Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Label-fri Isolering og Anrikning av cellene gjennom Contact Dielectrophoresis

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50634
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1School of Biomedical Engineering and Science, Virginia Tech, 2Department of Engineering Science and Mechanics, Virginia Tech

Summary

Kontaktløs dielectrophoresis (cDEP) oppnår sortering og berikelse av partikler via sine iboende dielektriske egenskaper. Fluidic elektrode kanaler erstatte metallelektroder tradisjonelle til DEP, passet cDEP til ikke-ødeleggende steril karakterisering og sortering av biologiske partikler. Vi demonstrerer hvordan å forberede en cDEP microdevice og gjennomføre celle karakterisering og sortering eksperimenter.

Abstract

Dielectrophoresis (DEP) er det fenomen hvorved polariserte partikler i et ikke-uniformt elektrisk felt gjennomgå translasjonsbevegelse, og kan brukes for å dirigere bevegelsen av mikropartikler i en overflate markør-uavhengig måte. Tradisjonelt DEP enheter omfatter plane metallelektroder mønstret i utvalget kanalen. Denne fremgangsmåten kan være kostbart og krever et spesialisert renromsmiljø. Nylig har en kontakt-fri tilnærming kalt kontaktløs dielectrophoresis (cDEP) blitt utviklet. Denne metoden benytter det klassiske prinsippet DEP og samtidig unngå direkte kontakt mellom elektrodene og prøven etter mønster fluidic elektroder og en sample-kanal fra en enkelt polydimetylsiloksan (PDMS)-substrat, og kan anvendes som en rask mikrofluid strategi for å sortere og berike mikropartikler. Unikt for denne metoden er at det elektriske felt genereres via fluidtekniske kanaler elektrode inneholdende en sterkt ledende fluid, som er adskilt fra detsample-kanal ved et tynt isolerende barriere. Fordi metallelektroder ikke direkte i kontakt med prøven, blir elektrolyse, elektrodedelaminering, og prøveforurensning unngås. I tillegg gjør dette til en billig og enkel fremstillingsprosess.

cDEP er dermed godt egnet for å manipulere sensitive biologiske partikler. Den dielectrophoretic kraft som virker på partiklene avhenger ikke bare ved romlige gradienter av det elektriske felt som genereres av tilpasses utformingen av geometrien i apparatet, men den iboende biofysiske egenskapene til cellen. Som sådan, er cDEP en etikett-fri teknikk som unngår avhengig av overflate uttrykt molekylære biomarkører som kan bli ulikt uttrykt i en befolkning, som samtidig gir karakterisering, berikelse, og sortering av bioparticles.

Her viser vi det grunnleggende fabrikasjon og eksperimentering ved hjelp cDEP. Vi forklarer den enkle utarbeidelse av en cDEP chip bruker myk litografiy teknikker. Vi diskuterer den eksperimentelle fremgangsmåte for å karakterisere overgangsfrekvensen av en partikkel eller celle, den frekvens ved hvilken den dielectrophoretic kraften er null. Endelig vi demonstrere bruken av denne teknikken for sortering av en blanding av eggstokkreft celler og fluorescerende mikrosfærer (perler).

Introduction

Biologisk prøve berikelse og partikkel sortering er ofte nødvendig for senere analyse. En For eksempel isolering av sjeldne celler fra kroppsvæsker har viktige indikasjoner for kreft deteksjon og individualisert medisin. 2,3 De mest brukte berikelse teknikker er fluorescerende aktivert celle sortering (FACS ) 4 og magnetisk aktivert celle sortering (MACS), 5 som er avhengige av uttrykt overflate markører for å skille celler. Andre strategier omfatter hydrodynamisk 6 eller treghets 7,8 sortering, optiske pinsetter, 9 acoustophoresis, 10 og dielectrophoresis. 11,12 Dielectrophoresis er bevegelse av et polarisert partikkel i nærvær av et ikke-uniformt elektrisk felt. 13. DEP har vært brukt et bredt spekter av applikasjoner, 2,14 inkludert sortering celler basert på levedyktighet, 15 karakter bioelektriske egenskaper av celler, 16 og sortereing ved induserte endringer i biofysiske egenskaper av cellene. 17,18 Tradisjonelle DEP benytter plane elektroder mønstret i et mikrofluidkanal for å anvende en spenning og indusere et ikke-uniformt elektrisk felt. 13. Selv om dette er en kraftfull teknikk, kan utfordringer oppstår, så som elektrode delaminering og elektrolyse. Isolator-baserte dielectrophoresis (iDEP) 19 har adressert utfordringene i begroing, elektrode delaminering, og romlig nedbrytning av elektroden feltet gjennom mønster isolerende strukturer som induserer uensartet i en DC elektrisk felt. iDEP har vært brukt for selektivt å separere levende og døde bakterieceller, 19 isolere bakteriesporer, 20 og manipulere DNA, 21 blant andre anvendelser. Joule oppvarming kan være en utfordring fordi det kan forekomme som et resultat av den høye likespenning ofte nødvendig. For å bøte disse utfordringene, har kontaktfrie DEP Microdevices blitt utviklet. 22-24

