Summary
Kontaktløs dielektroforese (cDEP) opnår sortering og berigelse af partikler via deres iboende dielektriske egenskaber. Fluidic elektrode kanaler erstatte metalelektroder traditionelle til DEP, passer cDEP til ikke-skadelige steril karakterisering og sortering af biologiske partikler. Vi viser, hvordan du forbereder en cDEP microdevice og gennemføre celle karakterisering og sortering eksperimenter.
Abstract
Dielektroforese (DEP) er det fænomen, som polariserede partikler i en ikke-ensartet elektrisk felt undergår translatorisk bevægelse, og kan anvendes til at styre bevægelsen af mikropartikler i en overflade markør-uafhængig måde. Traditionelt DEP enheder omfatter plane metalelektroder mønstrede i prøven kanal. Denne fremgangsmåde kan være dyrt og kræver en specialiseret rentrumsmiljø. For nylig har en kontakt-fri tilgang kaldet kontaktløs dielektroforese (cDEP) blevet udviklet. Denne metode udnytter den klassiske princip om DEP samtidig undgå direkte kontakt mellem elektroder og prøve ved patterning fluidstyrede elektroder og en prøve kanal fra en enkelt polydimethylsiloxan (PDMS) substrat, og har ansøgning som en hurtig mikrofluid strategi designet til at sortere og berige mikropartikler. Enestående for denne metode er, at det elektriske felt genereres via strømningstekniske elektrode kanaler med en stærkt ledende væske, som er adskilt fraprøve kanal med en tynd isolerende barriere. Fordi metal elektroder ikke direkte kontakt med prøven, er elektrolyse, elektrode delaminering og kontamination prøve undgås. Derudover giver dette en billig og simpel fremstillingsproces.
cDEP er således velegnet til at manipulere følsomme biologiske partikler. Den dielektroforetiske kraft, der virker på partiklerne afhænger ikke kun på rumlige gradienter af det elektriske felt genereres af tilpasses design af indretningen geometri, men de iboende biofysiske egenskaber af cellen. Som sådan cDEP er en etiket-fri teknik, der undgår afhængigt overfladeudtrykte molekylære biomarkører, der kan være variabelt udtryk i en population, mens det stadig tillader karakterisering, berigelse, og sortering af biopartikler.
Her viser vi det grundlæggende i fabrikation og eksperimenter ved hjælp cDEP. Vi forklarer den enkle tilberedning af en cDEP chip bruger blød litografiy teknikker. Vi diskuterer den eksperimentelle fremgangsmåde for karakterisering delefrekvensen af en partikel eller celle, frekvensen, ved hvilken dielektroforetiske kraft er nul. Endelig vil vi demonstrere brugen af denne teknik til sortering af en blanding af kræft i æggestokkene celler og fluorescerende mikrosfærer (perler).
Introduction
Biologisk prøve berigelse og partikel sortering er ofte nødvendigt for efterfølgende analyse. 1. For eksempel isolering af sjældne celler fra kropsvæsker har vigtige anvendelser i kræft påvisning og individualiseret medicin. 2,3 De mest almindeligt anvendte berigelses teknikker er fluorescerende cellesortering (FACS ) 4 og magnetisk cellesortering (MACS), 5, som afhængige udtrykte overflade markører til at skelne celler. Andre strategier omfatter hydrodynamisk 6 eller inertiel 7,8 sortering, optisk pincet, 9 akustoforese, 10 og dielektroforese. 11,12 dielektroforese er bevægelsen af et polariseret partikel i tilstedeværelse af en uensartet elektrisk felt. 13. DEP har været brugt til en bred vifte af applikationer, 2,14 herunder sortering celler baseret på bæredygtighed, 15. karakteriserer bioelektriske egenskaber af celler, 16 og sorterening på inducerede ændringer i biofysiske egenskaber af celler. 17,18 Traditionelle DEP udnytter plane elektroder mønstrede inden for en mikrofluid kanal til at anvende en spænding og inducere en ikke-ensartet elektrisk felt. 13. Selv om dette er en kraftfuld teknik, kan udfordringer opstår, såsom elektrode delaminering og elektrolyse. Insulator-baserede dielektroforese (IDEP) 19 har taget de udfordringer, begroning, elektrode delaminering og rumlig nedbrydning af elektroden område gennem patterning isolerende strukturer, der inducerer uensartetheder i et DC elektrisk felt. IDEP er blevet anvendt til selektivt at adskille levende og døde bakterieceller, 19 isolere bakteriesporer, 20 og manipulere DNA, 21 blandt andre anvendelser. Joule-opvarmning kan være en udfordring, fordi det kan forekomme som et resultat af de høje DC spændinger ofte påkrævet. For at mildne disse udfordringer, har kontakt-fri DEP microdevices blevet udviklet. 22-24
