Summary
Nøjagtig masse målinger udgør et vigtigt skridt i forbindelse med undersøgelsen af proteiner. Matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI) massespektrometri (MS) kan anvendes til en sådan bestemmelse og dens centrale fordel er tolerance over for salte, rengøringsmidler og forurenende stoffer. Her har vi illustrere en tilgængelig fremgangsmåde til analyse af proteiner større end 100 kDa ved hjælp af MALDI-MS.
Abstract
Effektivt bestemme masser af proteiner er afgørende for mange biologiske undersøgelser (f.eks for Strukturel Biologi undersøgelser). Nøjagtig masse bestemmelse gør det muligt at vurdere rigtigheden af protein primære sekvenser tilstedeværelsen af mutationer og / eller post-translationelle modifikationer, den mulige proteinnedbrydning, prøve homogenitet, og graden af isotop inkorporering i tilfælde af mærkning (f.eks 13C mærkning ).
Electrospray ionization (ESI) massespektrometri (MS) er almindeligt anvendt til massebestemmelse af denaturerede proteiner, men dets effektivitet er påvirket af sammensætningen af prøvebuffer. Især tilstedeværelsen af salte, rengøringsmidler og forurenende stoffer alvorligt underminerer effektiviteten af protein analyse af ESI-MS. Matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI) MS er et attraktivt alternativ på grund af dens salt tolerance og enkelhed erhvervelse og fortolkning af datation. Endvidere skal den masse beslutsomhed af store heterogene proteiner (større end 100 kDa) er lettere ved MALDI-MS på grund af fraværet af overlappende høj ladning statslige distributioner som er til stede i ESI spektre.
Her præsenterer vi en tilgængelig metode til at analysere proteiner større end 100 kDa ved MALDI-time søgning (TOF). Vi illustrerer fordelene ved anvendelse af en blanding af to matricer (dvs. 2,5-dihydroxybenzoesyre og α-cyano-4-hydroxykanelsyre) og nytten af det tynde lag fremgangsmåde som metode til prøve deposition. Vi diskuterer også den kritiske rolle af matricen og solvens renhed af de standarder, der anvendes til kalibrering af laseren energi og af købet tid. Samlet giver vi nødvendige oplysninger til en novice til analyse intakte proteiner større end 100 kDa ved MALDI-MS.
Introduction
Strukturel biologi bygger på produktion af proteiner af høj kvalitet 1 og skal derfor kobles med effektive og pålidelige teknikker til proteinanalyse 2,3. I vores massespektrometri (MS) laboratorium i et institut for strukturel biologi vi nødt til at bekræfte den primære sekvens af proteiner, evaluere forekomsten af mutationer og posttranslationelle modifikationer, nedbrydning af proteiner, prøve homogenitet, og kvaliteten af isotopisk mærkning (f.eks deutereret proteiner til nukleare magnetiske resonans undersøgelser 4). Da strukturelle biologer bruger begrænset proteolyse at skelne strukturelt stive domæner fra fleksible dele, vi skal pålideligt karakterisere sådanne trunkerede proteiner ved hjælp af MS.
Når biomolekyler analyseres ved MS, er to mulige tilgange udnyttes til blødt ioniserer sådanne tunge og labile molekyler. Electrospray ionization (ESI) ioniserer molekyler direkte fravæskefase 5, matrix-assisteret laser desorption ionisering (MALDI), at biomolekyler er co-krystalliseret med ultraviolet-absorberende organiske molekyler (dvs. matrixmolekyler) 6.
ESI time-of-flight (TOF) MS koblet til væskekromatografi er blevet en rutine teknik til analyse af intakte proteiner, fordi det giver massebestemmelse med høj nøjagtighed (≤ 50 ppm). Men det er ganske modtagelig for sammensætningen af prøvebuffer (især salte og detergenter) og forurenende stoffer (dvs. polymerer), der undertiden er vanskeligt at fjerne, der forårsager undertrykkelse af analytten signal.
