 용지를 사용하십시오. 그들은 중반 로그 단계 (- 1 × 10 7 세포 / ㎖ ~ 0.5)에 도달 할 때까지, 4-16 시간 동안 225 rpm으로 흔들어, 30 ° C에서 세포를 성장. 세포 밀도를 결정할 수 있습니다OD 600을 측정하여, 정확한 OD 600 독서를 결정하는 분광 광도계를 보정합니다. 우리 베크 DU530 (IN Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날, 인디애나 폴리스, 인디애나)에서 중반 로그 단계는 0.1-0.3의 OD 600에 해당합니다.
미토 roGFP1 신진 대사 변화에 대응 소기관의 감각 변동. 예를 들어,이 분석 미토콘드리아의 산화 환원 상태 변경 효모 발효 탄소 소스 (예를 들어 포도당, SC 매체에서와 같이) 대 비 발효 탄소 소스 (예 : 글리세롤과 같은 SGlyc 미디어)에서 자랄 때, 심지어 같은 다른 일괄 미디어. 따라서 모든 실험에 대한 미디어의 동일한 배치를 사용합니다.
- 아무 처리를 수행중인 경우 세포 농도 준비 (단계 2.4 참조) 영상입니다. 세포가 치료되는 경우, 적절한 치료와 세포를 배양하고 다음 단계를 계속합니다.
- 15 초 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 배양 1 ㎖를 집중하고미디어 20 μL의 세포 펠렛의 부유. 이러한 조건은 시야에서 구별 세포의 수를 극대화 할 수 있습니다.
- 슬라이드에 재 부유 세포의 2 μL를 적용합니다. coverslip을 (제 1.5, 바람직 고성능 170 ± 5 μm의 두께)와 커버, 명확한 매니큐어 또는 valap (시약 참조) coverslip에의 가장자리를 밀봉하십시오. valap로 밀봉하는, 커버 슬립의 가장자리를 따라 작은 금액을 확산 후, 분젠 버너 불꽃을 통해 그것을 잡고 금속 주걱에 소량 용해.
- 이미징 동안 30 ° C에서 세포를 유지합니다. 영상에 사용 된 100X 기름 침지 렌즈 객관적인 히터이 응용 프로그램에 적합합니다. 이러한 조건에서, 미토콘드리아 형태, 산화 환원 상태와 ATP 수준은 10-15 분 영상 중에 변경되지 않습니다.
3. 이미지 설정
- 넓은 필드 형광 현미경 이미지 미토 roGFP1에 대한 설정
여기 단계는 AxioObse에 맞는rver.Z1 현미경 콜리 LED 여기 소스, 넓은 필드 오르카 ER 카메라와 Axiovision 수집 소프트웨어를 탑재. 미토 roGFP1 산화의 두 채널과 광 변환의 photobleaching에하는 수은 아크 램프 조명 (아래)에 비해 LED 조명을 사용하여 현저하게 줄어 듭니다.
신호 해상도를 극대화하기 위해, 목적에 가장 높은 수치 조리개, 충분한 공간 해상도를 제공하는 가장 낮은 배율을 사용합니다. 또한, 미토 roGFP 이미징, 목표는 365 nm에서 잘 전송되는지 확인합니다. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar 목적 (혈구)이 응용 프로그램에 적합합니다.
산화와 감소 미토 roGFP1 종을 캡처 수집 소프트웨어를 구성합니다. 우리는 다음과 같은 조건을 사용합니다.- 포함 excitatio으로, 미토 roGFP 그런 그가 (혈구) 집합을 필터링 38로 365 nm의 (100 % 전원 LED)와 GFP에 적합한 배출 필터에 여기를 사용하는 산화에 대한 채널을 구성N 필터는 큐브에서 제거됩니다. 여기 필터 제거함으로써 달성 시간 해상도를 증가 필터를 전환 할 필요없이 365 nm의 470 nm의 모두에서 구동 할 수 있습니다.
- 위에서 언급 한 바와 같이 470 nm의 (100 % 전원 LED)에 여기를 사용하는 감소 미토 roGFP의 채널을 구성, 동일한 방출 필터 큐브 산화 미토 roGFP에 사용됩니다. 공간 해상도를 최적화하기 위해 1X1 비닝 (binning) 카메라를 설정합니다.