22. Unikt for denne strategi er udskiftningen af metalliske elektroder med flydende elektrode-kanaler fyldt med en stærkt ledende opløsning. Disse flydende elektroder kapacitivt koblet på tværs af en tynd isolerende barriere til prøven kanal via en AC-spænding. Eliminering prøve kontakt med elektroder reducerer problemer forbundet med DEP-baserede metoder såsom elektrolyse og boble dannelse, forurening prøve og elektrode delaminering. Som et resultat, cDEP er især nyttig for biologiske prøver, fordi det understøtter levedygtigheden af cellerne i prøven. Vigtigt er det, kan cDEP vedligeholde prøve sterilitet. En chip kan tilberedes i en cellekultur hætte og forsøget kan gennemføres uden at kræve prøve kontakt til metal elektroder eller kræver, at prøven være åben for environment. En simpel reservoir kan fastgøres til chip outlet at lette steril af prøven. Desuden fremstilling af væske elektroder fra samme biokompatibel polymer materiale (PDMS) som prøve kanal reducerer den høje omkostning med brugerdefineret mønster af metal elektroder, den nødvendige tid til fremstilling og begrænser behovet for specialiseret renrum udstyr til det oprindelige mønster af den genanvendelige silicium wafer stempel.
Bevægelse af partikler på grund af DEP afhænger af egenskaberne af partiklen og medium, samt de rumlige gradienter af det elektriske felt. En partikel-og frekvensafhængig faktor, kaldet Clausius-Mossotti (CM) faktor, tager en værdi i området -0,5 til 1, og bestemmer retningen af DEP kraft. Den frekvens, ved hvilken CM faktor er præcis nul kaldes delefrekvensen. Dette er det punkt, hvor der ikke sker dielektrophoretisk kraft på en partikel og CM faktor ændringer tegn. A sIngle delefrekvens for inaktive faste mikrosfærer opstår, når CM faktor skifter fra negativ til positiv 25 For pattedyrceller i lav ledningsevne buffer i størrelsesordenen 0,01 S / m, en første crossover frekvens indikerer en overgang fra NDEP til pDEP eksisterer nær 10.. - 100 kHz, og er påvirket af størrelse, form, cytoskelettet og membran egenskaber af cellen. 26,27 En anden delefrekvens på et skift fra den pDEP til NDEP regime er på rækkefølgen af 10 MHz, og er påvirket af kerne-cytoplasma ratio cytoplasma ledningsevne og endoplasmatiske reticulum. 27 DEP kraft kan anvendes uden tilstedeværelse af væske flow, men her bruger vi en flydende væske til at opnå vedvarende sortering af suspenderede partikler. Den kombinerede påvirkning af dielektrophoretisk kraft og Stokes 'trækkraften diktere translatoriske bevægelse af en partikel.
Vi har udviklet indretninger til drift i to frekvensområder. Højere frekvenseny enheder (100-600 kHz) har fungeret ved hjælp pDEP og opnåede batch sortering af celler, såsom prostata tumorfremkaldende celler (tics), murine æggestokkene overflade epithelial (Mose) celler, MDA-MB-231 brystkræftceller, eller leve THP -1 celler ved selektivt at fange celler af interesse på isolerende stillinger placeret i prøven kanal. 28-31 lavere frekvens (5-100 kHz) enheder opererer kontinuerligt, og når der drives på en frekvens, ved hvilken en befolkning oplever pDEP mens befolkningen erfaringer baggrund NDEP kan omdirigere partikelbaner at opnå sorting. 32-34 Disse lavfrekvente indretninger er blevet anvendt til at sortere cancerceller fra røde blodlegemer, at bestemme ændringer i de dielektriske egenskaber i en progressiv MOSE cellelinie, og til at belyse virkningerne af ikke- giftige sphingolipid behandlinger på at vende aggressive karakteristika af aggressive Mose celler. Derudover kan cDEP microdevices være designet til at operere på øget gennemløb, i øjeblikket op til 1 ml / hr.. 31,35
Som beskrevet, fleksibilitet og lave omkostninger i produktionsprocessen muliggør custom-designet enhed geometrier, der tillader præsenterede eksperimentelle procedure at være relevante for en bred vifte af applikationer. Det langsigtede mål for cDEP er at realisere etiket-fri celle sortering og berigelse på et klinisk niveau, med prøve opsving for efterfølgende kultur eller forarbejdning. Teknikken præsenteres her er en enkel og billig metode, fra fabrikation til eksperimenter, hvilket øger tilgængeligheden af DEP. Vi demonstrerer udarbejdelse af en cDEP chip og forsøgsprotokollen at opnå karakterisering og berigelse af kræft i æggestokkene celler fra fluorescerende mikrosfærer.