22 Unikt for denne strategien er utskifting av metalliske elektroder med væskeelektrode kanaler fylt med en svært ledende løsning. Disse fluid elektroder er kapasitivt koblet over en tynn isolerende barriere for prøven kanalen via en vekselspenning. Eliminere prøven kontakt med elektroder reduserer problemene forbundet med DEP-baserte metoder som elektrolyse og bobledannelse, prøvekontaminering, og elektroden delaminering. Som et resultat, er cDEP spesielt nyttig for biologiske prøver fordi den støtter levedyktighet av cellene i prøven. Viktigere, kan cDEP opprettholde prøven sterilitet. En brikken kan fremstilles i en cellekultur hette og eksperimentet kan gjennomføres uten at det kreves prøvekontakt til metallelektroder eller krever at prøven være åpen for environment. En enkel reservoar kan festes til chip uttaket til rette for sterilt prøve utvinning. I tillegg er fremstillingen av fluid elektroder av samme biokompatibel polymermateriale (PDMS) som prøven kanalen reduserer de høye kostnadene som påløper med tilpasset mønster av metallelektroder, den tid som er nødvendig for bearbeiding, og begrenser behovet for spesialisert renrommet utstyr til det første mønster av gjenbruk silisium wafer stempel.

Bevegelse av partiklene på grunn av DEP avhenger av egenskapene til partikkelen og mediet, så vel som de romlige gradienter av det elektriske felt. En partikkel-og frekvens-avhengig faktor, kalt Clausius-Mossotti (CM) faktor, tar en verdi i området -0,5 til 1, og bestemmer retningen av DEP kraft. Den frekvensen som CM faktor er nøyaktig null kalles crossover frekvens. Dette er det punkt hvor ingen dielectrophoretic kraft utøves på en partikkel, og den CM faktor endringer kretsen. En single overgangsfrekvensen for inerte faste mikrosfærene oppstår når CM faktor endres fra negativ til positiv 25 For pattedyrceller i lav ledningsevne buffer av størrelsesorden på 0,01 S / m, en første delefrekvens som indikerer en overgang fra NDEP til pDEP eksisterer i nærheten av 10. - 100 kHz, og er påvirket av størrelsen, formen, cytoskjelett og membranegenskaper i cellen. 26,27 En andre delefrekvens ved en forskyvning fra pDEP til NDEP regime er av størrelsesorden 10 MHz, og er påvirket av den kjerne-cytoplasma-forhold, cytoplasma ledningsevne, og endoplasmatiske retikulum. 27. DEP kraft kan påføres uten tilstedeværelse av strømning, men her benytte et strømmende fluid for å oppnå kontinuerlig sortering av suspenderte partikler. Den kombinerte påvirkning av den dielectrophoretic kraft og Stokes 'drag force diktere translasjonsbevegelse av en partikkel.

Vi har utviklet enheter for drift i to frekvensområder. Høyere frequency enheter (100-600 kHz) har operert ved hjelp pDEP og oppnådde batch sortering av celler, som for eksempel prostata tumor initiere celler (tics), murine eggstokk overflaten epitel (Mose) celler, MDA-MB-231 brystkreftceller, eller leve THP -1 celler ved selektivt fangst celler av interesse på isolerende innlegg lokalisert i utvalget kanalen. 28-31 lavere frekvens (5-100 kHz) enheter kontinuerlig drift, og når den kjøres på en frekvens der en befolkning opplever pDEP mens bakgrunnen befolknings opplevelser NDEP, kan omdirigere partikkelbaner for å oppnå sortering. 32-34 Disse lavfrekvente enhetene er benyttet for å sortere kreftceller fra røde blodlegemer, og bestemme endringer i de dielektriske egenskaper av en progressiv MOSE cellelinje, og for å belyse virkningene av ikke- giftige sphingolipid behandlinger på rygging aggressive karakteristikkene av aggressive Mose celler. I tillegg kan cDEP Microdevices være konstruert for å operere på økt gjennomstrømning, for tiden opp til en ml / tr. 31,35

Som beskrevet, fleksibilitet og lave kostnader for fabrikasjonsprosessen muliggjør skreddersydde enhets geometrier, som tillater frem eksperimentell prosedyre for å være relevant for et bredt spekter av anvendelser. Det langsiktige målet med cDEP er å realisere label-fri celle sortering og berikelse på et klinisk nivå, med sample gjenoppretting for etterfølgende kultur eller foredling. Teknikken som presenteres her er en enkel og billig metode, fra fabrikasjon til eksperimentering, noe som øker tilgjengeligheten av DEP. Vi viser fremstilling av en cDEP chip og den eksperimentelle protokollen for å oppnå karakterisering og berikelse av eggstokkreft celler fra fluorescerende sfærer.