MALDI-TOF MS udgør et effektivt alternativ til ESI-MS, fordi dens resultater er mindre påvirket af bufferkomponenter, rengøringsmidler og forurenende stoffer, og giver intakt protein masse beslutsomhed med tilstrækkelig nøjagtighed (≤ 500 ppm) for sekvens validering. Efter Protein fordøjelse, MALDI-TOF MS kan også anvendes til at analysere de opnåede peptider til yderligere bekræftelse primære sekvens af såkaldte "peptide mass fingerprinting".
I vores hænder, massebestemmelse af intakte proteiner, som er større end 100 kDa og heterogene (på grund af ændringer eller trunkeringer), er lettere ved MALDI-MS end ved hjælp af ESI-MS. Dette skyldes manglen på overlappende ladningstilstand distributioner stede i ESI spektre. Eftersom MALDI proces er ikke afhængig af analysanden størrelse 7 sådanne metode giver høj følsomhed, når et biomolekyle masse er over 100 kDa. Bemærkelsesværdig analyser af intakte proteiner blev udført ved hjælp af hjemmelavede instrumenter mellem slutningen af 1980'erne og begyndelsen af 1990'erne 8-11.
MALDI-TOF kan også anvendes som screeningsværktøj til at vurdere kvaliteten af protein prøver, fordi den kræver mindre tid til prøveforberedelse og er mindre modtagelige for FORSTYRRELces på grund af fælles urenheder (fx salte). Efter en første, hurtig evaluering af MALDI-MS, kan en prøve yderligere analyseres ved ESI-TOF at bestemme dens masse med højere nøjagtighed. Desuden MALDI genererer ioner, der indeholder færre afgifter end ESI og dermed erhverve og fortolke MALDI data mere ligetil. Dette giver eleverne arbejder i strukturel biologi til at analysere deres rekombinante proteiner lige efter en kort uddannelse.
To vigtige faktorer har indflydelse på kvaliteten af MALDI spektre: matricen og den anvendte teknik til matrixaflejring (f.eks tørret dråbe 8 og tyndt lag 12-16,17,18). En enkelt organisk matrix [f.eks sinapininsyre (SA) 19-21 eller α-cyano-4-hydroxykanelsyre (α-CHCA) 14,22,23] bruges ofte til MS undersøgelse af intakte proteiner og tværbundne protein-komplekser . Brug α-CHCA, Chait gruppe tidligere præsenteret en detaljeret protokol for preparing en ultra tyndt lag før MALDI analyse af opløselige og membranproteiner 14,15. For nylig Gorka et al. Illustreret grafit-baserede Målovertræksvægten at forbedre MALDI analyse af peptider og proteiner ved α-CHCA som matricen 24.
Her præsenterer vi en simpel protokol til analyse af intakte proteiner ved MALDI-TOF MS, udnytte en blanding af to matricer: 2,5-dihydroxybenzoesyre (DHB) og α-CHCA 25. Vi systematisk evalueret udførelsen af DHB-CHCA mix i forhold til SA og α-CHCA matricer, til kontrol af intakte proteiner. Matrixblandingen tillader en bedre opløsning (dvs. protein toppe er meget skarpere). Desuden er tilstedeværelsen af intense flere gebyrer ioner (dvs. M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, etc.) giver mulighed for en mere nøjagtig massebestemmelse fordi opløsningen aksiale MALDI-TOF instrumenter er højere ved lavere masse og ladning (m / z) 26. Dette er særligt nyttigt til bestemmelse af molekylvægt af proteiner er større end 100 kDa.
Højere følsomhed er også nået ved hjælp af DHB-CHCA blanding (0,5 pmol af protein spottet på MALDI mål).
Som vi har nævnt ovenfor, en vigtig faktor, der bør overvejes, når du bruger MALDI instrument er matrix deposition. Foreslået Laugesen et al. Anvendelsen af DHB-CHCA blandingen for første gang 25, udnytte den tørrede dråber deposition. Men vi observeret bedre resultater (f.eks meget højere følsomhed), når vi udnyttet det tynde lag metode, hvor det første lag er dannet af α-CHCA opløst i acetone. Det tynde lag metoden 12,27 indebærer dannelsen af en homogen undergrund af matrix-krystaller på MALDI mål, som blev beskrevet i en Jove video tidligere 15. Derefter prøven aflejres på dette substrat, og endeligyderligere matrix belægningen (se nedenfor). I denne artikel vil vi også illustrere, hvordan at deponere prøven på MALDI mål, men også hvordan man kan rense målet 15, at rekrystallisere og forberede matricer.