Protocol
1.. Opdigte en Prototype cDEP Mikrofluid Device: Oversigt
- Følg tidligere rapporterede procedurer 22 ved hjælp af fotoresist og Deep reaktiv ion ætsning (DRIE) at ætse den ønskede kanal konstruktion (figur 1) i en silicium wafer (figur 2). Deponere et tyndt lag af Teflon til at forbedre frigivelsen af microdevice fra skiven.
Figur 1. Skematisk af en lav frekvens kontinuerlig sortering enhed. Prøvens kanal løber fra venstre mod højre og er 500 um bred med savtakket indsnævringer til 100 um. De to par strømningstekniske elektrode kanaler komponere kilde og vask elektroder henholdsvis og er adskilt fra prøven kanal ved en 20 um tyk PDMS barriere.
Figur 2. Den fabrication proces en cDEP enhed. (a) Ved 60 sek, UV-lys selektivt reagerer med fotoresist eksponeres gennem en maske mønster af cDEP enheden geometri. (b) fotoresist fjernes under anvendelse udvikler. (c) Deep reaktiv ion ætsning (DRIE) bruges til at ætse 50 um dybe features, og 5 min af våd ætsning af tetramethylammoniumhydroxid (TMAH) 25% ved 70 ° C anvendes til at reducere ruhed på sidevæggene. (d) Der tilføjes en Teflon belægning for at forbedre enhedens frigivelse fra wafer. (e) PDMS hældt på genbrugelige wafer stempel efter afgasning og hærdet i 45 minutter ved 100 ° C. (f) PDMS fjernes fra skiven. PDMS og en ren glasplade er udsat for luft plasma i 2 minutter og bindes sammen.
- Wrap wafer med alufolie for at forhindre afsmittende. Bland polydimethylsiloxan (PDMS) i 10:1 elastomer at hærder, de-gas i ca 20 min, Og hæld på skiven. Varme i 45 minutter ved 100 ° C for at undgå at beskadige Teflon belægning af frimærket. Lad enheden køle af.
- Efter afkøling fjernes aluminiumsfolie, trim PDMS ved hjælp af en kirurgisk kniv, og punch adgang huller kanal indløb / udløb ved hjælp af en stump Hullemaskine passer til størrelsen af slangen. Her er et 1,5 mm stump Hullemaskine anvendes.
- Rengør et objektglas ved hjælp af en skylning af sæbe og vand, ethanol, DI vand og tørring med luft. Rengør PDMS enheden ved hjælp af Scotch Magic tape. Undersøg under mikroskop for at være sikker på kanaler er rene. Expose slide og PDMS-enhed til luft plasma til 2 min. Tryk godt kanal side af enheden til objektglas, undgå dannelse af luftbobler mellem enheden og dias (Figur 3).
Figur 3. (a) Masken bruges til fotolitografi under silicium wafer stempel fabrikation, og (b) det færdige PDMS-glas-enhed med prøven og fluid elektrode kanaler fyldt med grøn og rød frugtfarve, hhv. Se figur 1 for dimensioner. Klik her for at se større figur .
2. Forberedelse af en cellesuspension i DEP Buffer
- Forbered en lav ledningsevne (100 uS / cm) buffer, som vil blive omtalt som "DEP buffer" (8,5% saccharose [w / v], 0,3% glucose [w / v], 0,725% RPMI [w / v]) . 16.
- Suspendere cellerne i DEP-buffer ved 3 x 10 6 celler / ml. Her bliver kræft sen-fase mus æggestokkene overflade epitelial (MOSE-L) celler anvendes.