- 각 Z 위치에서 채널을 모두 수집, 0.5 μm의 간격이 11 조각으로 구성된 AZ 스택을 확보하기 위해 소프트웨어를 설정합니다. 취득이 모드는 차례로 각각의 Z 스택을 인수보다 느리지 만, 산화와 감소 채널의 취득과 미토콘드리아의 움직임에서 발생하는 아티팩트를 방지 할 수 있습니다.
- 이미지를 여러 세포는 강한하지만 포화 신호를 생성, 적절한 노출 시간을 결정합니다. 그것은 모든 실험 산화 미토 roGFP1 감소에 대한 노출 시간의 비율을 유지하는 것이 중요합니다의. 예를 들어,에 대한 노출 시간은 산화 미토 roGFP1 미토 - roGFP1 산화에 대한 노출 시간 후, 각각 300 및 100 밀리 초이다 줄어들 경우 3 번해야하는 모든 실험 미토 roGFP 감소합니다.
- 스펙트럼 공 촛점 현미경 이미징 mitGO-ATeam2에 대한 설정
mitGO-ATeam2, GFP (방출 최대 510 nm의)에서 형광을 사용하여 ATP 수준을 정량화하는 OFP (배출 최대 560 nm의)에서 해당 구별해야합니다. 이러한 형광 물질에서 방출되는 형광을 해결 형광 필터 세트가 있습니다. 그러나, 우리는 공 촛점 현미경 스캐닝 많은 레이저에서 사용할 수있는 스펙트럼 검출기,이 응용 프로그램에 가장 적합한 것을 찾을 수 있습니다. 스펙트럼 검출기는 파장에 따라 많은 구성 요소 (일반적으로 32 또는 그 이상)로 형광 방출을 분리합니다. 인접한 여러 파장 대역은 하나의 이미지 채널로 결합 할 수 있습니다. 결합되는 파장은 경험적으로 그렇게 G에서 신호를 최대화하기 위해로 선택혼동 할 신호의 크로스 오버를 피하면서 FP와 OFP는 측정을 무서워. 가장 높은 수치 조리개 렌즈를 사용합니다. 우리는 100x/1.49 또는 60x/1.49 아포 TIRF 렌즈를 사용합니다. 우리는 NIS 요소 소프트웨어를 실행하는 니콘의 A1R 공 촛점 현미경을 사용합니다. ATP 바인딩 및 ATP-언 바운드 mitGO-ATeam2 종을 캡처 수집 소프트웨어를 구성합니다. 우리는 다음과 같은 조건을 사용합니다.- 우리의 시스템에 대한 0.42 ㎛의 애리조나 해상도에 해당하는 1.0 에어리 단위 (AU)로 핀홀을 설정합니다.
- 이미지의 공간 정보를 극대화 할 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링 제한을 접근하는 스캔 줌을 설정합니다. 우리의 시스템에 픽셀 크기는 0.12 μm의 수 있습니다.
- 미토콘드리아 이미징 동안 이동할 수 있기 때문에, 512 X 256 픽셀로 필드를 잘라내어 이미지의 속도를 증가 도움이 될 수 있습니다. 우리의 시스템 이미지를 한 프레임에 필요한 총 시간은 2 배 검사 평균을 포함, 1.0 초입니다. 원하는 공간 해상도에 따라 필드가 더 increas에 잘릴 수 있습니다전자 시간 해상도를.
- 488 nm에서 흥분, 500의 방출을 수집 - GFP에 대한 520 nm의 550에서 - OFP 580 nm의. 실제 최적의 값은 이미징 시스템의 특성에 따라 달라질 수 있습니다.
- 우리의 시스템에 대한 최적의 레이저 파워는 6.0과 6.4 % 사이입니다. 최적의 레이저 전력이 각 현미경 시스템에 따라 다를 것입니다,하지만 여전히 해석 이미지를 생성 이상적으로 최대한 낮아야합니다. 모든 광학 시스템 시간이 지남에 일반적으로 발생하는 레이저 출력의 변화를 모니터링하기 위해 내부 또는 외부 전원 측정기를 사용합니다.