Til slut vi sigter mod at give alle de nødvendige oplysninger for at analysere intakte proteiner til forskere (især strukturelle biologer), der har brug for at evaluere kvaliteten af producerede proteiner i en hurtig og enkel måde, og der ikke er så fortrolige med MALDI-TOF MS. Som forudsagt i midten af 1990'erne 28 MS har haft en øget effekt på biologisk forskning, som dens tilgængelighed for biologer er steget. Vi håber, at de oplysninger, vi forudsat, vil være nyttigt at MALDI-TOF tilgængelig for biologer og forskere, der gerne vil begynde at bruge massespektrometri.
Protocol
1.. Protein Prøveforberedelse: Buffer Exchange (valgfri)
5-25 pi af mikromolære koncentrationer af protein (1 til 20 uM) er nødvendige. Buffer udveksling kan udføres ved hjælp af centrifugal ultrafiltreringsindretninger (f.eks Vivaspin, Sartorius) eller mikrocentrifuge gelfiltreringssøjler (f.eks Micro Bio-Spin 6 kromatografikolonner, Bio-Rad) 29,30. Buffer udveksle trin kan gentages 2-3x. Detaljeret beskrivelse af buffer udveksling blev tidligere præsenteret 29,30. For eksempel bruger vi 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan (dvs. Tris) pH 8 som endelig buffer.
Bemærk: Dette trin kan udelades i mange tilfælde. Det skal udføres, når et protein prøve indeholder molekyler eller buffere, der kunne stærkt interferere med MS detektion [f.eks glycerol, 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsyre, HEPES]. Det er også nyttigt at forbedre qucippet af spektrene.
2. Omkrystallisation af matricer for at forbedre deres renhed (valgfri)
- Hæld 10 ml 40% ethanol (EtOH) i en Pyrex-kolbe.
- Tilsættes 600 mg af en matrix.
- Anvendelse af et vandbad og en modstandsopvarmer opvarme matrix-opløsning og omrøres, indtil matrixen er fuldstændig opløst ved hjælp af en glasstang eller en magnetomrører.
- Gentag trin 2, indtil du har en mættet opløsning.
Bemærk: Ved hjælp af en for stor mængde af opløsningsmiddel eller opløse matrix langt under kogepunktet af opløsningen vil forårsage et dårligt udbytte krystaller eller ingen krystaller overhovedet.
- Lad opløsningen afkøle langsomt. Man kan lade det ved stuetemperatur i flere timer og derefter ved 4 ° C natten over. Bemærk: Hvis krystaller ikke er dannet, kan krystallisation induceres ved at skrabe indersiden af bægeret (lige under opløsningen overflade) ved anvendelse af en glasspatel.
- Saml matrix krystaller ved filtrering.
- Skyl krystallerne med et minimum af iskold opløsningsmiddel og filtrere dem.
- Lad krystallerne tørre. Du kan bruge vakuum til dette skridt.
3. Rensning af MALDI Stainless Steel Target
- Skyl MALDI plade med methanol (MeOH) og tør forsigtigt med en renseserviet specielt lavet til laboratoriebrug (f.eks Kimwipe).
- Skyl målet med H2O og tørres af med en renseserviet.
- Sæt MALDI plade i en 600 ml bægerglas og dække det med 50% EtOH.
- Sonikeres målet i EtOH opløsning i 10 minutter i et ultralydsbad.
- Hvis der er rester tilbage på pladen, skal du gentage trin 1-4 igen.
- Til sidst skylles målet med MeOH (eller med vand, se nedenstående bemærkning), vip det på en måde, at al væsken opsamles på en rengøring væv. Lad målet tørt ved stuetemperatur eller ved hjælp af en nitrogenholdiggasstrømmen.
Bemærk: En lignende procedure blev tidligere beskrevet 15.
Bemærk: opløsningsmiddel (MeOH eller vand), der anvendes til den sidste skylning af målet bestemmer visse mål funktioner. Hvis målet er skyllet med MeOH prøven spredes på målet langt mere end ved brug af vand.