Bemærk: Cellelevedygtighed analyse ved trypanblåt farveeksklusion metode udviste et lille fald i levedygtighed(95,1-91,6%) af tidlige stadier Mose (MOSE-E) celler suspenderet i DEP buffer ved stuetemperatur efter 5 timer. Det forudses, at en lignende lille fald i levedygtighed gælde for MOSE-L-celler, hvilket indikerer, at cellerne ikke skal opbevares i DEP buffer lang sigt.
- Dye celler under anvendelse af en fluorescerende membran-permeabel farvestof, såsom enzymatisk aktiveret Calcein AM.
- Mål ledningsevnen af det farvede cellesuspension. Ledningsevnen bør være omkring 100 uS / cm. Hvis målingen af ledningsevnen er for høj, roterer prøven ned, resuspenderes i DEP-buffer ved 3 x 10 6 celler / ml, og gentag målingen ledningsevne.
3. Ilægning af cDEP Mikrofluid Chip
- Placer mikrofluid chip under vakuum i 30 minutter.
- I mellemtiden skæres et stykke fleksibel slange til at spænde over afstanden fra sprøjtepumpen til mikroskopbordet hvor mikrofluid chip vil blive placeret. Her en 6 tommer længde slangeer påkrævet. Tilpas slangen til nålespidsen på sprøjten.
- Vurdere den ønskede længde for udløb slange ved at dividere målet indsamlede prøvemængde af tværsnitsarealet af røret. Skær kræver længden af slangen.
- Tegn cellesuspensionen i sprøjten. Kontroller, at ingen bobler er placeret i røret eller sprøjten.
- Ved at fjerne chip fra vakuum, indsæt udløbsslangen og prime prøven kanal hurtigt for at undgå luftbobler i kanalerne. Bank forsigtigt på sprøjten, når priming for at undgå brud på tynd (20 pm) isolerende barriere, selv om det er blevet observeret, at barrieren kan modstå en konstant høj kapacitet nær 5 ml / time uden at briste.
- Til prime elektrode-kanaler hurtigt placere tomme pipettespidser i et udløb af hver fluidiske elektrode kanal. Pipettere 200 ul PBS indeholdende en lille mængde af rhodamin B og blidt tryk til at indføre fluid i den modsatte ende af elektroden kanal. Oprethold blide trykindtil PBS med rhodamin B synligt skrider spids op i det tomme pipettespidsen. Gentag for hver elektrode kanal. Rhodamin B bruges kun til fluorescens visualisere fluidumydelse elektrode kanaler.
- Efter grunding, fylde hver pipette spids reservoir med PBS med rhodamine B. Undgå dannelse af luftbobler i pipettespidsen reservoirer, og fjern alle synlige boble ved pipettering forsigtigt op og ned. Tag udløbsslangen og kassere korrekt, derefter indsætte en ny stikkontakt slange reservoir til at indsamle målet volumen.
4.. Karakteriserer Delefrekvens Celler bruger cDEP Chip
- Placer chip på scenen af et inverteret mikroskop udstyret med digital kamera (Figur 4).
Figur 4.. (a) Samlet forsøgsopstilling for cDEP eksperimenter. Den cDEP chip er placeret på platformen af inverteret mikroskop. Et kamera sender billeder til computeren til optagelse. Sprøjtepumpen opretholder et konstant indløb flow. Funktionen generator genererer et signal, der intensiverer den høje spænding forstærker og forbundet til cDEP chip med trådelektroder. Oscilloskopet overvåger signal sendes til chippen. (B) Detaljeret visning af cDEP chip og fluidiske og elektroniske forbindelser. Klik her for at se større figur .
- Monter sprøjten på sprøjtepumpe og indsæt trådelektroder i fluidiske elektrode kanal reservoirer.
- Pump fluid gennem 1 ml / time for at sikre god kontakt mellem sprøjtepumpen og sprøjten. Efterse kanal længde for at sikre uhindret strøm af celler og fraværet af bobler eller lækager. RødUCE flow til 0,005 ml / time.
Bemærk: Throughput så højt som 1 ml / time 31,35 er opnået i enheder fra andre geometrier. - Af sikkerhedshensyn teste elektronikken ved at tænde på den funktion generator, højspænding forstærker, og oscilloskop og justere til den ønskede spænding og frekvens. Her disse parametre er 200 V og 20 kHz. Ved kontrol af acceptabel ydeevne skal du slukke. Forbind elektroderne til højspænding forstærker.