Protocol

En. Fabrikere en Prototype cDEP Microfluidic Device: Oversikt

  1. Følg tidligere rapporterte prosedyrer 22 ved hjelp av fotoresist og dypreaktiv ioneetse (DRIE) for å etse den ønskede kanal (fig. 1) inn i en silisiumskive (figur 2). Avsette et tynt lag av Teflon for å øke frigjøring av microdevice fra wafer.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk fremstilling av en lav frekvens kontinuerlig sorteringsenhet. Eksempel kanal løper fra venstre mot høyre og er 500 mikrometer brede med sagtann innsnevringer til 100 mikrometer. De to par av fluidtekniske kanaler elektrode komponere kilde-og sink elektroder, henholdsvis, og er adskilt fra prøvekanal av en 20 mikrometer tykk PDMS barriere.

Fig. 2
Figur 2. Den fabrication prosessen med en cDEP enhet. (a) 60 sek, UV-lys selektivt reagerer med fotoresist eksponeres gjennom en maske mønster av enhetsgeometri den cDEP. (b) fotoresist fjernes ved hjelp av utvikleren. (c) dypreaktiv ioneetse (DRIE) benyttes for å etse 50 mikrometer dype trekk, og 5 min for våt etsing av tetrametylammoniumhydroksyd (TMAH) 25% ved 70 ° C brukes for å redusere ruheten på sideveggene. (d) En Teflon-belegg blir tilsatt for å forbedre frigjøringsanordning fra skiven. (e) PDMS helles på den gjenbrukbare skive stempel etter avgassing og herdet i 45 min ved 100 ° C. (f) PDMS er fjernet fra skiven. PDMS og et rent objektglass utsettes for luft plasma i 2 min, og bundet sammen.

  1. Pakk wafer med aluminiumsfolie for å hindre spill-over. Bland polydimetylsiloksan (PDMS) i forholdet 10:1 av elastomer for å herder, de-gass i omtrent 20 min, Og hell på wafer. Varme i 45 minutter ved 100 ° C for å unngå skade på Teflon-belegg på stempelet. La enheten avkjøles.
  2. Etter avkjøling, fjernes aluminiumfolien, trim PDMS ved hjelp av en kirurgisk kniv, og punch tilgangshull i kanal innløpet / utløpet ved hjelp av en stump puncher passer til størrelsen av røret. Her er en 1,5 mm sløv puncher brukt.
  3. Rens en glassobjektglass ved hjelp av en skylling med såpe og vann, etanol, DI vann, og tørking med luft, hhv. Rengjør PDMS enheten ved hjelp av Scotch Magisk tape. Undersøke henhold mikroskop for å være sikker på at kanalene er rene. Expose raset og PDMS enhet til luft plasma for 2 min. Trykk fast kanal ved siden av enheten til objektglass, unngå dannelse av luftbobler mellom enheten og lysbildet (figur 3).

Figur 3
Figur 3. (a) Masken som brukes for fotolitografi i silisiumskivestempel fabrikasjon, og (b) den ferdige PDMS-glassenhet med prøven og fluidelektrode kanaler fylt med grønne og røde konditorfarge, henholdsvis. Se figur 1 for dimensjoner. Klikk her for å se større figur .

2. Forbereder en cellesuspensjon i DEP Buffer

  1. Tilbered en lav konduktivitet (100 mS / cm) buffer, som vil bli referert til som "DEP buffer" (8,5% sakkarose [w / v], 0,3% glukose [w / v], 0,725% RPMI [w / v]) . 16
  2. Suspender celler i DEP-buffer ved 3 x 10 til 6 celler / ml. Her er kreft sent stadium mus eggstokk overflaten epitel (MOSE-L) celler brukes.

Merk: Cell levedyktighet analyse av trypan blått fargestoff utelukkelse metoden viste en svak nedgang i levedyktighet(95,1 til 91,6%) av tidlig stadium MOSE (MOSE-E)-celler suspendert i DEP-buffer ved romtemperatur etter 5 timer. Det er spådd at en tilsvarende svak nedgang i levedyktighet oppstår for MOSE-L-celler, noe som indikerer at cellene ikke skal oppbevares i DEP buffer langsiktig.