4.. α-CHCA Thin Layer Løsning: Forberedelse og Deponering på MALDI Target
- Opløses α-CHCA i acetone for at gøre en mættet opløsning.
- Med hånden (uden nogen pipette) dyppe en 10 pi spids (f.eks GELoader Tip Eppendorf) i α-CHCA mættet opløsning: en lille mængde af opløsningen løber i spidsen (på grund af kapillarvirkning).
- Tryk meget hurtigt (dvs. 1 sek) MALDI mål med pipette spids og deponere α-CHCA acetone løsning på MALDI mål. Dette vil udgøre matrixen tyndt lag, hvor proteinetprøve vil blive deponeret. Forsøger at generere et tyndt lag stedet så lille som muligt.
Bemærk: Når du bruger SA som matrix, vi forbereder et tyndt lag ved hjælp af en mættet opløsning af SA i acetone.
5.. Udarbejdelse af Natrix Solutions: SA, α-CHCA, DHB og CHCA_DHB Blanding 25
- Der fremstilles en 20 mg / ml SA opløsning i ACN, 0,1% TFA (70:30, vol / vol).
- Forbered 20 mg / ml α-CHCA opløsning i ACN og 5% myresyre (70:30, vol / vol) [navngivet som "α-CHCA løsning"].
- Der fremstilles en 20 mg / ml DHB opløsning i ACN og 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) (70:30, vol / vol) [navngivet som "DHB opløsning"].
- Mix "α-CHCA løsning" og "DHB løsning" i forholdet 1:1 (vol / vol), for at opnå "CHCA_DHB løsning".
Bemærk: Man kan blande "α-CHCA løsning" og "DHB løsning" i forskellige forhold, når man analyserer proteiner med masse mindre end 100 kDa. For example et forhold på 40:60 mellem α-CHCA og DHB (vol / vol) giver en bedre opløsning, men mindre følsomhed (se diskussionen).
6.. Prøve Deposition på MALDI Target
- Depositum 0,5 gl af proteinet prøven på tidligere fremstillede α-CHCA tyndt lag. Umiddelbart efter, at Tilsæt 0,5 ul af matrix-opløsning (dvs. SA opløsning eller α-CHCA opløsning eller "CHCA_DHB mix"). Dette indebærer blanding af prøven og matrixen på målet.
Bemærk: Normalt en blander proteinprøven med matrixen i forholdet 1:1. Dette forhold er afgørende for den gode kvalitet af MALDI spektre. Hvis du gerne vil afprøve forskellige koncentrationer prøve, kan du bruge ACN_formic syreopløsning (beskrevet ovenfor) til at fortynde prøven.
Bemærk: Hvis du foretrækker det, kan du blande prøven og matrix i et rør, og derefter deponere blandet "sample_matrix løsningning "på det tynde lag.
Bemærk: Vi anbefaler dig at teste forskellige Prøvekoncentrationerne fordi fortynde prøven giver dig mulighed for at reducere interferens af forurenende stoffer. At fortynde prøven, kan du bruge ACN_formic syreopløsning (beskrevet ovenfor) til at fortynde prøven.
7.. Kalibrator Deposition
- Depositum 0,5 ul af kalibrant standard (fx "protein standard II" Bruker Daltonics, Bremen) tilsæt derefter 0,5 ul af matrix-løsning.
Bemærk: Læg kalibrant på MALDI plade ved siden proteinprøven pletter (se diskussionen).
8.. MALDI Spectra Erhvervelse af kalibrator og proteinprøver
Når prøverne og kalibrant tørres, kan du observere de "pletter" under et mikroskop. Denne observation er valgfri og hovedsagelig kan være interessant for nybegyndere. At erhverve prøven spektre, indsæt the mål i MALDI-TOF instrument og vælge de relevante instrumentale parametre, der er forskellige for hver type udstyr. For at få den mest hensigtsmæssige set-up man bør følge producentens anbefalinger. Som generelle betragtninger, når man analyserer intakte proteiner, bør man bruge instrumentet i linear mode (ikke i reflektor-mode, som er passende for peptider analyser). Normalt udnytter vi vores instrument i positiv-ion-mode. Desuden er en vigtig parameter er "pulserende ion udvinding", som forbedrer instrumentale resolution 31. I enkle vendinger, kan de "pulserende ion udvinding" defineres som en pause mellem frembringelsen af prøveionerne og det tidspunkt, hvor ioner accelereres mod detektoren. Ved analyse intakte proteiner, bør man udnyttet en "pulserende ion udvinding" (f.eks 500 nsec) større end når observere peptider (fx 80 nsek).
