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Chemistry

फ्लाइट के desorption लेजर / ionization समय बरकरार प्रोटीन की (MALDI-TOF) बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण मैट्रिक्स की मदद से बड़ा 100 केडीए

Published: September 9, 2013 doi: 10.3791/50635
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Structural Biology "J.P. Ebel", UMR5075, Commissariat à L'Energie Atomique et aux Energies Alternatives (CEA), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université J. Fourier

Summary

बड़े पैमाने पर माप प्रोटीन की जांच के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है. मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) ऐसे निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इसके प्रमुख लाभ लवण, डिटर्जेंट और contaminants के लिए सहनशीलता है. यहाँ हम MALDI एमएस द्वारा 100 केडीए से बड़ा प्रोटीन के विश्लेषण के लिए एक सुलभ दृष्टिकोण को दर्शाता है.

Abstract

प्रभावी रूप से प्रोटीन की जनता का निर्धारण (संरचनात्मक जीव विज्ञान की जांच के लिए जैसे) कई जैविक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. सटीक जन दृढ़ संकल्प एक प्रोटीन प्राथमिक दृश्यों की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है, परिवर्तन और / या बाद translational संशोधनों, संभव प्रोटीन गिरावट, नमूना एकरूपता, और लेबलिंग के मामले में आइसोटोप समावेश की डिग्री (जैसे 13 सी लेबलिंग की उपस्थिति ).

Electrospray आयनीकरण (ईएसआई) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) व्यापक रूप से विकृत प्रोटीन की जन निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन अपनी क्षमता का नमूना बफर की रचना से प्रभावित है. विशेष रूप से, लवण, डिटर्जेंट, और contaminants की उपस्थिति गंभीर रूप से ईएसआई एमएस द्वारा प्रोटीन विश्लेषण के प्रभाव को नजरअंदाज. मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) एमएस इसकी वजह से नमक सहिष्णुता और डाटा अधिग्रहण और interpreta की सादगी के लिए एक आकर्षक विकल्प हैtion. इसके अलावा, बड़ी विषम प्रोटीन (बड़ी से 100 केडीए) की बड़े पैमाने पर दृढ़ संकल्प के कारण ईएसआई स्पेक्ट्रा में मौजूद हैं जो उच्च आरोप राज्य वितरण ओवरलैपिंग के अभाव के MALDI एमएस द्वारा आसान है.

यहाँ हम उड़ान (TOF) की MALDI समय से 100 केडीए से बड़ा प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक सुलभ दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. हम दो matrices (यानी 2,5-dihydroxybenzoic एसिड और α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड) के मिश्रण और नमूना बयान के लिए दृष्टिकोण के रूप में पतली परत पद्धति की उपयोगिता का उपयोग कर लाभ दर्शाते हैं. हम भी लेजर ऊर्जा की जांच के लिए इस्तेमाल किया मानकों की मैट्रिक्स और विलायक पवित्रता की महत्वपूर्ण भूमिका पर चर्चा, और अधिग्रहण के समय की. कुल मिलाकर, हम MALDI एमएस द्वारा 100 केडीए से बड़ा बरकरार प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक नौसिखिया के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करते हैं.

Introduction

स्ट्रक्चरल बायोलॉजी उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन 1 के उत्पादन पर निर्भर करता है और इसलिए प्रोटीन विश्लेषण 2,3 के लिए कुशल और विश्वसनीय तकनीक के साथ युग्मित किया जाना चाहिए. संरचनात्मक जीव विज्ञान के एक संस्थान के भीतर हमारे मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) प्रयोगशाला में हम प्रोटीन की प्राथमिक अनुक्रम की पुष्टि करने की जरूरत है, परिवर्तन और posttranslational संशोधनों की उपस्थिति का मूल्यांकन, प्रोटीन की गिरावट, नमूना एकरूपता, और समस्थानिक लेबलिंग की गुणवत्ता (जैसे deuterated परमाणु चुंबकीय अनुनाद के अध्ययन के लिए प्रोटीन 4). संरचनात्मक जीव लचीला भागों से संरचनात्मक रूप से कठोर डोमेन भेद करने के लिए सीमित proteolysis उपयोग करते हैं, हम मज़बूती से एमएस का उपयोग ऐसे छोटा प्रोटीन चिह्नित करने के लिए की जरूरत है.

Biomolecules एमएस से विश्लेषण कर रहे हैं, तो दो संभावित दृष्टिकोण धीरे इस तरह के भारी और अस्थिर अणुओं ionise के लिए उपयोग किया जाता है. Electrospray आयनीकरण (ईएसआई) से सीधे अणुओं ionisesतरल चरण 5, मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर आयनीकरण (MALDI) biomolecules पराबैंगनी अवशोषित कार्बनिक अणुओं (यानी मैट्रिक्स अणु) 6 के साथ सह सघन रहे हैं कि आवश्यकता है.