  1. Farg-celler ved bruk av en fluorescerende membran-gjennomtrengelige fargestoff, slik som enzymatisk aktivert Calcein AM.
  2. Måle ledeevnen til cellesuspensjonen farget. Ledningsevnen bør være ca 100 mS / cm. Dersom konduktivitet er for høy, spinne prøven ned, resuspender i DEP-buffer ved 3 x 10 6 celler / ml og gjenta ledningsevne-måling.

Tre. Legge i cDEP Microfluidic Chip

  1. Plasser microfluidic chip under vakuum i 30 min.
  2. Samtidig skjære et stykke av fleksibelt rør for å spenne over avstanden fra sprøytepumpen til objektbord hvor microfluidic brikken skal plasseres. Her, en 6 tommers rørlengdeer nødvendig. Fit slangen til nålespissen på sprøyte.
  3. Beregn den nødvendige lengde for utløpsrøret ved å dividere target oppsamlet prøvevolum av tverrsnittsarealet av røret. Skjær krever slangelengde.
  4. Tegn cellesuspensjonen i sprøyten. Kontroller at ingen bobler er plassert i produksjonsrøret eller i sprøyten.
  5. Ved å fjerne brikken fra vakuum, setter utløpsslangen og prime prøven kanal raskt for å unngå luftbobler i kanalene. Slå forsiktig på sprøyten når grunning for å unngå sprekker den tynne (20 mikrometer) isolerende barriere, selv om det har blitt observert at barrieren kan tåle en konstant høy gjennomstrømning nær 5 ml / t uten sprekker.
  6. Å prime elektrode kanaler, raskt plassere tomme pipetter i ett uttak i hver fluidic elektrode kanal. Pipetter 200 ul PBS inneholdende en liten mengde av rodamin B banke forsiktig for å innføre fluidet inn i den motsatte enden av elektrodekanalen. Oppretthold milde pressinntil PBS med rhodamine B synlig skrider opp tuppen av den tomme pipettespissen. Gjenta for hver elektrode kanal. Rhodamine B brukes kun til fluorescently visual fluidumsforbindelsene elektrode kanaler.
  7. Etter grunning, fyller hver Pipettespissen reservoar med PBS med rhodamine B. Unngå bobledannelse i pipettespissen reservoarene, og fjerne eventuelle synlige boble ved pipettering forsiktig opp og ned. Løsne utløpsrøret og kast riktig, deretter sette inn en frisk utløp tubing reservoaret for å samle målvolumet.

4. Karakteriserer Crossover Frekvens av celler ved hjelp av cDEP Chip

  1. Plasser chip på scenen av en invertert mikroskop utstyrt med digitale kamera (figur 4).

Figur 4
Figur 4. (a) Samlet eksperimentelle oppsettet for cDEP eksperimenter. Den cDEP brikken er plassert på plattformen til det inverterte mikroskop. Et kamera sender bilder til datamaskinen for opptak. Sprøytepumpen opprettholder en konstant innløpsstrømmen. Den funksjonsgenerator genererer et signal som er trappet opp ved høyspennings-forsterker, og som er koblet til cDEP chip ved trådelektroder. Oscilloskop overvåker signalet sendes til brikken. (B) Detalj visning av cDEP chip og fluidumsforbindelser og elektroniske tilkoblinger. Klikk her for å se større figur .

  1. Monter sprøyte på sprøytepumpen og sett trådelektroder i fluidic elektrode kanal reservoarer.
  2. Pumpe fluid gjennom ved 1 ml / time for å sikre god kontakt mellom sprøytepumpe og sprøyten. En visuell inspeksjon av kanallengden for å sikre uhindret strømning av celler og fravær av bobler eller lekkasjer. Reduce strømningshastighet på 0,005 ml / time.
    Merk: Gjennomstrømning så høyt som en ml / t 31,35 er oppnådd i enheter av andre geometrier.
  3. For sikkerhets skyld teste elektronikken ved å slå på funksjonen generator, høyspent forsterker, og oscilloskop, og justere til ønsket spenning og frekvens. Her disse parametrene er 200 V og 20 kHz. Ved verifisering av akseptabel ytelse, strømmen. Koble elektrodene til høy spenningsforsterker.
    Merk: Overhold passende elektrisk sikkerhetsprosedyrer ved bruk elektronikken på de høye spenninger som brukes for disse eksperimentene.
  4. Etter oppnåelse av en jevn strømning, gjelder den ønskede spenning ved den ønskede frekvens. I dette forsøk, er spenningen 200 V RMS ved frekvenser mellom 5-60 kHz.
  5. Rekordvideofiler av cellerespons med bildebehandlingsteknikker (trinn 5) for å kvantifisere cellefordeling i kanalen og å karakterdelefrekvensen. For å gjøre dette,opprettholde en konstant spenning og variere frekvensen systematisk. Ved begynnelsen og slutten av forsøket, så vel som tilfeldig mellom eksperimentelle kjøringer, registrerer kontrollcellefordeling, fordelingen av cellene uten å anvende noe elektrisk felt. Estimer mengden av tid som kreves for cellene til å strømme fra innløpet til det overvåkede sted (her, 5 min). Etter å ha satt en ny frekvens, vente så mye tid, og deretter begynne opptak (her, en 2 min video av cellefordeling).