Bemærk: Overhold passende elektrisk sikkerhedsprocedurer, når de opererer elektronikken ved de høje spændinger, der bruges til disse eksperimenter. - Efter opnåelse af stabil strømning, anvende den ønskede spænding ved den ønskede frekvens. I dette eksperiment spænding er 200 V RMS ved frekvenser mellem 5-60 kHz.
- Optag video filer af celle respons med billede behandlingsteknikker (trin 5) at kvantificere celle fordeling i kanalen og at beskrive delefrekvensen. For at gøre dette,opretholde en konstant spænding og variere frekvensen systematisk. Ved begyndelsen og slutningen af forsøget, samt tilfældigt mellem eksperimentelle kørsler, optage kontrolcellepopulationen distribution, fordelingen af celler uden at anvende elektrisk felt. Vurdere mængden af tid, der kræves for celler til at strømme fra indløbet til overvåget sted (her, 5 min). Efter indstilling af en ny frekvens, vent denne mængde af tid, derefter begynde optagelse (her, en 2 min video af celle distribution).
5.. Image Processing til at karakterisere Delefrekvens
- Ved hjælp af en beregningsmæssige script, analysere hver videoramme af rammen for at bestemme den relative y-position (hvor z-retningen er den lodrette dybde af kanalen, y-retningen er kanalbredden og x-retningen er den kanal længde) af hver fluorescerende celle eller partikel ved en specificeret x-koordinat nedstrøms fra regionen høj DEP kraft i kanalen. Opret en graf af de relative disbidrag.
- Sammenlign midterlinie fordelingen ved hver spænding og frekvens med centerlinien af kontrol distribution. For en given spænding og varierende frekvenser, bestemme delefrekvensen, hvor midterlinjen matcher y-positionen af kontrollen.
6.. Varierende Experiment at Perform Cell Sorting eller berigelse
- Suspend ønskede blanding i DEP-puffer ved en total koncentration på 3 x 10 6 partikler / ml. Her denne blanding er MOSE-L-celler med 4 um fluorescerende perler i DEP-buffer. Udfør de tidligere beskrevne skridt til at forberede en cDEP enhed.
- Hvis du vil sortere eller berige celler fra en blanding, bestemme crossover frekvenser af target-celler og baggrunden partikler som tidligere beskrevet. Betjen eksperimentet med en frekvens mellem de to crossover frekvenser af target-celler og baggrunden partiklerne således at de to populationer af partikler oplever DEP styrker i modsat directions. Hvis du vil sortere MOSE-L-celler og 4 um perler, betjene microdevice over 11,90 ± 0,63 kHz. den første crossover frekvensen af MOSE-L-celler for nylig rapporteret af Salmanzadeh et al. 33.
- At indsamle indholdet af en sorteret prøve fjerne udløbsslangen ved at indsamle de mønter, ved at placere en handske finger over udløbsåbningen og trække forsigtigt i slangen. Hæld den indsamlede target volumen ind i et reservoir for yderligere analyse Bemærk:. Andre prøve opsving metoder kunne omfatte fastgørelse af en permanent reservoir til chip og fjerne prøven ved simpel pipettering.
Representative Results
DEP bør observeres kvalitativt i prøven kanal for at bekræfte at enheden er i drift, når det elektriske felt er til stede. En metode til at teste for tilstedeværelsen af DEP er at justere frekvensen til værdier langt fra delefrekvensen hvor stærk pDEP og NDEP forudsiges (ca.> 40 kHz at observere pDEP og <10 kHz for at observere NDEP for de fleste pattedyr kræftceller i en buffer med ledningsevne på 100 uS / cm). Det skal bemærkes, at inerte mikrosfærer udviser pDEP under deres delefrekvens og NDEP over deres delefrekvensen. For savtakket funktion geometri præsenteres her, bør pDEP ses for celler ved højere frekvenser angivet ved forekomsten af perle kæde og fokusering af celler eller partikler på savtakket træk kanten af kanalen, mens den lavere frekvenser NDEP skulle fremgå som celler er begrænset til området nærmere linealen af kanalen. Ved disse lave frekvenser kan celler Lyse på grund af elektroporation, så prøven kan synes at indeholde færre celler, og dem, der er synlige kan vises forstørret eller sløret hvis du bruger en enzymatisk aktiveret fluorescerende farvestof. Kontrol af frekvenser, ved hvilke pDEP og NDEP forekommer muliggør bestemmelse af delefrekvensen som beskrevet i protokollen. For mammale cancerceller, såsom MOSE-L, der anvendes her, har vi observeret NDEP ved 5 kHz (figur 5a) og stærk pDEP ved 60 kHz (fig. 5b). MOSE-L-celler havde en diameter på 17,7 ± 3,3 um (n = 268 celler), og perlerne har en 4 um nominel diameter. Der findes en fuldstændig analyse af de dielektriske egenskaber MOSE-L-celler i forhold til Mose celler i tidligere stadier af progression i den nylige arbejde af Salmanzadeh et al. 33.