यह (50 पीपीएम ≤) उच्च सटीकता के साथ बड़े पैमाने पर दृढ़ संकल्प की अनुमति देता है, क्योंकि ईएसआई समय की उड़ान (TOF) एमएस तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए युग्मित बरकरार प्रोटीन के विश्लेषण के लिए एक नियमित तकनीक बन गया है. हालांकि, यह (नमक और डिटर्जेंट के लिए विशेष रूप से) नमूना बफर की रचना करने के लिए और analyte संकेत के दमन के कारण, कभी कभी खत्म करने के लिए मुश्किल हो जाता है, जो contaminants (यानी पॉलिमर) के लिए काफी संभावना है.

MALDI-TOF एमएस इसके प्रदर्शन को कम बफर घटकों, डिटर्जेंट और contaminants से प्रभावित है क्योंकि ईएसआई एमएस करने के लिए एक कारगर विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, और अनुक्रम सत्यापन के लिए (500 पीपीएम ≤) पर्याप्त सटीकता के साथ बरकरार प्रोटीन जन दृढ़ संकल्प की अनुमति देता है. Protei के बादn पाचन, MALDI-TOF एमएस भी तथाकथित "पेप्टाइड जन फिंगरप्रिंटिंग 'से आगे प्राथमिक अनुक्रम पुष्टि करने के लिए प्राप्त पेप्टाइड्स का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

हमारे हाथ में, 100 केडीए से बड़ा और कारण (संशोधन या truncations के लिए) विषम हैं जो बरकरार प्रोटीन, की बड़े पैमाने पर दृढ़ संकल्प, ईएसआई एमएस द्वारा की तुलना में MALDI एमएस द्वारा आसान है. इस ईएसआई स्पेक्ट्रा में मौजूद ओवरलैपिंग आरोप राज्य के वितरण की कमी के कारण है. इसके अलावा, MALDI प्रक्रिया analyte आकार 7, ऐसी विधि पैदावार उच्च संवेदनशीलता के आश्रित नहीं है क्योंकि एक बायोमोलिक्यूल जन 100 केडीए ऊपर है. बरकरार प्रोटीन की उल्लेखनीय विश्लेषण 1980 के अंत और 1990 के 8-11 की शुरुआत के बीच घर में बने उपकरणों का उपयोग किया गया.

यह नमूना तैयार करने के लिए कम समय की आवश्यकता है और interferen के लिए कम संभावना है क्योंकि MALDI-TOF भी प्रोटीन के नमूने की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैआम दोष (जैसे लवण) के कारण CES. MALDI एमएस द्वारा एक पहले, त्वरित मूल्यांकन के बाद, एक नमूना आगे उच्च सटीकता के साथ अपने बड़े पैमाने पर निर्धारित करने के लिए ईएसआई-TOF से विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, MALDI ईएसआई की तुलना में कम शुल्क युक्त आयनों उत्पन्न करता है और इसलिए अधिक सरल MALDI डेटा है प्राप्त करने और व्याख्या. यह संरचनात्मक जीव विज्ञान में काम कर रहे छात्रों को सिर्फ एक संक्षिप्त प्रशिक्षण के बाद उनके पुनः संयोजक प्रोटीन का विश्लेषण करने की अनुमति देता है.

मैट्रिक्स और मैट्रिक्स बयान (जैसे सूखे छोटी बूंद 8 और पतली परत 12-16,17,18) के लिए तकनीक का इस्तेमाल: दो महत्वपूर्ण कारकों MALDI स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता प्रभावित करते हैं. एक एकल जैविक मैट्रिक्स [जैसे sinapinic एसिड (एसए) 19-21 या α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (α-CHCA) 14,22,23] अक्सर बरकरार प्रोटीन और पार से जुड़े प्रोटीन परिसरों की एमएस परीक्षा के लिए प्रयोग किया जाता है . Α-CHCA का प्रयोग, CHAIT समूह पहले से पी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुतपूर्व घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन 14,15 के MALDI विश्लेषण करने के लिए एक अति पतली परत reparing. हाल ही में, Gorka एट अल. मैट्रिक्स के रूप में 24 α-CHCA का उपयोग पेप्टाइड और प्रोटीन की MALDI विश्लेषण में सुधार करने के लिए ग्रेफाइट आधारित लक्ष्य कोटिंग सचित्र.

2,5-dihydroxybenzoic एसिड (DHB) और α-CHCA 25: यहाँ, हम दो matrices के एक मिश्रण का उपयोग, MALDI-TOF एमएस द्वारा बरकरार प्रोटीन के विश्लेषण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल उपस्थित थे. हम व्यवस्थित बरकरार प्रोटीन के नियंत्रण के लिए, एसए और α-CHCA matrices की तुलना DHB-CHCA मिश्रण के प्रदर्शन का मूल्यांकन किया. मैट्रिक्स मिश्रण एक बेहतर समाधान (प्रोटीन चोटियों बहुत तेज हैं आईई) की अनुमति देता है. इसके अलावा, तीव्र कई आरोपों आयनों की मौजूदगी (यानी एम 2 एच + 2, एम 3 एच 3 +, आदि) अक्षीय MALDI-TOF उपकरणों का संकल्प कार्यभार कम द्रव्यमान में अधिक है क्योंकि (एक अधिक सटीक जन दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता हैमी / z) 26. यह 100 केडीए से बड़ा प्रोटीन की आणविक वजन निर्धारण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.