- 픽셀 값의 감지 범위를 최대화하지만, 가능한 한 많은 세포와 같은 위해, 포화에게 신호를 방지하기 위해 검출기 이득 및 조명 빛의 강도를 조정합니다. 1 % 이상 포화 픽셀을 포함하는 모든 세포를 분석하지 않습니다. 같은 목표, 레이저 출력, 스캔 줌, 픽셀 크기, 게인 및 오프셋을 사용하여 이미지를 모든 샘플.
4. 이미지 수집
- 초점 괞 찮아를 찾습니다 형광 프로브를 표백 최소화하기 위해 전송 된 빛을 사용하여 그 세포의 북동쪽.
- 그 하나 이상의 셀을 찾은 후, 0.5 ㎛의 스텝 크기를 사용하여 일반적인 세포 (약 7 μm의)의 전체 깊이를 통해 Z 시리즈를 수집합니다.
- 이미지를 다른 슬라이드에 관심 세포하지만, 이미지를 15 분 이상에 대한 하나의 슬라이드를하지 않습니다. 슬라이드에 15 분 후, 세포 생존 능력을 잃게됩니다.
5. 분석
미토콘드리아의 ATP 수준은 510 nm에서 그 560 nm에서 mitGO-ATeam2 방출의 비율을 측정하여 결정되는 27 소기관의 산화 환원 상태 미토 roGFP의 (R / O) 산화 비율로 감소로 측정된다. 즉 365 nm의 여기에 따라 510 nm에서 방출로 나눈 470 nm의 여기에 따라 510 nm에서 방출. 비율을 계산하기 전에, 우리는 배경을 빼고 형광 미토콘드리아에 속하는 픽셀 임계 값을 결정합니다.
십t "> 퍼블릭 도메인 (예를 들어 ImageJ에 30) 또는 소프트웨어 미토 roGFP1 또는 mitGO-ATeam2 분석. 이미지 수집을 위해 사용되는 소프트웨어에 따라서는 분석을 위해 사용될 수있다 (예를 들면 Volocity, 퍼킨 - 엘머) 시판 이미지 첫 번째 분석 소프트웨어를 열기 전에, 같은 TIFF와 같은 다른 형식으로 변환해야 할 수 있습니다. 이미지를 변환하는 경우, 픽셀 값을 변환하는 동안 변경되지 않습니다 있는지 확인하는 것이 필수적입니다. 미토 roGFP1 데이터를 분석하여 두 프로그램은 아래에 설명되어 있습니다. 각 메뉴에서 선택 프로그램 메뉴 및 옵션이 굵은 이탤릭체로 강조 표시됩니다.5.1 ImageJ에 분석
- 이미지 열기 및 변경 유형 32 비트 : 이미지 → 유형 → 32 비트.
- 어떤 세포가없는 지역에 대한 관심 (ROI)의 영역을 그립니다. 이 투자 수익 (ROI)의 평균 농도를 계산 → 측정을 분석합니다.
- 스택에서 계산 된 평균 배경 빼기 : 프로세스 → 수학 → 뺍니다.
- 차감 Z-스택을 사용하여, 미토콘드리아의 중앙 조각과 임계 값을 찾습니다 이미지 → 조정 → 임계 값을 임계 값 창에서 적용을 클릭합니다. 스택의 모든 슬라이스에 적용됩니다. NaN으로 배경 픽셀로 설정하십시오.
- 비율을 만들 Z 스택 : 프로세스 → 이미지 계산기 미토 roGFP1 분석을위한 산화 Z 스택에서 감소 스택을 나눈다. mitGO-ATeam2 분석 (ATP 언 바운드) 이미지 510 nm의에 의해 560 nm의 (ATP 바운드) 이미지를 나눕니다.
- 그 주변 투자 수익 (ROI)을 그립니다. → 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자를 분석 선택하고 ROI를 기록하려면 추가를 클릭합니다. 여러 영역은 관리자에 저장할 수 있습니다. 투자 수익 (ROI) 관리자에서 모든 로아을 선택한 다음 M을 선택광석 → 모든 스택 슬라이스를 측정하는 멀티 측정. 분석을 위해 스프레드 시트로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
5.2 Volocity 분석
- Volocity 라이브러리에 이미지를 가져 오기 및 2 채널 이미지 시퀀스를 만들 수 있습니다.