5. Bildebehandling for å karakter Crossover Frequency

  1. Ved hjelp av en beregnings script, analysere hver video-bilde for bilde for å bestemme den relative Y-posisjonen (hvor z-retningen er den vertikale dybde av kanalen, er y-retningen kanalbredden, og x-retningen er kanalens lengde) av hver fluorescerende celle-eller partikkel ved en bestemt x-koordinaten nedstrøms fra den regionen med høy DEP kraft i kanalen. Lag en graf av de relative disbidrag.
  2. Sammenlign senterlinjen av fordelingen ved hver spenning og frekvens med senterlinjen til styrefordeling. For en gitt spenning og varierende frekvenser, bestemme overgangsfrekvensen, hvor sentersamsvarer med y-posisjonen av kontroll.

6. Varierende eksperiment for å utføre Cell Sorting eller Enrichment

  1. Suspender ønsket blanding i DEP-buffer ved en total konsentrasjon på 3 x 10 til 6 partikler / ml. Her er denne blandingen MOSE-L celler med fire mikrometer fluorescerende perler i DEP buffer. Utfør tidligere beskrevet skritt for å forberede en cDEP enhet.
  2. For å sortere eller berike cellene fra en blanding, bestemme krysnings frekvenser av målcellene og bakgrunns partikler som tidligere er beskrevet. Betjen eksperimentet ved en frekvens mellom de to crossover frekvenser av målcellene og bakgrunnen partiklene slik at de to populasjoner av partikler opplever DEP krefter i motsatte directions. For å sortere MOSE-L celler og 4 mikrometer perler, betjene microdevice over 11,90 ± 0,63 kHz. den første overgangsfrekvensen på MOSE-L-celler har nylig rapportert av Salmanzadeh et al. 33.
  3. For å hente innholdet i en sortert prøven, fjerne utløpsrøret ved å samle målevolumet, ved å plassere en hanske finger over utløpsåpningen og forsiktig trekke på slangen. Hell den oppsamlede mål volum inn i et reservoar for videre analyse. Merk: Annen eksempelutvinningsmetoder kan omfatte å feste et fast reservoar til brikken, og fjerning av prøven ved enkel pipettering.

Representative Results

DEP bør observeres kvalitativt i prøvekanal for å bekrefte at enheten er i drift når det elektriske feltet er til stede. En metode for å teste for tilstedeværelse av DEP er å justere frekvensen til verdier langt fra delefrekvensen hvor sterk pDEP og NDEP er spådd (grovt> 40 kHz å observere pDEP og <10 kHz å observere NDEP for de fleste pattedyr kreftceller i en buffer med ledningsevne på 100 mS / cm). Det bør bemerkes at inerte sfærer vise pDEP under sin crossover frekvens og NDEP ovenfor sin delefrekvens. For den sagt funksjonen geometri presenteres her, bør pDEP sees for celler på høyere testfrekvens, indikert ved forekomsten av perle kjeding og fokusering av celler eller partikler på sagt funksjonen kanten av kanalen, mens på lavere testfrekvens, NDEP bør være åpenbar som celler er begrenset til området nærmere den rette kanten av kanalen. Ved disse lave frekvenser, kan cellene LYSe på grunn av elektroporering, slik at prøven kan vises å inneholde færre celler, og de som er synlige kan vises forstørret eller uklare hvis ved hjelp av en enzymatisk-aktiverte fluorescerende fargestoff. Verifisering av de frekvenser som pDEP og NDEP oppstår tillater bestemmelse av overgangsfrekvensen, som beskrevet i protokollen. For pattedyrkreftceller, for eksempel MOSE-L brukes her, observerte vi NDEP på 5 kHz (figur 5a) og sterk pDEP ved 60 kHz (figur 5b). MOSE-L-cellene hadde en diameter på 17,7 ± 3,3 mikrometer (n = 268 celler), og perlene har en 4 mikrometer nominell diameter. En fullstendig analyse av de dielektriske egenskaper til MOSE-L-celler sammenlignet med Mose-celler i tidlige stadier av utviklingen kan bli funnet i det siste arbeid ved Salmanzadeh et al. 33.