Hvis pDEP og NDEP ikke overholdes på disse ekstremer kan forskellige problemer kan opstå. Prøven ledningsevne kan være for høj på grund af forurenende stoffer eller cellelyseringsmidler. IKKE NOKnt elektrisk felt kan genereres på grund af bobler fanget i væsken elektrode kanaler, som forhindrer ledning af strøm til den del af de kanaler, der grænser op til prøven kanal. Unsteady flow kan være forårsaget af en boble fanget i sprøjten eller indløbsrøret, bobler som følge af enheden ikke holde under vakuum i en tilstrækkelig tid eller ikke hurtigt at fylde enheden ved fjernelse fra vakuum lækage som følge af delaminering af dårligt bundne PDMS til objektglas, tårer i barrieremembranen grund af overdreven kraft, der virker, når du fylder kanalerne, eller strømningshastigheder på de yderste områder af pumpens driftsområde.
Ud over at fastslå delefrekvensen af celler, kan denne teknik anvendes til at sortere en blanding, der er illustreret her ved en blanding af MOSE-L-celler og perler. Dette eksempel drager fordel af negativ dielektroforese (NDEP) udviste med 4 um perler ved frekvenser, hvor MOSE-L-celler oplever positiv dielektroforese (pDEP). Vi operated enheden ved 200 V RMS og 10 kHz (figur 6a) og bemærkede, at begge celler og perler blev blandet, da de oplevede NDEP. 50 kHz observerede vi bevægelse af MOSE-L-celler til toppen af kanalen, mens perlerne blev begrænset til den nedre del af kanalen, hvilket muliggør adskillelse af blandingen i to komponenter (figur 6b).
Figur 5. Position MOSE-L-celler manipuleres ved at ændre frekvensen af den anvendte elektriske felt. Billederne er taget på det endelige savtakket funktion i prøven kanal og fluidumydelse elektroder er placeret i hjørnerne på højre side. De er fyldt med PBS indeholdende rhodamin B, der fluorescerer at visualisere kanaler. (A) MOSE-L-celler oplever NDEP ved 200 V RMS og 5 kHz. (b) MOSE-L-celler oplever perle kæde og pDEP ved 200 V RMS og 60 kHz. Klik her for at se større figur .
Figur 6. En blanding af MOSE-L-celler (grøn) og 4 um perler (rød) strømme gennem den endelige savtakket funktion i prøven kanal af en lavfrekvent cDEP enhed. (A) ved 200 V og 10 kHz celler og perler er blandet. Pile peger på svagt optræder celler, der sandsynligvis er døde på grund af de forhold med lave frekvens. (B) Ved 200 V og 50 kHz celler oplever pDEP og flytte til funktionen kant på kanalen, mens perler oplever NDEP og fortsat være begrænset til regionen nærmere linealen.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Discussion
DEP er en kraftfuld teknik til bestemmelse af de dielektriske egenskaber af partikler og lede partikel bevægelse i retning sortering, isolation eller berigelse applikationer. På grund af de skadelige virkninger af direkte elektrode kontakt med en prøve, mens andre har taget tilgange ligner den tidligere præsenterede metode til at undgå kontakt. For eksempel Bashir et al. Udviklet kontaktlister-fri DEP enheder ved hjælp af en mikrofluid PDMS enhed adskilt fra printpladeteknikker elektroder af en tynd dækglas, og denne teknik er også gjort tilgængelig i videoformat. 23,36
Her har vi vist, at fremstillingen af en cDEP chip og strømningstekniske elektroder ved hjælp af en enkelt PDMS substratet og forsøgsprotokollen til separering af ovariecancerceller fra en blanding af celler og fluorescerende kugler. De præsenterede teknik er med succes blevet brugt til en række mere komplekse og fysiologisk relevante anvendelser, herunder sortering live og døde celler, 28 tumorfremkaldende celler fra prostata kræftceller, 30 kræftceller fra fortyndede røde blodlegemer, 31,32 og differentiere mellem stadier af brystkræft 37 og kræft i æggestokkene. 29. cDEP er også blevet brugt til at blande partikler. 38. Disse ansøgninger antyder, at ved hjælp af simpel teknik præsenteres, kan forskellige formål opnås blot ved at ændre udformningen af kanalens geometri.