Vælg den relevante m / z rækkevidde erhverve spektre of kalibrant, og kalibrere instrumentet. Når du erhverve spektre af dine prøver, bruge de relevante laser intensitet (se diskussionen).
Representative Results
Vi har analyseret et intakt protein (kromosomområde vedligeholdelse 1-protein, CRM1, molekylvægt: 123.386 Da) under anvendelse af to forskellige matrixer, to deposition metoder, og den samme laser intensitet (figur 1). SA og en CHCA_DHB blanding blev anvendt som matricer. Blandingen gav masse spektre af højere kvalitet i form af signal-støj-forholdet og følsomhed (figur 1A og B). I særdeleshed kan vi afsløre 0,5 pmol af protein aflejret på MALDI mål (figur 1C). Den samme mængde protein var næppe påvises med SA (fig. 1D). Desuden bruger matricerne blandingen, den foretrukne metode til matrixaflejring var "tynde lag" metode (figur 1A). Brug af "tørret dråbe"-metoden, har vi ikke afsløre noget protein med en masse over 100 kDa (data ikke vist). Udnytte den CHCA_DHB blanding (figur 1A og 1C), formere ladede ion af Protein blev observeret, så massebestemmelse med større nøjagtighed, fordi den maksimale opløsning i aksiale MALDI-TOF instrumenter er omvendt proportional med m / z 26.
Vi analyserede også monomere beta-galactosidase (116.300 Da) (figur 2). De CHCA_DHB spektre var bedre end SA spektre i form af følsomhed og opløsning. Desuden er tilstedeværelsen af formere ladede ioner (M 2 +, M 3 + og M 4 +) tilladt os at bekræfte massen af proteinet med højere nøjagtighed (figur 2A og 2C). Ved hjælp af tyndt lag tilgang sammenlignede vi udførelsen af CHCA_DHB blandingen SA og α-CHCA alene til analyse af et immunoglobulin, IgG (148500 Da) (figur 3). Når vi korrelere de forskellige data, protein-signaler var højere, og med bedre opløsning i CHCA_DHB spektre. Konklusionen er, at brugen af CHCA_DHB blandingen og det tynde lag depositionsfremgangsmåde signifikante forbedringer i kvaliteten af store intakt protein massespektre erhvervet ved hjælp af en MALDI TOF instrument.
Figur 1. MALDI-TOF analyse af den intakte kromosomområde vedligeholdelse 1 protein (CRM1), molekylvægt: 123.386 Da. A) 1 pmol CRM1 blev analyseret ved hjælp af DHB_CHCA mix som matrix B) beløb:. 1 pmol, matrix:. SA C) beløb: 0,5 pmol, matrix:. DHB_CHCA D) beløb: 0,5 pmol, matrix: SA. Signalet af de toppe, udtrykt i en vilkårlig intensitet enhedsskala, normaliseres til den maksimale værdi til stede i hvert spektrum.
pg "src =" / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg "/>
Figur 2. MALDI-TOF analyse af intakt beta-galactosidase (116.300 Da). A) beløb: 20 pmol, matrix DHB_CHCA B) Beløb:. 20 pmol, matrix:. SA C) beløb: 5 pmol, matrix:. DHB_CHCA D) beløb: 5 pmol, matrix: SA.