Hvis pDEP og NDEP ikke er observert på disse ytterpunktene, kan ulike problemer ha oppstått. Prøven ledningsevne kan være for høy på grunn av forurensninger eller cellelysering. IKKE NOKnt elektrisk felt kan frembringes på grunn av bobler fanget i væskeelektrodekanaler, som hindrer ledning av strøm til den del av kanalene som grenser til prøvekanalen. Ujevn strømning kan være forårsaket av en boble fanget i sprøyte-eller innløpsrøret, bobler som resulterer fra ikke å holde anordningen under vakuum i en tilstrekkelig tid eller ikke hurtig fylling av anordningen etter fjerning fra vakuum, lekkasje på grunn av delaminering av dårlig limt til PDMS glass lysbilde, tårer i barrieren membranen på grunn av overdreven makt utøves når du fyller kanalene, eller strømningshastigheter på ytterpunktene av pumpedriftsområdet.

I tillegg til å bestemme overgangsfrekvensen på cellene, kan denne teknikken bli brukt for å sortere en blanding, her illustrert ved en blanding av MOSE-L-celler og perler. Dette eksemplet utnyttet negative dielectrophoresis (NDEP) utstilt ved fire mikrometer perler på frekvenser der MOSE-L celler opplever positive dielectrophoresis (pDEP). Vi operated enheten ved 200 V RMS og 10 kHz (figur 6a) og observerte at både celler og perler ble blandet som de opplevde NDEP. Ved 50 kHz observerte vi bevegelse av MOSE-L-celler til toppen av kanalen, mens perlene ble begrenset til den nedre del av kanalen, slik at separasjon av blandingen i to komponenter (figur 6b).

Figur 5
Figur 5. Posisjonen til MOSE-L-celler manipuleres ved å endre frekvensen av det påtrykte elektriske felt. Bildene blir tatt ved den endelige sagt funksjon i prøvekanalen og fluidic elektrodene er plassert i hjørnene på den høyre siden. De er fylt med PBS inneholdende rhodamin B, som fluorescerer til å visual kanalene. (A) MOSE-L-celler oppleve NDEP på 200 V RMS og 5 kHz. (b) MOSE-L celler opplever perle kjeding og pDEP på 200 V RMS og 60 kHz. Klikk her for å se større figur .

Figur 6
Figur 6. En blanding av MOSE-L-celler (grønn) og 4 mikrometer perler (røde) strømme gjennom den endelige sagt funksjon i prøvekanalen til en lav frekvens cDEP enhet. (A) ved 200 V og 10 kHz celler og perler blandes. Pilene peker svakt vises celler som trolig har dødd på grunn av de lave frekvensforhold. (B) Ved 200 V og 50 kHz celler oppleve pDEP og flytte til funksjonen kanten av kanalen, mens perler oppleve NDEP og forblir begrenset til regionen nærmere den rette kanten.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Discussion

DEP er en kraftfull teknikk for bestemmelse av dielektriske egenskaper til partiklene, og å styre partikkelbevegelse mot sortering, isolasjon, eller berikelse anvendelser. På grunn av den skadelige effekten av direkte berøring med elektroden et eksempel, andre har tatt metoder som ligner på den tidligere presenterte fremgangsmåte for å unngå kontakt. For eksempel, Bashir et al. Utviklet kontaktfrie DEP enheter ved hjelp av en mikrofluid PDMS enhet atskilt fra kretskort elektroder av en tynn glass dekkglass, og denne teknikken er også gjort tilgjengelig i videoformat. 23,36

Her har vi vist fremstillingen av en cDEP chip og fluidic elektroder ved hjelp av en enkelt PDMS-substrat, og den eksperimentelle protokoll for separering av eggstokkreft celler fra en blanding av celler og fluorescent-perler. Den presenterte teknikken har blitt brukt til en rekke mer komplekse og fysiologisk relevante programmer, inkludert sortering live og døde celler, 28 tumor initiere celler fra prostatakreftceller, 30 kreftceller fra fortynnede røde blodceller, 31,32 og skille mellom faser av brystkreft 37 og eggstokk-kreft. 29. cDEP har også blitt benyttet for å blande partikler. 38. Disse applikasjoner tyder på at ved hjelp av enkel teknikk presentert, kan diverse formål oppnås ganske enkelt ved å endre utformingen av kanalgeometri.