- 어떤 세포가없는 지역에 대한 관심 (ROI)의 영역을 그립니다. 선택 도구 → 비율.
- ROI에서 가져 오기 : 배경을 계산하는 Volocity를 사용합니다.
- 미토콘드리아 구조를 포함하도록 임계 값을 조정합니다.
- 비 채널에 무지개 LUT를 적용 할 옵션을 선택합니다. 강도 변조 채널 프리젠 테이션 조작시에 적은 노이즈 이미지를 생성 할 수 있지만 평균 비율의 정량을 위해 사용해서는 안됩니다.
- 측정 탭을 선택하고, 비율 채널을 선택하고 그 주변 투자 수익 (ROI)을 그립니다. 0 값은 제외 비율 채널을 측정한다. 여러 영역을 선택하고 측정 할 수있다동시에. 분석을 위해 스프레드 시트로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
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Representative Results
미토 roGFP와 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 측정
여기, 우리는 미토 roGFP1 효모 세포의 성장 또는 미토콘드리아의 형태에 영향을주지 않고, 효모 살아있는 세포에서 감소하는 완전 산화에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화를 감지하는 동적 범위를 가지고 것을 보여줍니다. 첫째, 우리는 미토콘드리아 대상 GFP 및 roGFP1을 표현하는 세포가 정상 요금 (그림 1A)에서 성장 찾을 수 있습니다. 로 로그 위상 성장과 최대의 성장 속도에 도달하는 시간 동안 성장 곡선의 최대 기울기에 의해 측정 된 최대 성장률, 미토 GFP 및 미토 roGFP1을 표현 세포에서 유사하다. 또한, 미토 roGFP1 전시 야생형 형태 (그림 1B)를 표현하는 효모 미토콘드리아. 특히, 그들은 관이며, 어머니 봉오리 축을 따라 정렬하고 어머니와 딸 세포의 끝에서 축적. 미토콘드리아 기능 장애는 종종 분열을 유도하기 때문에,이 일반적인 형태는 미토 roGFP1가하는 아이디어를 지원하지 교란 미토콘드리아 기능.
미토 roGFP1의 동적 범위를 평가하기 위해, 우리는 각각 과산화수소 (H 2 O 2)와 디티 올 트레이 톨 (DTT)과 중반 로그 단계 야생형 효모 세포를 취급하고, 미토콘드리아 평가하는 평균 미토콘드리아 R / O 비율을 측정 산화 환원 상태 (그림 2). H 2 적정 0 ~ 1.23 (환원 조건 하에서) ~ 0.6 (조건을 산화 이하)에서 측정 범위의 평균 세포 R / O 비율이 용량 의존적으로 변화 10 MM의 결과 O 2 DTT. 따라서, 미토 roGFP1은 살아있는 세포에있는 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 분석을위한 효과적인 바이오 센서입니다.
미토 roGFP1는 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 세포 내 해상도를 제공합니다. 이 세포 내 해상도는 각각의 효모 세포 내 미토콘드리아가 상대적으로 산화 환원 상태에서 다르다는 것을 알 수있다. 하나의 효모 세포 내 미토콘드리아 기능적으로 구별되는 경우, 가능한y를 수동적 또는 능동적으로 분리 (그림 3)입니다. 이러한 분리는 엄마와 딸의 나이 비대칭와 딸 세포의 회춘에 기여할 수 있습니다. 이 발견은 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 세포 내 해상도를 가진 바이오 센서의 필요성을 강조.
그것은 빛이 GFP의 발색단의 변화를 유도 할 수있는 31 오랫동안 알려져왔다. 고강도 400 nm의 빛에 노출되면, roGFP1은 다른 방출 스펙트럼을 26으로 종 광 변환을 겪는다. 광 변환이 발생하면, 미토 roGFP1 산화에서 녹색 배출 감소 및 R / O 미토 roGFP1 (그림 4B)의 비율을 변경 감소 미토 roGFP1의 자극에 따라 녹색 배출 증가가있다. 낮은 강도 여기를 (콜리 광원에 LED를 400 nm의 사용 40 %, 예를 들면 조명)를 사용하여 (그림 4C) 분석 기간 동안 유의 한 광 변환이 없습니다. P 광 변환을 줄이기 위해 언급 된 방법 (토론 참조) 365 nm에서 roGFP의 산화 양식을 자극하는 것입니다.