. DEP er nyttig på mikroskala for manipulation af partikler 13 For sfæriske partikler, den translationelle dielektrophoretisk kraft afhænger af størrelse og elektriske egenskaber af partiklen og dens suspenderingsmedium samt gradienten af det elektriske felt squared:
hvor ε m er permittivitet suspension medium, r er radiusaf partiklen, og Rc [k (ω)] er den reelle del af Clausius-Mossotti (CM) faktor. CM faktor er et mål for den relative polariserbarhed af partiklen i forhold til den suspenderende medium og bestemmer retningen af dielektrophoretisk kraft. Det er beskrevet som
hvor 
og 
er komplekse permittivities af partiklen og mellemstore hhv. Den komplekse permittivitet, 
, Afhænger af ledningsevne (σ) og frekvens (ω). CM faktor sfæriske partikler er teoretisk bundet mellem -0.5 og 1. Hvis CM faktor er negativ, partiklerne oplever NDEP fordi mediet er mere polariserbar end partiklen, så partiklerne bevæger sig væk fra regionerhøje elektriske feltgradienter. Hvis CM faktor er positivt, at partiklerne er mere polariserbar end mellemlang og de oplever pDEP, hvor de bevæger sig mod regioner med høj elektrisk feltgradienter.
For biologiske partikler, som er ikke-homogen struktur, såsom celler, kan Clausius-Mossotti faktor bestemmes ud fra en effektiv værdi for partikel permittivitet:
hvor 
og 
er den komplekse permittivitet af den effektive komplekse permittivitet af det indre af cellen, såsom cytoplasmaet og plasmamembranen hhv. r er radius af cellen, og d er tykkelsen af plasmamembranen 26
Når DEP optræder med partikler suspenderet i envæske, vil bevægelse af partiklen i forhold til væsken generere et træk kraft på partiklen. Må anses dette træk kraft, når fastsættelsen af det samlede kraft, der handler på partiklen. For de situationer af interesse her, viskose kræfter dominere og partikler antages sfæriske, lille, og bevæger sig med en relativ lav hastighed, så Stokes 'trække loven giver en god tilnærmelse for træk kraft:
hvor η er viskositeten af fluidet, u p er partiklens hastighed, og u f er hastigheden af væske, som også kan bevæge sig. I betragtning af den dielektroforetiske kraft, der er kendt væske og partikel egenskaber og en kendt strømningshastighed kan balancen mellem trækkraften og dielektroforetiske kraft løses at estimere partikelhastigheden. Den shear rate, at cellerne erfaring skal være under den grænse, hvor ckan forekomme ell lysering.
Karakterisering af de elektriske egenskaber af partikler er nødvendig for at forudsige og kontrollere, hvordan de vil reagere under DEP dem. I dette arbejde, vi specifikt udnyttet lavfrekvente cDEP med MOSE-L-celler til at demonstrere protokollen til bestemmelse af første crossover frekvens af celler, og derefter viste løbende sortering af polystyren perler og MOSE-L-celler baseret på deres modsatrettede DEP svar.
Ændring geometri cDEP enheden vil ændre de rumlige gradienter af det elektriske felt, så enheder at være designet til høj frekvens eller drift ved lave frekvenser, og høj selektivitet og effektivitet af sortering for en bestemt celletype. Derudover kan højkapacitets enheder udvikles ved fremstilling bredere kanaler 30 kanaler i parallel, 30 eller af flerlags fremstilling 35, hvor elektrode kanalerne er vertikalt stablet over og under et relativt dybeprøve kanal. Tynde membraner danner barrieren mellem lagene. Indledende test med enheder fremstillet i polymethylmethacrylat (PMMA) og polykarbonat (PC) tynde film har vist DEP reaktion MOSE-L-celler. Den nuværende indsats i gang for at forfine flere lag high-throughput-enheder og forbedre perifere system i retning af en eventuel plug-and-play-platform. At udvide fra den grundlæggende eksperimentel teknik præsenteret, kan ansøgningerne og specifikationer på enheden være skræddersyet til at passe særlige krav, såsom sortering versus karakterisering eller tilføje prøvebeholdere og en semi-automatiseret system til enheden.
Disclosures
Dr. Rafael Davalos har en patentanmeldt for kontaktløs dielektroforese.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes, er blevet støttet delvist af National Science Foundation under Grant No EFRI 0938047, og ved Virginia Tech Institut for kritisk teknologi og Applied Science (ICTAS). Forfatterne vil gerne udtrykke påskønnelse til Dr. Eva Schmelz og Dr. Paul Roberts for deres venlige gave MOSE-L-celler. Forfatterne erkender Angela Anderson for hendes hjælp med cellekultur, Caitlan Swaffar for hendes hjælp med at redigere dette dokument og forberede eksperimenter, og alle Bioelectromechanical Systems lab medlemmer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI,USA | Sylgard 184 | |
| Glass slides | The Microscope Depot | 76079 | 2x3 inch-ground edges |
| Microbore PTFE Tubing | Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA | EW-06417-31 | Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll |
| Luer-slip plastic syringes | National Scientific company | S7510-1 | |
| Needle tip | Howard Electronic instruments | JG20-1.0 | 20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036" |
| D(+)-Sucrose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S3-500 | |
| D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous | Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ | AC410955000 | |
| RPMI-1640 Medium | Quality Biological Inc. | 112-025-101 | |
| Calcein AM, Molecular Probes | Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA | C3100MP | excitation wavelength 488/emission wavelength 516 |
| Rhodamine B, O | Science Lab | SLR1465-100G | excitation wavelength 540/emission wavelength 625 |
| Phosphate buffered saline (10X) | Gbiosciences, St. Louis, MO | RC-147 | |
| Leica, inverted light microscope | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DMI 6000B | |
| Leica DFC420, color camera | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DFC420 | |
| Function generator | GW Instek, Taipei, Taiwan | GFG-3015 | |
| Wideband power amplifier | Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA | AL-50HF-A | |
| HFHV Output Transformer | AL-T50-V25/300-F100K-600K | ||
| High voltage amplifier | Trek | Model 2205 | |
| USB Modular Oscilloscope, 100 MHz | AgilentTechnologies | U2701A | |
| Expanded Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001/002 (115/230V) | air plasma |
| Scotch Magic tape | 3M | any available width is sufficient | |
| 1.5 mm puncher | Harris Uni-Core | Z708836-25EA | |
| .25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FluoSpheres Sulfate Microspheres | Invitrogen | F8858 | 4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605) |
| AZ 9260 photoresist | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K developer | AZ Electronic Materials | ||
| Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25% | provided by Virginia Tech cleanroom | ||
| Teflon coating | applied using DRIE machine | ||
| Silicon wafer | University Wafer | 452 | 100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP) |
| Deep Reactive Ion Etching (DRIE) | Alcatrel | AMS SDE 100 |
References
- Butler, M. Cell culture and upstream processing. , Taylor & Francis. (2007).
- Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. Rare Cell Capture in Microfluidic Devices. Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).
- Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112 (2013).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).
- Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. Multitarget magnetic activated cell sorter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).
- Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).
- Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. Automated single-cell sorting system based on optical trapping. J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).
- Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond. Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).
- Pethig, R. Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, (2010).
- Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood. Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).
- Pohl, H. A. Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , Cambridge University Press. (1978).
- Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science. , Under-review (2012).
- Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis. J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).
- Flanagan, L. A., et al. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 26, 656-665 (2008).
- Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry. Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).
- Hoettges, K. F., et al. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).
- Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water. Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).
- Davalos, R. V., et al. Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators. Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).
- Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields. Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).
- Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation. Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).
- Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board. Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).
- Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures. Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).
- Hughes, M. P. AC electrokinetics: applications for nanotechnology. Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).
- Pethig, R. Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, 022811 (2010).
- Pethig, R. Ch. 4. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M. auro, Ozkan, M. ihrimah, Heller, M. ichael J. . 4, Springer. US. 103-126 (2007).
- Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP). Lab Chip. 10, 438-445 (2010).
- Salmanzadeh, A., et al. Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Salmanzadeh, A., et al. Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature. Lab Chip. 12, 182-189 (2012).
- Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis. EMBC 2012., Annual International IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Aug 28-Sep 1, San Diego, , (2012).
- Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples. Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).
- Salmanzadeh, A., et al. Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells. Biomicrofluidics. , (2013).
- Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2012 Annual International Conference of the IEEE, , 590-593 (2012).
- Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations. Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).
- Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar. J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).
- Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).
- Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).