. DEP er nyttig på mikroskala for manipulering av partikler 13 For sfæriske partikler, det translasjonelle dielectrophoretic kraften avhenger av størrelsen og elektriske egenskaper for partikkelen og den suspenderende medium, samt en gradient av det elektriske felt kvadrert:

Ligning 1
hvor ε m er permittiviteten av de suspenderende medium, r er radiustil partikkelen, og Rc [k (ω)] er den reelle delen av Clausius-Mossotti (CM)-faktor. CM faktoren er et mål på den relative polarizability av partikkelen i forhold til suspensjonsmediet, og bestemmer retningen av dielectrophoretic kraft. Det er beskrevet som

Ligning 2
der Ligning 3 og Ligning 4 er de komplekse permittivities av partikkelen og medium, respektivt. Komplekset permittiviteten, Ligning 5 , Avhenger av ledningsevne (σ) og frekvens (ω). Den CM faktor av sfæriske partikler er teoretisk bundet mellom -0,5 og en. Dersom CM faktor er negativ, at partiklene får NDEP fordi mediet er mer polariserbar enn partikkelen, slik at partiklene beveger seg bort fra regionerhøye elektriske felt gradienter. Dersom CM faktoren er positiv, partiklene er mer polariserbar enn mediet og de opplever pDEP der de bevege seg mot områder med høye elektriske felt-gradient.

For biologiske partikler som er nonhomogeneous i struktur, slik som celler, kan Clausius-Mossotti faktoren bli bestemt fra en effektiv verdi for partikkel permittiviteten:

Ligning 6
der Ligning 7 og Ligning 8 er den komplekse permittiviteten av den effektive komplekse permittiviteten til det indre av cellen, slik som i cytoplasma, og plasma membran, henholdsvis. r er radius av cellen, og d er tykkelsen av plasmamembranen 26

Når DEP oppstår med partikler suspendert i enfluid, vil bevegelse av partikkel i forhold til fluidet generere et drag kraft på partikkelen. Denne trekkraften må tas i betraktning ved bestemmelse av den samlede kraft som virker på partikkelen. For de tilfeller av interesse her, viskøse krefter dominerer, og partiklene er antatt sfærisk, liten og beveger seg med forholdsvis lav hastighet, slik at Stokes 'lov drag gir en god tilnærming for drag force:

Ligning 9
hvor η er viskositeten til fluidet, er u p hastigheten av partikkelen, og f u er hastigheten av fluidet, som også kan være i bevegelse. Gitt dielectrophoretic kraft, kjent væske-og partikkelegenskaper, og en kjent strømningshastighet, kan balansen mellom trekkraften og den kraft dielectrophoretic løses for å anslå partikkelhastighet. Den skjærhastighet at cellene erfaring bør være under terskelen for når cell lysering kan forekomme.

Karakterisering av de elektriske egenskapene til partiklene er nødvendig for å forutsi og kontrollere hvordan de vil reagere i henhold DEP dem. I dette arbeidet har vi spesielt utnyttet lavfrekvente cDEP med MOSE-L celler til å demonstrere protokollen for å avgjøre første crossover frekvens av celler, og deretter viste kontinuerlig sortering av polystyren perler og MOSE-L celler basert på sine opposisjon DEP svar.

Endring av geometrien av cDEP enheten vil endre den romlige gradienter av det elektriske felt, slik at enheter for å være konstruert for høy-frekvens-eller lavfrekvent drift, og for høy selektivitet og effektivitet for sortering for en bestemt celletype. I tillegg kan store gjennomgangs enheter bli utviklet ved å fabrikere bredere kanaler, 30 kanaler i parallell, 30 eller ved flerlags fabrikasjon 35, hvor elektrode kanaler er vertikalt stablet over og under et forholdsvis dyptprøvekanalen. Tynne membraner danner barriere mellom lagene. Foreløpige tester med enheter fabrikkert i polymethylmethacrylate (PMMA) og polykarbonat (PC) tynne filmer har vist DEP respons av MOSE-L celler. Aktuelle tiltak er underveis for å avgrense multi-lags high-throughput enheter og å forbedre det perifere systemet mot en eventuell plug-and-play-plattform. Å utvide fra den grunnleggende eksperimentell teknikk presentert, kan programmene og spesifikasjoner på enheten være skreddersydd for å passe bestemte krav, som for eksempel sortering versus karakterisering, eller legge prøve reservoarer og en semi-automatisert system til enheten.