mitGO-ATeam2로 측정 미토콘드리아의 ATP
포유 동물 세포에서 발현 될 때 MitGO-ATeam2는 미토콘드리아로 지역화. 27 우리는 mitGO-ATeam2 효모에서 DAPI 염색 미토콘드리아 DNA와 colocalizes 것을 발견하고, 미토콘드리아 야생형 효모 (그림 5A)의 전형적인 관상 구조에서 찾을 수 있습니다. 따라서, 우리는 포유류의 시토크롬 C 산화 효소 subunit의 VIIIA에서 미토콘드리아 표적 순서가 미토콘드리아 형태를 방해하지 않고 효모 미토콘드리아에 프로브를 지역화 것을 확인. 또한, 우리는 mitGO-ATeam2을 표현 세포의 성장 속도는 포도당과 글리세롤 미디어 모두에서 미토콘드리아 대상 GFP (그림 5B)를 표현하는 세포의 그것과 유사한 것을 찾을 수 있습니다. 따라서, mitGO-ATeam2의 발현은 세포 나 미토콘드리아에 해로운 표시되지 않습니다.
_content는 "> 다음으로, 우리는 mitGO-ATeam2는 미토콘드리아의 ATP 농도의 변화. 이렇게하려면에 응답을 무서워하는지 테스트, 우리는 antimycin, 시토크롬 C 환원 효소에 바인딩 에이전트와 세포를 치료 전자 수송 체인 유비의 산화를 억제 , 양성자 기울기를 방해하고, 미토콘드리아의 ATP 생산을 억제. 20 중앙값 Antimycin로 치료 세포 비율 감소를 무서워한다 (그림 66).mitGO-ATeam2는 미토콘드리아 ATP에 대한 효과적인 바이오 센서 증거 감안할 때, 우리는 발효 또는 비 발효 탄소 소스 (그림 6A 및 6B)를 사용하여 전달 된 효모 미토콘드리아의 ATP 수준을 모니터링하기 위해이 프로브를 사용했습니다. 포도당 자란 세포의 총 형광 영역의 감소는 미토콘드리아 풍부하게 감소하는 포도당 억제 결과를 확인했다. 우리는 mitGO-ATeam2의 수준에 휴대 전화의 변화를 확인합니다. 흥미롭게도, 우리의 예비 데이터를 나타냅니다 거기 엄마 y는 동일한 셀 내의 다른 미토콘드리아에서 ATP 수준의 차이 (그림 6D)합니다.
그림 1. 미토 roGFP1 세포 성장 속도 나 미토콘드리아의 형태에 영향을주지 않고 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 감지합니다. 표현 미토콘드리아 대상 GFP 또는 RO-GFP1은 성장 시간의 함수로 600 nm에서 흡광도의 변화로 측정 된 효모 (A) 성장 30 SC-우라 액체 배지 ° C.는 (B) 상단 패널 : 정상 미토콘드리아 형태와 RAW 이미지의 지역화 채널입니다. 하단 패널 비율 : 이미지 산화 채널 (오른쪽 색 기준)으로 나눈 감소 채널을 보여줍니다. 이미지 검색 결과에 대한 임계 값 선택의 효과를 발휘합니다. 최적의 임계 값은 미토콘드리아의 구조와 제외 배경을 포함합니다.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 미토 roGFP1 미토 - roGFP1을 표현 과산화수소 또는 디티 올 트레이 톨. (AB) 미드 로그 상 효모 세포 치료에 대한 응답으로 미토콘드리아 산화 환원 상태의 변화를 감지은 더 치료 (0)이나 지정된 농도 SC-우라 미디어에서 배양 하였다 30 20 분 ° C. (이) R / O 미토 roGFP1 비율 이미지의 최대 강도 돌기 세포의 윤곽을 보여 투과광 이미지에 겹쳐있다에 대한 H 2 O 2 DTT의. 미토 roGFP1의 색상 참조는 우측 상단에 표시됩니다. 바 :. 5 μM (B) 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 미토 roGFP1는 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 세포 내 해상도를 제공합니다. R / O 미토 roGFP1 비율 채널의 최대 강도 투사가 전송 된 빛 이미지에 놓이게됩니다. 미토 roGFP1의 색상 참조는 우측 상단에 표시됩니다. 바 : 5 μM. 이 특정 셀은 0.88의 평균 R / O 미토 roGFP1 비율을 가지고 있습니다. 그러나,이 세포 내 미토콘드리아 개인이 다른 산화 환원 상태를 보여줍니다. 표시된 숫자는 다른 미토콘드리아 재 계산 된 R / O 미토 roGFP1 비율이다레전. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 높은 강도의 자극은 광 변환에 이르게 및 변경된 R / O 미토 roGFP1 비율. 미토 roGFP1을 표현 중간 로그 단계 효모는 40 % (A) 또는 100 % LED 광원에서 (B) 전원에서 400 nm의 빛으로 조명했다 및 감소 미토 roGFP1 산화에서 형광 매 4 초 체포됐다. 보이는 이미지 색상이 미토 roGFP1의 R / O 비율 (우측 하단에 컬러 스케일을 참조)를 나타냅니다하는 최대 전망이다. 바 :. 5 μM은 (C) 미토 roGFP1의 R / O 비율이 40 % 전원 LED에 조명에 따라 영상의 기간 동안 일정하게 유지. 그러나 100 % 조명에 우리는, 전원 LED형광의 photoswitching을 반영 미토 roGFP1의 R / O 비율이 시간에 따라 변화를 관찰합니다. 검은 색 사각형은 40 % 전원 LED가;. 회색 다이아몬드, 100 % 전원 LED는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. MitGO-ATeam2는 효모 미토콘드리아에 지역화와 효모 세포의 성장 속도에 영향을주지 않습니다. (A) mitGO-ATeam2을 표현 효모 세포는 앞에서 설명한대로, DNA-결합 염료 DAPI와 파라 포름 알데히드와 스테인드를 사용하여 고정 중반 로그 단계로 성장했다 그림. 19 이미지 Z-시리즈 deconvolved의 최대 강도 전망이다. 단순, mitGO-ATeam2 이미지는 그래서 그들은 ATP 만 인구 언 바운드를 나타냅니다, 기존 GFP 필터를 사용 하였다. 세포 밖으로선이 흰색으로 표시됩니다. N : 핵 DNA. 미토콘드리아 : 미토콘드리아 DNA. 바 : 1 ㎛ (B) 야생 형 효모 세포의 성장 곡선 30 미토콘드리아 대상 GFP 또는 mitGO-ATeam2 포도당 기반의 (SC) 및 글리세롤 기반 (SGlyc) 액체 매체 ° C.를 표현. 이 데이터는 각 시점에서 각 변형에 대한 quadruplicates의 평균이며, 두 개의 독립적 인 실험의 대표입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. MitGO-ATeam2 조치는 세포 내와 suborganellar 해상도에서 미토콘드리아 효모의 ATP 수준의 변화. (AB) GFP (510 NM)와 OFP (560 NM)에서 mitGO-ATeam2의 방출, 그리고 효모의 510분의 560 nm의 방출 비율의 정량 gluco에서 하룻밤 성장 세포SE-기반 (SC) (A) 또는 글리세롤 기반 (SGlyc) (B) 미디어. 510분의 560 비율 채널의 색상 참조는 오른쪽에 표시됩니다. 바 :. 1 ㎛는 (C) 세포 510분의 560 비율의 정량은 30에서 1 시간 동안이나 antimycin (2 ㎍ / ㎖)없이 SGlyc 미디어 전파 ° C. antimycin에 따라 ATP 수준의 치료에 감소 (Kruskal-월리스 중요성 테스트) 통계적으로 유의하다. 중반 로그 단계 야생형 세포의 mitGO-ATeam2의 (D) 560 nm/510 nm의 비율은 SC 매체에 전파. 510분의 560 비율 채널의 색상 참조는 오른쪽에 표시됩니다. 세포의 윤곽은 흰색으로 표시됩니다. 전체 셀의 평균 510분의 560 nm의 비율은 0.43이다. 표시된 숫자는 미토콘드리아 내의 특정 영역의 510분의 560 nm의 비율입니다. 바 : 1 ㎛. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 효모 세포를 생활에 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP 수준을 평가하기 위해 바이오 센서로 미토 roGFP1 및 mitGO - ATeam2를 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 양적 미토콘드리아의 형태 또는 배포 또는 세포 성장 속도에 대한 명백한 효과없이, 미토콘드리아에 표적의 플라스미드 매개 미토 roGFP1 또는 mitGO-ATeam 결과의 표현을 찾을 수 있습니다. 3 미토 roGFP1 매우에서 미토콘드리아 산화 환원 상태의 변화를 감지 할 수 있습니다 매우 감소 상태로 산화. 마찬가지로, mitGO-ATeam는 호흡 억제제로 치료 호흡 중심의 성장과 효모를 겪고 효모에서 발생하는 미토콘드리아의 ATP 농도의 변화를 측정 할 수 있습니다. 두 바이오 센서는 세포 내 해상도를 제공하고 있기 때문에 또한, 그들은 산화 환원 상태 또는 개별 세포 내 미토콘드리아의 ATP 수준의 이질성을 감지 할 수 있습니다. 두 바이오 센서는 비례 프로브이기 때문에 마지막으로, 그들은 샘플의 두께 나 병의 농도 또는 변동성의 변화에 영향을받지 않습니다umination. 이 프로브는 살아있는 세포에서 세포 내 해상도를 가진 미토콘드리아의 기능을 연구하는 최소 침습적 방법을 제공합니다.
이 메서드를 성공적으로 적용하려면, 이미지는 가능한 최대 신호 대 잡음 비율로 취득해야합니다. 중요한 첫 단계는 현미경 10-20 형질 전환 식민지의 세포를 검사하고 강력한 형광 정상 미토콘드리아의 형태와 성장 속도를 가진 사람을 선택하는 것입니다. 다음, 이미징 조건은 형광 단백질이나 세포에 광을 발생하지 않고 높은, 그러나 포화, 강도를 생산하기 위해 최적화되어야한다. 인구 (<1 %)에서 약간의 세포 플라스미드 사본 수의 변화로 인해 비정상적으로 높거나 낮은 전반적인 형광이있을 수 있습니다, 이러한 세포의 대다수의 해석 이미지를 캡처에 찬성 무시 될 수 있습니다.
미토 roGFP의 장점은 분명 있지만, 그것은 잠재적 인 함정을 인식하는 것도 중요합니다. 우리는 감지세포 대사에 탄소 소스에 의한 차이뿐만 아니라, 동일한 매체의 다른 배치에있는 효모의 번식에 따라 단지 미토콘드리아의 산화 환원 전위의 차이. 미토콘드리아의 산화 환원 측정을위한 세포 성장 매체를 선택할 때, 따라서주의를 기울여야합니다. 미토 roGFP는 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 전례없는 공간 해상도를 제공하지만 또, roGFP의 시간적 해상도는 ROS 신호 전달 31과 관련된 ROS의 파열을 감지하기에 충분하지 않습니다. roGFP의 산화 형태의 여기 파장과 강도를 선택할 때 마지막으로주의해야한다. 400 nm에서 조명 최적 roGFP의 산화 종을 흥분. 그러나, 그것은 또한 365 nm에서 여기에 비해 큰 범위로 감소 roGFP을 자극. 이 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 측정하는 감소 감도로 연결됩니다. 400 nm에서 강도 높은 조명에 미토 roGFP1의 또한 노출 사양에 단백질의 광 변환에 이르게변경된 스펙트럼 특성을 가진 IES. 우리는 365 nm에서 강도 높은 조명에 따라 광 변환을 보지 못했어요. 그러므로, 우리는 가능하면 365 나노 미터를 사용하여 여기를 추천합니다.
MitGO-ATeam2는 한계가있다. mitGO-ATeam2 자체가 단백질이기 때문에 예를 들어, 그것의 바이오 센서의 활동을 손상시킬 수 반응성 산소 종을 포함한 세포 모욕에 의해 손상 될 수 있습니다. 또한, GFP 및 OFP 방출 파장 (510 nm의 560)는 기존의 형광 현미경에 어려울 수 있습니다 분석, FRET을 위해 해결해야합니다.
체외 효소 분석과는 달리, 이러한 살아있는 세포 분석은 미토콘드리아의 ATP 또는 산화 환원 상태의 상대적 변화를보고하고 ATP의 절대 농도 또는 축소 시스테인을 측정하지 않는다. 표준 곡선은 이론적으로 용액에 센서 단백질의 반응을 측정하여 생성 할 수 있지만,이 미토콘드리아 내에서 서로 다른 분자 환경에 적용되지 않을 수도 있습니다. 거기 efore의 이러한 분석은 서로 다른 조건에서 세포를 비교하는 방법을 제공합니다. 또한, 이미징 조건 변경 한 영상 설정에 인수 정확한 비율 값이 다른에 복제되지 않을 수 있습니다.
비율 이미징을위한이 기술은 다른 roGFP 또는 GO-ATeam의 아형 및 기타 기능 프로브를 포함하여 다른 비례 지표에 대해 적용 할 수 있습니다. 넓은 필드 또는 공 촛점 현미경의 선택은 프로브와 필요한 공간 해상도에 따라 달라집니다. 이 센서의 감도와 안정성을 향상 365 nm의에서 흥분을 수 있기 때문에 넓은 필드 방법은 미토 roGFP 여기를 사용 하였다. 로 mitGO-Ateam 여기 사용되는 분광 검출기와 공 촛점 방법은 스펙트럼 검출 창을 조정하여 배출 크로스 오버를 제거 할 수있는 편리한 방법을 제공합니다. 그러나 사용자 지정 필터를 사용하거나 계산 크로스 오버를 제거하여 넓은 필드 현미경에서 유사한 실험을 수행 할 수 있습니다.
ntent "> 영상 실험의이 유형의 가장 일반적인 어려움이 부족한 신호입니다. 이미징 하드웨어 (특히 대물 렌즈와 검출기) 충분한 데이터를 해석하는 신호를 수집하기 위해 중요합니다.배경 픽셀의 포함을 얻은 비율에 어떤 경향을 저해 할 수 thresholding을 단계가 결과에 큰 영향을 미친다. 자동 방법은 바람직하지만, 제한된 신호로 인해, 수동 임계 값은 종종 가능한 최선의 방법입니다. 수동 임계 값을 사용하는 경우, 사용 된 기준은뿐만 아니라 가능한 한 관절되어야하고, 분석 재현성을 입증하기 위해 다른 실험자 또는 장님 수행해야 할 수 있습니다. antimycin (mitGO-Ateam2 용)과 H 2 O 2 DTT (미토 roGFP 용)를 제어 실험은 형광 비율에서 예상 변경 사항을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
미토 roGFP 및 mitGO-ATeam2 모니터링 미토에 대한 비 침습, 비례 프로브입니다효모 세포를 살아있는 chondrial 피트니스. 여기에 사용되는 비례 센서는 미토콘드리아 특정 신호 시퀀스의 융합에 의한 미토콘드리아를 대상으로 하였다. 다른 세포 구획은 원래의 센서에 적합한 대상 시퀀스의 추가와 함께 공부를 할 수 있습니다. 또한, 동시에 살아있는 세포에서 여러 프로세스를 측정하는 보완 형광 마커 (세포 기관 또는 신호 요인 등) 또는 센서 (예를 들면 칼슘)와 이러한 센서 중 하나를 결합 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 HHMI 56,006,760에서 (GM45735, JDV, DMAW에 국립 보건원 (NIH) (2 TL1 RR 24158-6)와 엘리슨 의료 재단 (AG-SS-2465)와 NIH에서 수상에 의해 지원되었다 GM45735S1 및 GM096445) LP합니다. GM45735S1는 미국의 복구 및 2009 년 재투자 법 아래에있는 NIH에서 발행되었다. 이 연구에 사용 된 현미경은 NIH / NCI 부여 (5 P30 CA13696)를 통해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution. |
| SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
| SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
| Valap | Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin |
||
| Equipment and Software | |||
| Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm |
| High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance |
| Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm) |
| A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective | Nikon (Melville, NY) | ||
| AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software | Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan) | ||
| Volocity 3D Image Analysis software | Perkin Elmer (Waltham, MA) | Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement | |
| ImageJ software | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
- Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
- Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).
- Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
- Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).
- Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).
- Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).
- Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).
- Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).
- Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).
- Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
- Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
- Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
- Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
- Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
- Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).
- DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
- Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
- Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).
- Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).
- Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).
- Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. , 45-57 (2006).