उच्च संवेदनशीलता भी DHB-CHCA मिश्रण (MALDI लक्ष्य पर देखा प्रोटीन के 0.5 pmoles) का उपयोग कर पहुँच जाता है.

हम ऊपर उल्लेख किया है, MALDI साधन का उपयोग करते समय विचार किया जाना चाहिए कि एक महत्वपूर्ण कारक मैट्रिक्स बयान है. Laugesen एट अल. सूखे छोटी बूंद बयान का उपयोग, पहली बार 25 के लिए DHB-CHCA मिश्रण के उपयोग का प्रस्ताव रखा. हम पहली परत एसीटोन में भंग α-CHCA द्वारा बनाई है जहां पतली परत विधि का उपयोग करते हैं, तथापि, हम बेहतर परिणाम (जैसे बहुत अधिक संवेदनशीलता) मनाया. पतली परत विधि 12,27 पहले 15 एक जौव वीडियो में वर्णित किया गया था जो MALDI लक्ष्य, पर मैट्रिक्स क्रिस्टल का एक सजातीय बुनियाद के गठन का तात्पर्य. फिर, नमूना अंत में इस बुनियाद पर जमा है, औरअतिरिक्त मैट्रिक्स (नीचे देखें) जमा है. इस अनुच्छेद में, हम भी MALDI लक्ष्य पर नमूना जमा करने के लिए वर्णन कैसे, लेकिन यह भी लक्ष्य 15 साफ करने के लिए, recrystallize के लिए, और matrices तैयार करते हैं.

हम सब (विशेष रूप से, संरचनात्मक जीव) के वैज्ञानिकों को बरकरार प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक जानकारी एक तेजी से और सरल तरीके से उत्पादित प्रोटीन की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने की जरूरत है, जो है और जो उपलब्ध कराने के उद्देश्य समाप्त करने के लिए MALDI-TOF एमएस के साथ इतना परिचित नहीं हैं. 1990 के मध्य 28 में भविष्यवाणी की, एमएस जीव को अपनी पहुंच में वृद्धि हुई है, के रूप में जैविक अनुसंधान पर एक बढ़ा प्रभाव पड़ा है. हम दी गयी जानकारी मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग शुरू करना चाहते हैं जो जीव और वैज्ञानिकों के लिए MALDI-TOF सुलभ बनाने के लिए उपयोगी हो जाएगा उम्मीद है.

Protocol

1. प्रोटीन नमूना तैयारी: बफर एक्सचेंज (वैकल्पिक)

प्रोटीन (1-20 सुक्ष्ममापी) के micromolar सांद्रता के 5-25 μl जरूरी हैं. बफर विनिमय केन्द्रापसारक ultrafiltration उपकरणों (जैसे Vivaspin, Sartorius) या microcentrifuge जेल निस्पंदन कॉलम (जैसे, माइक्रो जैव स्पिन 6 क्रोमैटोग्राफी स्तंभ, जैव रेड) 29,30 का उपयोग किया जा सकता है. बफर विनिमय कदम 2-3X दोहराया जा सकता है. बफर एक्सचेंज का विस्तृत वर्णन पहले 29,30 पेश किया गया. उदाहरण के लिए, हम 20 मिमी Tris अंतिम बफर के रूप में (hydroxymethyl) aminomethane (यानी Tris) पीएच 8 का उपयोग.

नोट: यह चरण कई मामलों में छोड़ा जा सकता है. एक प्रोटीन के नमूने दृढ़ता से एमएस का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कि अणुओं या बफ़र्स होता है जब यह बाहर किया जाना चाहिए [जैसे ग्लिसरॉल, 4 - (2 hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic एसिड, HEPES]. यह qu में सुधार करने के लिए भी उपयोगी हैस्पेक्ट्रा की ality.

2. Matrices के recrystallization उनकी शुद्धता (वैकल्पिक) में सुधार के लिए

  1. एक Pyrex कुप्पी में 40% इथेनॉल (EtOH) के 10 मिलीलीटर डालो.
  2. एक मैट्रिक्स के 600 मिलीग्राम जोड़ें.
  3. एक पानी स्नान और एक प्रतिरोध हीटर का प्रयोग, मैट्रिक्स समाधान गर्म और मैट्रिक्स पूरी तरह से एक गिलास छड़ी या एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग भंग कर रहा है जब तक यह हलचल.
  4. आप एक संतृप्त समाधान है जब तक चरण 2 दोहराएँ.

नोट: विलायक की एक बहुत बड़ी मात्रा का उपयोग करना या दूर समाधान के उबलते बिंदु से नीचे मैट्रिक्स में सभी क्रिस्टल या कोई क्रिस्टल की एक गरीब उपज का कारण होगा भंग.

  1. समाधान धीरे शांत करने की अनुमति दें. अगर आप रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर तो कई घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें और कर सकते हैं. नोट: क्रिस्टल का गठन नहीं कर रहे हैं, क्रिस्टलीकरण एक गिलास सरगर्मी छड़ी का उपयोग कर (सिर्फ समाधान सतह के नीचे) बीकर के अंदर scratching द्वारा प्रेरित किया जा सकता है.
  2. निस्पंदन द्वारा मैट्रिक्स क्रिस्टल इकट्ठा.
  3. ठंडा विलायक की एक न्यूनतम राशि के साथ क्रिस्टल कुल्ला और उन्हें छानना.
  4. क्रिस्टल सूखे की अनुमति दें. आप इस कदम के लिए वैक्यूम का उपयोग कर सकते हैं.

3. MALDI स्टेनलेस स्टील लक्ष्य की सफाई

  1. मेथनॉल (MeOH) के साथ MALDI थाली कुल्ला और विशेष प्रयोगशाला अनुप्रयोगों (जैसे Kimwipe) के लिए बने एक सफाई ऊतक के साथ धीरे मिटा.
  2. एच 2 हे के साथ लक्ष्य कुल्ला और एक सफाई ऊतक से पोंछ.
  3. एक 600 मिलीलीटर बीकर में MALDI थाली डालें और 50% EtOH के साथ कवर.
  4. एक अल्ट्रासोनिक स्नान में 10 मिनट के लिए EtOH के समाधान में लक्ष्य Sonicate.
  5. थाली पर शेष अवशेष हैं, तो एक बार फिर 1-4 चरणों को दोहराएँ.
  6. अंत में, (, या पानी के साथ नीचे नोट देखें) MeOH साथ लक्ष्य कुल्ला, सभी तरल एक सफाई ऊतक पर एकत्र किया जाता है कि एक तरह से यह झुकाव. कमरे के तापमान या एक का उपयोग नाइट्रोजन में लक्ष्य दो शुष्कगैस प्रवाह.

नोट: एक समान प्रक्रिया पहले 15 में वर्णित किया गया.

नोट: लक्ष्य के अंतिम धोने के लिए इस्तेमाल किया विलायक (MeOH या पानी) कुछ लक्ष्य सुविधाओं को निर्धारित करता है. लक्ष्य MeOH साथ rinsed है, तो नमूना पानी का उपयोग करते समय ज्यादा से ज्यादा निशाने पर फैलता है.

4. α-CHCA पतली परत समाधान: MALDI लक्ष्य पर तैयार करना और बयान

  1. एक संतृप्त समाधान बनाने के क्रम में एसीटोन में α-CHCA भंग.
  2. हाथ से (किसी भी पिपेट बिना) α-CHCA संतृप्त समाधान में एक 10 μl टिप (जैसे GELoader टिप, Eppendorf) डुबकी: समाधान की एक छोटी राशि (कारण कैशिकता के लिए) टिप में बहेगा.
  3. पिपेट टिप के साथ बहुत तेजी से (यानी 1 सेकंड) MALDI लक्ष्य टच और MALDI लक्ष्य पर α-CHCA एसीटोन समाधान जमा. इस मैट्रिक्स पतली परत, जहां प्रोटीन का गठन होगानमूना जमा किया जाएगा. संभव के रूप में छोटे रूप में एक पतली परत मौके पैदा करने की कोशिश.

नोट: मैट्रिक्स के रूप में एसए का उपयोग करते हैं, तो हम एसीटोन में एसए का एक संतृप्त समाधान का उपयोग कर एक पतली परत तैयार करते हैं.

5. एसए, α-CHCA, DHB और CHCA_DHB मिश्रण 25: Natrix समाधान की तैयारी

  1. , ACN में 0.1% TFA (70:30, / खंड खंड) एक 20 मिलीग्राम / एमएल एसए समाधान तैयार करें.
  2. 20 ACN में मिलीग्राम / एमएल α-CHCA समाधान और 5% चींटी एसिड ["α-CHCA समाधान" के रूप में नाम] (70:30, / खंड खंड) तैयार करें.
  3. एक ACN में 20 मिलीग्राम / एमएल DHB समाधान और ["DHB समाधान" के रूप में नाम] 0.1% trifluoroacetic एसिड (TFA) (70:30, / खंड खंड) तैयार करें.
  4. "CHCA_DHB समाधान" प्राप्त करने के लिए, 1:1 अनुपात (/ खंड खंड) में "α-CHCA समाधान" और "DHB समाधान" मिलाएं.

नोट: जन कम से कम 100 केडीए साथ प्रोटीन का विश्लेषण करते समय एक, अलग अनुपात में "α-CHCA समाधान" और "DHB समाधान" मिश्रण कर सकते हैं. EXA के लिएmple α-CHCA और DHB (/ खंड खंड) के बीच 40:60 के अनुपात एक बेहतर समाधान है, लेकिन कम संवेदनशीलता (चर्चा देखें) अर्जित करता है.

6. MALDI लक्ष्य पर नमूना बयान

  1. पहले से तैयार α-CHCA पतली परत पर प्रोटीन के नमूने की जमा 0.5 μl. इसके तुरंत बाद, मैट्रिक्स समाधान (यानी एसए समाधान या α-CHCA समाधान या "CHCA_DHB मिश्रण") के 0.5 μl जोड़ें. इस लक्ष्य पर नमूना और मैट्रिक्स मिश्रण निकलता है.

नोट: आमतौर पर एक एक 1:1 अनुपात में मैट्रिक्स के साथ प्रोटीन नमूना घोला जा सकता है. इस अनुपात MALDI स्पेक्ट्रा की अच्छी गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है. आप अलग नमूना सांद्रता का परीक्षण करना चाहते हैं, तो आप नमूना कमजोर करने ACN_formic एसिड समाधान (ऊपर वर्णित) का उपयोग कर सकते हैं.

नोट: यदि आप चाहें, तो आप एक ट्यूब में नमूना और मैट्रिक्स मिश्रण है और फिर मिश्रित "sample_matrix समाधान जमा कर सकते हैंपतली परत पर tion ".

नोट: हम नमूना गिराए आप contaminants के हस्तक्षेप को कम करने के लिए अनुमति देता है क्योंकि आप अलग नमूना सांद्रता का परीक्षण करने के लिए सुझाव देते हैं. नमूना पतला करने के लिए, आप नमूना कमजोर करने ACN_formic एसिड समाधान (ऊपर वर्णित) का उपयोग कर सकते हैं.

7. Calibrant बयान

  1. जमा calibrant मानक के 0.5 μl (उदाहरण के लिए "प्रोटीन मानक द्वितीय", Bruker Daltonics, ब्रेमेन) तो मैट्रिक्स समाधान के 0.5 μl जोड़ें.

नोट: प्रोटीन नमूना स्थानों के लिए अगले MALDI प्लेट (चर्चा देखने के लिए) पर calibrant लोड करें.

8. Calibrant की MALDI स्पेक्ट्रा अधिग्रहण और प्रोटीन के नमूने

नमूने और calibrant सूख रहे हैं, आपको एक खुर्दबीन के नीचे "स्पॉट 'का पालन कर सकते हैं. इस अवलोकन वैकल्पिक है और novices के लिए मुख्य रूप से दिलचस्प हो सकता है. नमूना स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए, वें डालनेई MALDI-TOF साधन में लक्ष्य और उपकरण के प्रत्येक प्रकार के लिए अलग कर रहे हैं, जो उचित भूमिका निभाई मापदंडों का चयन करें. सबसे उपयुक्त सेट अप प्राप्त करने के लिए एक निर्माता की सिफारिशों का पालन करना चाहिए. बरकरार प्रोटीन का विश्लेषण करते समय सामान्य विचार के रूप में, एक (विश्लेषण करती पेप्टाइड्स के लिए उपयुक्त है जो नहीं परावर्तक मोड में,) रेखीय मोड में साधन का उपयोग करना चाहिए. आम तौर पर हम सकारात्मक आयन मोड में हमारे साधन का उपयोग. इसके अलावा, एक महत्वपूर्ण पैरामीटर वाद्य संकल्प 31 जो सुधार "स्पंदित आयन निकासी" है. सरल शब्दों में, "स्पंदित आयन निकासी" नमूना आयनों की पीढ़ी और आयनों डिटेक्टर की ओर तेजी से कर रहे हैं जब समय के बीच एक ठहराव के रूप में परिभाषित किया जा सकता है. बरकरार प्रोटीन का विश्लेषण, एक पेप्टाइड को देख जब से बड़ा एक "स्पंदित आयन निकासी" (उदाहरण के लिए 500 NSEC) का उपयोग किया है (जैसे 80 NSEC). चाहिए

उचित एम / जेड श्रेणी चुनें, स्पेक्ट्रा ओ अधिग्रहणच calibrant, और साधन जांचना. आप अपने नमूनों की स्पेक्ट्रा हासिल करते हैं, तो उचित लेजर तीव्रता (चर्चा देखने के लिए) का उपयोग करें.

Representative Results

दो अलग matrices, दो बयान तरीकों, और एक ही लेजर तीव्रता (चित्रा 1) का उपयोग:; हम एक अक्षुण्ण प्रोटीन (123,386 दा आणविक वजन क्रोमोजोम क्षेत्र रखरखाव 1 प्रोटीन, Crm1) का विश्लेषण किया. एसए और एक CHCA_DHB मिश्रण matrices के रूप में उपयोग किया गया. मिश्रण (आंकड़े 1 ए और बी) शोर अनुपात करने के लिए संकेत की और संवेदनशीलता के मामले में उच्च गुणवत्ता की जन स्पेक्ट्रा झुकेंगे. विशेष रूप से, हम MALDI लक्ष्य (चित्रा 1C) पर जमा प्रोटीन के 0.5 pmoles पता लगा सकता है. प्रोटीन का एक ही राशि एसए (चित्रा -1) का उपयोग कर मुश्किल से detectable था. इसके अलावा, matrices के मिश्रण का उपयोग, मैट्रिक्स बयान के लिए पसंद की विधि "पतली परत" दृष्टिकोण (चित्रा 1 ए) था. "सूखे छोटी बूंद" विधि का उपयोग करना, हम एक बड़े पैमाने पर अधिक से अधिक 100 केडीए (नहीं दिखाया डेटा) के साथ किसी भी प्रोटीन का पता नहीं चला. CHCA_DHB मिश्रण (आंकड़े 1 ए और 1 सी) का उपयोग, गुणा protei के आयन का आरोप लगायाn अक्षीय MALDI-TOF उपकरणों में शिखर संकल्प मी / z 26 के विपरीत आनुपातिक है क्योंकि उच्च सटीकता के साथ बड़े पैमाने पर दृढ़ संकल्प की अनुमति, मनाया गया.

हम भी मोनोमेरिक बीटा galactosidase (116,300 दा) (चित्रा 2) का विश्लेषण किया. CHCA_DHB स्पेक्ट्रा संवेदनशीलता और संकल्प के मामले में एसए स्पेक्ट्रा से बेहतर थे. इसके अलावा, गुणा आयनों का आरोप लगाया (एम 2, एम 3 + और ​​एम 4) की उपस्थिति हमें उच्च सटीकता के साथ प्रोटीन की बड़े पैमाने पर (आंकड़े 2A और 2C) की पुष्टि करने की अनुमति दी. पतली परत दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम एक immunoglobulin, आईजीजी का विश्लेषण (148,500 दा) (चित्रा 3) के लिए CHCA_DHB मिश्रण, एसए और अकेले α-CHCA के प्रदर्शन की तुलना में. हम अलग डेटा सहसंबंधी करते हैं, प्रोटीन संकेतों अधिक थे और CHCA_DHB स्पेक्ट्रा में बेहतर संकल्प के साथ. निष्कर्ष निकालना, CHCA_DHB मिश्रण और पतली परत बयान विधि का उपयोग एक MALDI TOF साधन का उपयोग कर हासिल बड़े बरकरार प्रोटीन जन स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता में महत्वपूर्ण सुधार का प्रदर्शन किया.

चित्रा 1
चित्रा 1. 123,386 दा: बरकरार क्रोमोजोम क्षेत्र रखरखाव 1 प्रोटीन, (Crm1), आणविक वजन के MALDI-TOF विश्लेषण. . Crm1 की ए) 1 pmole मैट्रिक्स बी) राशि के रूप में DHB_CHCA मिश्रण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था: 1 pmole, मैट्रिक्स:. एसए सी) राशि: 0.5 pmole, मैट्रिक्स:. DHB_CHCA डी) राशि: 0.5 pmole, मैट्रिक्स: एसए. चोटियों के संकेत, एक मनमाना तीव्रता इकाई पैमाने में व्यक्त, प्रत्येक स्पेक्ट्रम में अधिकतम मूल्य वर्तमान सामान्यीकृत है.

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चित्रा 2. बरकरार बीटा galactosidase (116,300 दा) की MALDI-TOF विश्लेषण. ए) राशि: 20 pmoles, मैट्रिक्स DHB_CHCA बी) राशि:. 20 pmoles, मैट्रिक्स:. एसए सी) राशि: 5 pmoles, मैट्रिक्स:. DHB_CHCA डी) राशि: 5 pmoles, मैट्रिक्स: एसए.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक अक्षुण्ण immunoglobulin, आईजीजी (148,500 दा) की MALDI-TOF विश्लेषण; राशि:. 1.7 pmoles स्पेक्ट्रा CHCA_DHB मिश्रण का उपयोग कर प्राप्त और अधिक तीव्र थे (अधिकतम: 8200 मनमाना इकाई, एयू) एसए स्पेक्ट्रा से (अधिकतम: 1,200 एयू) और α-CHCA स्पेक्ट्रा (अधिकतम: 4500 एयू)

Discussion

हम एक MALDI-TOF उपकरण का उपयोग कर, 100 केडीए से बड़ा आणविक भार के साथ बड़े बरकरार प्रोटीन की उच्च गुणवत्ता जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए एक विस्तार प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया. नमूना तैयार करने के विषय में महत्वपूर्ण पहलुओं की संख्या को ध्यान से जन स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता में सुधार के क्रम में विचार किया जाना चाहिए. Matrices और विलायकों में मौजूद सभी contaminants विलायक वाष्पीकरण के बाद MALDI लक्ष्य पर केंद्रित कर रहे हैं क्योंकि matrices और उच्च शुद्धता की विलायकों महत्वपूर्ण महत्व के हैं. MALDI matrices की शुद्धता बढ़ाने के लिए आदेश में यह (ऊपर देखें) शास्त्रीय recrystallization तरीकों का उपयोग कर उन्हें शुद्ध करने के लिए संभव है. हम भी हौसले मैट्रिक्स क्रिस्टलीकरण उन्नति और मैट्रिक्स गिरावट से बचने के लिए (कम से कम सप्ताह में एक बार) matrices के समाधान की तैयारी करने की सलाह देते हैं.

मैट्रिक्स बयान दृष्टिकोण स्पेक्ट्रा के अंतिम गुणवत्ता के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. ऊपर वर्णित है, पतली परत विधि हमारे विधि ओ हैएफ चुनाव 12. इसके अलावा, हम पहली परत जमा करने के लिए दृष्टिकोण अनुकूलित. मैट्रिक्स एक संतृप्त समाधान प्राप्त करने के लिए एसीटोन में भंग कर रहा है, जब propanone विलायक का तेजी से वाष्पीकरण की अनुमति देता है, लेकिन यह भी नियंत्रित करने के लिए पहली परत का आकार बहुत कठिन बना देता है. हम आपको जल्दी से लक्ष्य पर जमा जो एक न्यूनतम मात्रा प्राप्त करने के लिए matrix_acetone समाधान में डुबकी उस छोटे ब्रश के रूप में एक GELoader टिप का उपयोग कर सुझाव देते हैं. पहली परत के आकार के किसी भी तरह MALDI मौके के अंतिम आकार को नियंत्रित करता है: इस मामले में नमूना एकाग्रता एक बड़े मौके के मामले में की तुलना में अधिक है क्योंकि एक छोटी सी जगह (व्यास की यानी 0.5-0.75 मिमी) बेहतर है. एक छोटी सी जगह प्राप्त करने के पहले एक जौव वीडियो 15 में प्रस्तावित अल्ट्रा पतली परत दृष्टिकोण से अलग है. Fenyo बारे में एट अल. पतली परत समाधान सभी एक विंदुक टिप की ओर का उपयोग MALDI लक्ष्य में फैला हुआ है. यह दृष्टिकोण विशिष्ट मानदंडों को पूरा करना चाहिए, जो पतली परत परीक्षण की आवश्यकता(विलायक वाष्पीकरण की जैसे गति). कसौटी मिले नहीं है, MALDI लक्ष्य धोया जाना चाहिए और एक नया पतली परत तैयार किया जाना चाहिए. यह एक नौसिखिया के लिए तैयारी काफी श्रमसाध्य बनाता है. इसके अलावा, थाली पर नमूना / मैट्रिक्स मिश्रण के बयान Fenyo बारे एट अल. तैयारी हमारे दृष्टिकोण की तुलना में थोड़ा अधिक कठिन बना रही है, एक शून्य रेखा और TFA 15 का उपयोग करते हुए एक कपड़े धोने कदम का उपयोग अतिरिक्त विलायक की आकांक्षा आवश्यक है की आवश्यकता है.

मैट्रिक्स और नमूना के बीच मात्रा अनुपात MALDI-TOF द्वारा बरकरार प्रोटीन का एक सफल विश्लेषण के लिए काफी महत्वपूर्ण है. विभिन्न अनुपात के परीक्षण के बाद हम एक 1:1 के अनुपात का उपयोग करने के लिए सुझाव देते हैं. एक अलग मैट्रिक्स: नमूना अनुपात की वजह से शायद inhomogeneous क्रिस्टलीकरण के लिए, स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता में समझौता कर सकता है. मैट्रिक्स और नमूना जमा कर रहे हैं जिस क्रम में भी महत्वपूर्ण है. मैट्रिक्स पतली परत जमा करने के बाद, नमूना जमा किया जाता है और तुरंत samp से पहले (के बादLe स्पॉट) सूखी हो जाती है CHCA_DHB मिश्रण में जोड़ा जाता है. यह प्रक्रिया अकेले नमूना दो मैट्रिक्स परतों के बीच जमा है जहां "सैंडविच विधि" 27 के रूप में परिभाषित किया गया है. एक विकल्प के रूप में, CHCA_DHB समाधान और नमूना 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में मिलाया जा सकता है और फिर CHCA पतली परत 12 पर देखा. यह उच्च गुणवत्ता स्पेक्ट्रा में जिसके परिणामस्वरूप क्रिस्टल का एक समरूप परत के साथ एक स्थान अर्जित करता है. इस तेज पीक उत्पादन कर सकते हैं, लेकिन माप संवेदनशीलता (यानी कम तीव्र चोटियों) समझौता हो सकता है;: एक बड़े पैमाने पर कम से कम 100 केडीए, DHB की एकाग्रता के साथ प्रोटीन विश्लेषण (CHCA जैसे 60:40 DHB) बढ़ाया जा सकता है.

एक सही साधन अंशांकन के लिए यह एक बेहतर जन सटीकता प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, नमूना स्पॉट के बहुत करीब calibrant मानकों जमा करने के लिए आवश्यक है. एक "छद्म आंतरिक अंशांकन प्रक्रिया" पहले 15 सुझाव दिया गया था: एक नमूना स्पेक्ट्रम, calibrant स्पॉट मैं के अधिग्रहण के बादcalibrant की लेजर शॉट और संकेत नमूना स्पेक्ट्रम के लिए जोड़ रहे हैं. यह आपको करने के लिए आंतरिक रूप से calibrant चोटियों का उपयोग नमूना स्पेक्ट्रम जांचना अनुमति देता है.

लेजर ऊर्जा भी ध्यान से स्पेक्ट्रा अधिग्रहण के दौरान नियंत्रित किया जाना चाहिए. ज्यादातर मामलों में, उच्च ऊर्जा संवेदनशीलता बढ़ जाती है, लेकिन इस प्रस्ताव को कम करती है. हम अधिग्रहण की संवेदनशीलता समझौता किए बिना संभव न्यूनतम लेजर ऊर्जा का उपयोग कर सुझाव देते हैं. इसके अलावा, वर्णक्रमीय गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, एक प्रत्येक नमूने की मौके पर ही अधिक शॉट प्राप्त कर सकते हैं. आम तौर पर अधिक शॉट आप (1,000-2,000 शॉट्स) के अधिग्रहण, संकेत की तीव्रता अधिक है. लेजर के साथ हाजिर जब मार, एक नमूना homogenously वितरित किया जाता है के बाद से, सही स्थिति (यानी "मीठी हाजिर") खोजने की जरूरत है. आप संकेत बढ़ रही है जब तक एक ही क्षेत्र पर गोली मार, और तब नमूना युक्त एक और क्षेत्र खोजने की कोशिश कर सकते हैं.

Matrices और solv के समापन, उच्च शुद्धता मेंपिता, नमूना और लक्ष्य पर matrices के बयान के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, अंशांकन, लेजर ऊर्जा की तीव्रता, अधिग्रहण के समय (शॉट्स / स्पॉट की संख्या) के लिए इस्तेमाल किया मानकों की स्थिति जब एक ध्यान में रखना चाहिए कि महत्वपूर्ण कारक हैं MALDI-TOF एमएस द्वारा बरकरार प्रोटीन का विश्लेषण.

लेखक योगदान

लोकसभा और EBE, प्रयोगों बनाया गया मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों का प्रदर्शन, डेटा का विश्लेषण, और पांडुलिपि लिखा था.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए और उपयोगी विचार विमर्श के लिए, IBS पर डॉ. क्रिस्टोफ Masselon (iRTV, सीईए, ग्रेनोबल) और वायरल संक्रमण के सदस्यों और कैंसर समूह धन्यवाद. हम प्रोटीन Crm1 की तरह उपहार के लिए सिरिल भारतीय के लिए आभारी हैं. इस वैज्ञानिक काम ग्रेनोबल आज्ञा केंद्र (; UMS 3518 CNRS-सीईए UJF-EMBL ISBG) के मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा में जगह ले ली. यह आर्थिक रूप से एकीकृत स्ट्रक्चरल बायोलॉजी पहल (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02) के लिए फ्रेंच इंफ्रास्ट्रक्चर द्वारा समर्थित किया गया था, GRAL (ANR-10-LabX-49-01) [ग्रेनोबल भागीदारी के भीतर स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के लिए] और से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए फ्रांस के राष्ट्रीय केंद्र (CNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Trizma hydrochloride Sigma T3253
Trizima Sigma T6066
Micro Bio-Spin 6 chromatography columns Bio-Rad 732-6221
Vivaspin 500 Sartorius VS0122 various molecular weight cut off
Methanol Fluka 14262
Ethanol Fluka 02860
KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers Kimberly Clark 05511
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich C8982
Acetone Sigma Aldrich 650501
2,5-dihydroxybenzoic acid Fluka 39319
GELoader Tips Eppendorf 0030 001.222
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Formic acid Fluka 09676
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031
Protein Standard II Bruker Daltonics 207234 It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine
Immunoglobulin G ABSciex GEN602151
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Water purifier PURELAB Ultra Analytic ELGA LabWater 89204-052
Autoflex MALDI-TOF instrument Bruker Daltonics
MALDI-TOF target Bruker Daltonics

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References

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फ्लाइट के desorption लेजर / ionization समय बरकरार प्रोटीन की (MALDI-TOF) बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण मैट्रिक्स की मदद से बड़ा 100 केडीए
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Signor, L., Boeri Erba, E.… More

Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. (79), e50635, doi:10.3791/50635 (2013).

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