Figur 3. MALDI-TOF analyse af en intakt immunoglobulin, IgG (148.500 Da) beløb:. 1,7 pmol Den opnåede spektre ved hjælp af CHCA_DHB blandingen var meget mere intens (maksimum: 8200 vilkårlig enhed, au) end SA spektre (maksimum: 1.200 au) og α-CHCA spektre (maksimum: 4500 au)
Discussion
Vi præsenterede en detaljeret protokol til at opnå høj kvalitet massespektre af store intakte proteiner med molekylvægte større end 100 kDa, under anvendelse af et MALDI-TOF-instrument. Et antal kritiske aspekter vedrørende forberedelse prøve bør nøje overvejes for at forbedre kvaliteten af den masse spektre. Matricer og opløsningsmidler med høj renhed er af afgørende betydning, fordi alle de forurenende stoffer i de matricer og opløsningsmidler er koncentreret om MALDI-målet efter solvent fordampning. For at øge renheden af MALDI matricer er det muligt at rense dem ved hjælp af klassiske omkrystallisation metoder (se ovenfor). Vi anbefaler også, at frisk forberede matricer løsninger (mindst en gang om ugen) for at afhjælpe den matrix krystallisering og for at undgå matrixnedbrydning.
Matricen deposition fremgangsmåde er meget kritisk for den endelige kvalitet af spektrene. Som beskrevet ovenfor er det tynde lag metode er vores metode of. valg 12. Desuden optimeres vi fremgangsmåde til afsætning af det første lag. Når matrixen er opløst i acetone til opnåelse af en mættet opløsning, den propanon muliggør hurtig afdampning af opløsningsmidlet, men gør størrelsen af det første lag er meget vanskeligt at kontrollere også. Vi foreslår at bruge en GELoader tip som lille pensel, som du dypper i matrix_acetone løsning for at få et minimum volumen, som du hurtigt deponere på målet. Størrelsen af det første lag på en måde styrer den endelige størrelse af MALDI stedet: en lille plet (dvs. 0,5-0,75 mm i diameter) er at foretrække, fordi i dette tilfælde koncentrationen af prøven er højere end i tilfælde af en stor plet. Erhvervelse af en lille plet adskiller sig fra den ultra-tynde lag tilgang tidligere foreslået i en JOVE video 15. I Fenyo et al. Det tynde lag løsningen er spredt over hele MALDI mål ved hjælp af den side af en pipettespids. Denne tilgang kræver afprøvning af tynde lag, som bør opfylde specifikke kriterier(Fx hastigheden af fordampning af opløsningsmidlet). Hvis kriteriet ikke er opfyldt, bør MALDI mål vaskes og et nyt tyndt lag skal være forberedt. Dette gør forberedelse ganske arbejdskrævende for en nybegynder. Desuden aflejring af prøven / matrix-blanding på pladen kræver aspiration af overskydende opløsningsmiddel ved hjælp af et vakuum linje og et vasketrin hjælp TFA 15 er nødvendig, hvilket gør Fenyo et al. Forberedelse lidt mere vanskeligt end vores tilgang.
Forholdet volumen mellem matricen og prøven er ganske vigtigt for en vellykket analyse af intakte proteiner ved MALDI-TOF. Efter at have testet forskellige forhold foreslår vi at anvende en 1:1. En anden matrix: stikprøveproportion kan kompromittere kvaliteten af spektre, sandsynligvis på grund af inhomogen krystallisering. Den rækkefølge, som matrix og prøve deponeres er også kritisk. Efter deponering matrixen tyndt lag prøven aflejres og umiddelbart efter (før Sample spot bliver tør) tilføjes CHCA_DHB blandingen. Denne procedure er blevet defineret som "sandwich-metoden" 27, hvor prøven alene er deponeret mellem to matrixlag. Som et alternativ kan CHCA_DHB opløsning, og prøven blandes i 0,5 ml rør og derefter spottet på CHCA tynde lag 12. Dette giver en plet med en homogen lag af krystaller resulterer i høj kvalitet spektre. Ved analyse proteiner med en lavere masse end 100 kDa, koncentrationen af DHB kan øges (fx 60:40 DHB: CHCA), og det kan producere skarpere top, men kan kompromittere målingen følsomhed (dvs. mindre intense toppe).
For en korrekt kalibrering af instrumenter, er det vigtigt at deponere Kalibratoren standarder meget tæt på prøven pletter, tillader en at opnå en bedre masse nøjagtighed. A "pseudo-intern kalibrering procedure" blev tidligere foreslået 15: efter erhvervelsen af en prøve spektret kalibrant plet is laser skud og signal af kalibrant føjes til prøvens spektrum. Dette giver dig mulighed internt kalibrere prøvens spektrum ved hjælp af kalibrator toppe.
Laseren energi omhyggeligt bør kontrolleres også under spektre købet. I de fleste tilfælde højere energi øger følsomheden, men sænker opløsningen. Vi foreslår at bruge den mindst mulige laser energi uden at gå på kompromis med følsomheden af erhvervelsen. Endvidere, for at forbedre spektral kvalitet, kan man erhverve flere skud på hver prøve stedet. Normalt flere skud du erhverve (1000-2000 skud), jo højere intensitet af signalet. Ved at ramme plet med laser, er man nødt til at finde den rigtige position (dvs. "sweet spot"), da prøven ikke er homogent fordelt. Du kan optage på det samme område, indtil signalet er stigende, og derefter forsøge at finde et andet område, der indeholder prøven.
Afslutningsvis høj renhed af matricer og solvforældre, de anvendte metoder til prøven og matricer aflejring på målet, position de anvendte standarder til kalibrering, intensiteten af laser energi, tidspunktet for erhvervelsen (antal skud / spot) er kritiske faktorer, som man bør tage hensyn til, når analyse intakte proteiner ved MALDI-TOF MS.
Forfatter Bidrag
LS og EBE designet eksperimenter, udført de massespektrometri eksperimenter, analyserede data, og skrev manuskriptet.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Christophe Masselon (iRTV, CEA, Grenoble), og medlemmer af virusinfektion og Cancer Gruppe på IBS, for deres kritiske evaluering af manuskriptet og for nyttige drøftelser. Vi er taknemmelige for Cyril Dian for den slags gave af proteinet CRM1. Denne videnskabelige arbejde fandt sted i massespektrometri anlægget af Grenoble Instruct Center (ISBG, UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Det blev støttet af den franske infrastruktur for Integrated Strukturel Biologi Initiative (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02), GRAL (ANR-10.-LabX-49-01) [i Grenoble partnerskab for Strukturel Biologi] og ved det franske Nationale Center for Videnskabelig Forskning (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Trizima | Sigma | T6066 | |
| Micro Bio-Spin 6 chromatography columns | Bio-Rad | 732-6221 | |
| Vivaspin 500 | Sartorius | VS0122 | various molecular weight cut off |
| Methanol | Fluka | 14262 | |
| Ethanol | Fluka | 02860 | |
| KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark | 05511 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Fluka | 39319 | |
| GELoader Tips | Eppendorf | 0030 001.222 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Formic acid | Fluka | 09676 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Protein Standard II | Bruker Daltonics | 207234 | It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine |
| Immunoglobulin G | ABSciex | GEN602151 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Water purifier PURELAB Ultra Analytic | ELGA LabWater | 89204-052 | |
| Autoflex MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
References
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , Garland Science - Taylor & Francis Group. (2010).
- Cohen, S. L., Chait, B. T. Mass spectrometry as a tool for protein crystallography. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).
- Chait, B. T. Mass spectrometry--a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist. Structure. 2, 465-467 (1994).
- Gans, P., et al. Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).
- Wilm, M. Principles of electrospray ionization. Molecular & cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407 (2011).
- Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets. Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).
- De Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , Wiley. (2007).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
- Spengler, B., Cotter, R. J. Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis. Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).
- Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins. Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).
- Xiang, F., Beavis, R. C. A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins. Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Fenyo, D., et al. MALDI sample preparation: the ultra thin layer method. J. Vis. Exp.. (3), e192 (2007).
- Gabant, G., Cadene, M. Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features. Methods. 46, 54-61 (2008).
- Hook, P., et al. Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).
- Vorm, O., Roepstorff, P. Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).
- Madler, S., Boeri Erba,, E,, Zenobi, R. MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules. Topics in current chemistry. , (2012).
- Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes. The Analyst. 132, 199-207 (2007).
- Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry. Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).
- Liu, Z., Schey, K. L. Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).
- Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).
- Laugesen, S., Roepstorff, P. Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).
- Sparkman, D. O. Mass Spectrometry Desk Reference. , Global View Publishing. (2000).
- Kussmann, M., Roepstorff, P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS. Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).
- Wang, R., Chait, B. T. High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins. Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).
- Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. J. Vis. Exp. (40), e1954 (2010).
- Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nature protocols. 2, 715-726 (2007).
- Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).