Disclosures

Dr. Rafael Davalos har en patentsøkt for kontaktløs dielectrophoresis.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes, er støttet delvis av National Science Foundation i henhold Grant No EFRI 0938047, og ved Virginia Tech Institutt for Kritisk Technology og Applied Science (ICTAS). Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til Dr. Eva Schmelz og Dr. Paul Roberts for deres type gave MOSE-L celler. Forfatterne erkjenner Angela Anderson for hennes assistanse med cellekulturer, Caitlan Swaffar for hennes hjelp med redigering av dette dokumentet og forbereder eksperimenter, og alle Bioelectromechanical Systems lab medlemmer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning, Midland, MI,USA Sylgard 184
Glass slides The Microscope Depot 76079 2x3 inch-ground edges
Microbore PTFE Tubing Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA EW-06417-31 Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll
Luer-slip plastic syringes National Scientific company S7510-1
Needle tip Howard Electronic instruments JG20-1.0 20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"
D(+)-Sucrose Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S3-500
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ AC410955000
RPMI-1640 Medium Quality Biological Inc. 112-025-101
Calcein AM, Molecular Probes Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA C3100MP excitation wavelength 488/emission wavelength 516
Rhodamine B, O Science Lab SLR1465-100G excitation wavelength 540/emission wavelength 625
Phosphate buffered saline (10X) Gbiosciences, St. Louis, MO RC-147
Leica, inverted light microscope Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA Leica DMI 6000B
Leica DFC420, color camera Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA Leica DFC420
Function generator GW Instek, Taipei, Taiwan GFG-3015
Wideband power amplifier Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA AL-50HF-A
HFHV Output Transformer AL-T50-V25/300-F100K-600K
High voltage amplifier Trek Model 2205
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz AgilentTechnologies U2701A
Expanded Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001/002 (115/230V) air plasma
Scotch Magic tape 3M any available width is sufficient
1.5 mm puncher Harris Uni-Core Z708836-25EA
.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
FluoSpheres Sulfate Microspheres Invitrogen F8858 4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)
AZ 9260 photoresist AZ Electronic Materials
AZ 400 K developer AZ Electronic Materials
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25% provided by Virginia Tech cleanroom
Teflon coating applied using DRIE machine
Silicon wafer University Wafer 452 100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP)
Deep Reactive Ion Etching (DRIE) Alcatrel AMS SDE 100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, M. Cell culture and upstream processing. , Taylor & Francis. (2007).
  2. Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. Rare Cell Capture in Microfluidic Devices. Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).
  3. Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112 (2013).
  4. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).
  5. Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. Multitarget magnetic activated cell sorter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).
  6. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).
  7. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).
  8. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).
  9. Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. Automated single-cell sorting system based on optical trapping. J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).
  10. Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond. Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).
  11. Pethig, R. Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, (2010).
  12. Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood. Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).
  13. Pohl, H. A. Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , Cambridge University Press. (1978).
  14. Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science. , Under-review (2012).
  15. Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis. J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).
  16. Flanagan, L. A., et al. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 26, 656-665 (2008).
  17. Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry. Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).
  18. Hoettges, K. F., et al. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).
  19. Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water. Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).
  20. Davalos, R. V., et al. Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators. Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).
  21. Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields. Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).
  22. Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation. Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).
  23. Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board. Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).
  24. Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures. Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).
  25. Hughes, M. P. AC electrokinetics: applications for nanotechnology. Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).
  26. Pethig, R. Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, 022811 (2010).
  27. Pethig, R. Ch. 4. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M. auro, Ozkan, M. ihrimah, Heller, M. ichael J. . 4, Springer. US. 103-126 (2007).
  28. Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP). Lab Chip. 10, 438-445 (2010).
  29. Salmanzadeh, A., et al. Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  30. Salmanzadeh, A., et al. Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature. Lab Chip. 12, 182-189 (2012).
  31. Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis. EMBC 2012., Annual International IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Aug 28-Sep 1, San Diego, , (2012).
  32. Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples. Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).
  33. Salmanzadeh, A., et al. Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells. Biomicrofluidics. , (2013).
  34. Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2012 Annual International Conference of the IEEE, , 590-593 (2012).
  35. Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations. Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).
  36. Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar. J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).
  37. Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).
  38. Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).

Tags

Biomedical Engineering medisin cellebiologi molekylær biologi bioteknologi anatomi fysiologi biofysikk fysikk Microfluidics Cell Separation Microfluidic Analytiske teknikker elektroforese Microchip kreftdiagnose celle berikelse celle sortering MicroFluidics dielectrophoresis Lab på en chip celler avbildning
Label-fri Isolering og Anrikning av cellene gjennom Contact Dielectrophoresis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elvington, E. S., Salmanzadeh, A.,… More

Elvington, E. S., Salmanzadeh, A., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis. J. Vis. Exp. (79), e50634, doi:10.3791/50634 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter