Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese und Sequenzierung des gesamten Genoms basiert durchzuführen. Außerdem wird ein System zum Austausch DNA in infizierten Zellen beschrieben, die für die genetische Kartierung verwendet werden. Diese Methode ist breit anwendbar zu mikrobiellen Systemen fehlt Transformation Systeme und molekulargenetische Werkzeuge.
Abstract
Chlamydia trachomatis, der Erreger von sexuell übertragbaren Krankheiten und Augeninfektionen bleibt schlecht aufgrund seiner Unnachgiebigkeit der experimentellen Transformation dadurch mit rekombinanten DNA. Wir entwickelten einen Ansatz zur genetischen Analyse in C durchführen trachomatis trotz der fehlenden molekulargenetischen Werkzeugen. Unsere Methode beinhaltet: i) chemische Mutagenese schnell generieren umfangreiche Bibliotheken von genetisch definierten Mutanten mit unterschiedlichen Phänotypen, ii) Whole-Genome Sequencing (WGS), um die zugrunde liegenden genetischen Läsionen abzubilden und Assoziationen zwischen mutierten Gens (s) zu finden und.. eine gemeinsame Phänotyp;. iii) Generierung von rekombinanten Stämmen durch Co-Infektion von Säugerzellen mit Mutante und Wildtyp Bakterien. Dementsprechend konnten wir kausalen Beziehungen zwischen Genotypen und Phänotypen zu etablieren. Die Kopplung von chemisch-induzierte Gen Variation und WGS zu etablieren Korrelat Genotyp-Phänotyp-Assoziationen Should im Großen und Ganzen für die große Liste von medizinisch und ökologisch wichtige Mikroorganismen derzeit unlösbar zu genetischen Analyse.
Introduction
Die obligat intrazelluläre Bakterium Chlamydia trachomatis Konten für schätzungsweise 2,8 Millionen Genitaltrakt Infektionen pro Jahr in den Vereinigten Staaten (Center for Disease Control) mit assoziierten Folgeerkrankungen wie Adnexitis, ektope Schwangerschaften und Unfruchtbarkeit (1). Chlamydia spp haben eine einzigartige Physiologie mit einem zweiphasigen Entwicklungszyklus bestehend aus zwei Formen: die ansteckende, aber nicht-replizierenden elementaren Körper (EB) und der infektiösen aber replikativen reticulate Körper (RB). Infektion beginnt mit der Befestigung der EBs Epithelzellen durch endoctyotosis (2). Innerhalb einer membrangebundenen Vakuole bezeichnet eine Aufnahme, EBS in die RB Form, die dann repliziert durch binäre Spaltung unterscheiden. In der Mitte des Zyklus, RBs Übergänge zurück in EBs, die dann in den extrazellulären Raum ausgestoßen werden, um neue Runden der Infektion zu initiieren, wenn die Wirtszelle lysiert (3).
C. trachomatis istrefraktär Routinemanipulation mit Standard molekulargenetische Werkzeuge, wie gezielte Gen-Ersatz, Transposons und Transduzieren Phagen, die von zentraler Bedeutung für die meisten Studien in Bakteriengenetik haben, ist es unklar, in welchem Umfang einzelne Chlamydia Gene tragen zur Umgehung der angeborenen Immunität , Nährstoff Erwerb, Entwicklung Übergänge oder andere Prozesse wichtig für das Überleben des Erregers in einem eukaryotischen Wirt (4). Folglich bleibt diese Erreger schlecht charakterisiert trotz ihrer klinischen Bedeutung.
Die Genome von Chlamydia spp. sind relativ klein (~ 1 Mb) (5) mit mehreren Arten und Biovare sequenziert mit Next Generation Sequencing-Technologien. Vergleichende Genomanalyse von WGS hat einzigartige Einblicke in die Evolution der Chlamydien-Arten und ihre Anpassung an den Menschen (6-8) und in gewissem Umfang zur Verfügung gestellt hat einige Informationen zur Verfügung gestellt, um das Potenzial in Abhängigkeit von Virulenzfaktoren (9, 10). Ter genetischen Vielfalt von klinischen Isolaten angezeigt nicht die Auflösung erforderlich ist, um systematisch Karte die Funktion der meisten Virulenzfaktoren, vermutlich, weil Mutationen in solchen Genen wäre leicht gegen ausgewählt haben. Ohne verwirrende Effekte aus natürlichen Selektion, erbgutverändernd-induced gene Variante mit definierten Tests, die Maßnahme Mängel in der Virulenz, das Spektrum von Mutationen, die befragt werden können, erweitern können gekoppelt. Chemische Mutagene, insbesondere, sind nützlich, da sie null, bedingten, hypomorphen (reduzierter Funktion) zu erzeugen, und hypermorphic (gain of function) Allele. Mit der Ankunft der robusten nächsten Generation Genom-Sequenzierung Technologien können solche Mutationen leicht identifiziert werden und kartiert. Auf diese Weise können starke Assoziationen zwischen Mutationen in einem Gen oder einer genetischen Weg und einem gemeinsamen Phänotyp gebildet werden, wodurch die Anwendung von Vorwärts genetische Ansätze.
Die Genomsequenzen von klinischen Stämmen offenbarte mosaicism bwischen Serovare und loci der häufigen Rekombination (11). Empirische Daten der Rekombination wurde durch Co-Infektion von zwei verschiedenen Antibiotika-resistenten Stämmen und Selektion resistenter Dual rekombinanten Nachkommenschaft, die offenbarte genetischen Beiträge von beiden Stämme (12, 13) nachgewiesen. Somit ermöglicht genetischen Austausch zwischen Wildtyp und Mutanten in einem Ko-Infektion Einstellung Trennung von chemisch induzierten Mutationen, die betroffene Gen, das den beobachteten Phänotyp führt zu lokalisieren.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese, WGS, und ein System für die DNA-Austausch innerhalb infizierter Zellen (14) (Abbildung 1) durchzuführen.
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Protocol
1. Chemischen Mutagenese
Hinweis: Es wird festgestellt, dass die replikative Form RB zugänglicher chemische Mutagenese als die EB vorliegt. In der Mitte des Zyklus (zwischen 18 bis 20 hpi), sind bei der größten RBs Zahlen vor RB-EB Übergang. Weil Chlamydia trachomatis ist ein obligat intrazelluläre Erreger, können die Auswirkungen der Mutagen auf dem Host Gesundheit zu begrenzen Bakterienwachstum. Vero-Zellen erwiesen sich als widerstandsfähiger gegen die negativen Auswirkungen der hohen EMS als andere Zelllinien getestet.
Segregation von Mutationen durch Rekombination erfordert die Auswahl für Antibiotika-resistente rekombinante Nachkommen. Wir empfehlen die Verwendung von Drogen-resistenten Stämme (z. B. Rifampicin, Spectinomycin oder Trimethoprim) zur Erzeugung von Mutanten für die Fähigkeit, rekombinante Analyse durchzuführen und isogenen Stämmen zu isolieren. Antibiotika-resistente Stämme wurden durch eine schrittweise Auswahl (15, 16) erzeugt wird.
Nichte: Chlamydia trachomatis (Stamm L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) ist BSL2 Erregers. Siehe institutionellen Standard Operating Procedures (SOP) für den Umgang mit solchen Erregern.
- Vorbereitung von kultivierten Zellen und Infektion:
- Seed etwa 1 x 10 6 Vero-Zellen (ATCC CCL-81) pro 25 cm 2 (T25) Kolben in 3 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Bei 37 ° C, 5% CO 2. Die Zellen sollten eine Monolayer innerhalb von 24 h zu bilden.
- Saugen Medium. Infect konfluenten T25-Kolben von Vero-Zellen mit Chlamydia in einer Multiplizität der Infektion (moi) von 5 (~ 14 × 10 6) in einem Gesamtvolumen von 3 ml Medium (DMEM, 200 ng / ml Cycloheximid, 10% FBS).
- Beginnen Mutagenese auf 18 Stunden nach der Infektion (HPI):
- Es werden 20 mg / ml EMS (Ethylmethansulfonat) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,9 mM CalciumChlorid und 0,49 mM Magnesiumchlorid in einer chemischen Schutzhaube als EMS ist eine flüchtige Flüssigkeit.
Hinweis: EMS ist ein potentes Mutagen und krebserregend. Neutralisieren EMS verschwenden und zu dekontaminieren, Leckagen, Kunststoff, Papier, Glas und mit 1 M Natriumhydroxid. - Saugen mittlere und waschen Sie die Zellen einmal mit 3 ml PBS / MgCl 2 / CaCl 2. Inkubieren Zellen mit 3 ml 20 mg / ml in PBS EMS / MgCl 2 / CaCl 2 für eine Stunde im Abzug bei Raumtemperatur. Vero-Zellen sind in der Lage, diese Konzentration von EMS und Bedingungen außerhalb des Inkubators für kurze Zeit überleben. Denken Sie daran, eine Kontrollprobe, der bisher nicht mutiert sind.
- Entfernen Medium mit EMS und legen Sie sie in einen Behälter mit 1 M NaOH auf die Mutagen inaktivieren. Waschen infizierten Zellen 3 mal in 3 ml PBS + MgCl 2 / CaCl 2, um das restliche erbgutverändernd zu entfernen. In 6 ml DMEM/10% FBS mit 200 ng / ml Cycloheximid und 25 ug / ml Gentamicin, und Inkubation bei 5% CO
- Auszug EBs durch hypotone Lyse: vollständig absaugen Medium. 1,0 ml H 2 O und Rock, um Zellen für 10 min zu entfernen. Lyse von Zellen und Abpipettieren für mindestens 10-mal. Sammle Lysat in einer Mikrofuge und fügen 0.250 ml 5x Saccharosephosphatsynthase Glutamat-Puffer (SPG), um es auf 1x Endkonzentration bringen. Lagerung bei -80 ° C.
Hinweis: Die Höhe der Mutagenese durch die Induktion von Rifampin Widerstand bewertet. Zum Nachweis der Frequenz Rifampin Widerstand, Plaque 1 x 10 8 und 7 x 10-fache serielle Verdünnungen von Bakterien in Gegenwart von 200 ng / ml Rifampicin. Die Frequenz Rifampin Widerstand wird als die Anzahl von Rifampicin resistent Plaques Gesamtzahl der Bakterien überzogen, definiert. Siehe folgenden Abschnitt für die Plaque-Anweisungen. - Auszug EBs durch hypotone Lyse: vollständig absaugen Medium. 1,0 ml H 2 O und Rock, um Zellen für 10 min zu entfernen. Lyse von Zellen und Abpipettieren für mindestens 10-mal. Sammle Lysat in einer Mikrofuge und fügen 0.250 ml 5x Saccharosephosphatsynthase Glutamat-Puffer (SPG), um es auf 1x Endkonzentration bringen. Lagerung bei -80 ° C.
- Es werden 20 mg / ml EMS (Ethylmethansulfonat) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,9 mM CalciumChlorid und 0,49 mM Magnesiumchlorid in einer chemischen Schutzhaube als EMS ist eine flüchtige Flüssigkeit.
2. Geklonte Isolierung von Chlamydia trachomatis Mutanten durch Plaque-Reinigung
- Set konfluente Monoschichten von Vero-Zellen in 6-Well-Platten: Samen ~ 0,4 × 10 6 Zellen in 3 ml DMEM/10% FBS pro Vertiefung. Erlauben Zellen, um eine homogene Monoschicht über die nächsten 24 h zu bilden.
- Auftauen Stammlösung mutagenisierter Chlamydia auf Eis. Führen 6 x 10-fach serielle Verdünnungen in einem Gesamtvolumen von 200 ul pro Verdünnung in DMEM/10% FBS und setzte sie auf dem Eis.
Hinweis: Bakterielle Titer in die Aufnahme bildenden Einheiten (IFU) ist eine gute Schätzung der Plaque-bildende Einheiten (PFU). Richten Sie die Plaque 10, 100, und 1000 pfu. - Waschen Vero Zellen zweimal mit 3 ml PBS pro Vertiefung.
- In 3 ml DMEM in jede Vertiefung für 6-Well-Platten und 100 ul der bakteriellen Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung. Swirl die Platte sogar Mischung zu gewährleisten.
- Spin infizierten Platten bei 2.700 xg für 30 min bei 15 ° C, dann bei 37 ° C in einer befeuchteten inkubieren,5% CO 2-Inkubator für 1-2 Std.
- Bereiten 0,54% Agarose in DMEM (für 6 Wells):
- Fügen Sie die folgenden Zutaten: 18,9 ml kaltem 2x DMEM, 4,2 ml FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 ug / ml Cycloheximid, 0,021 ml 50mg/ml Gentamicin. Gut mischen.
- Mix in 18,9 ml heißem sterilen 1,2% igen / H 2 O, Rühren, um Klumpen zu vermeiden. Mischung sollte handwarm. Halten Sie in einem warmen Wasserbad bei 55 ° C vor der Zugabe zu infizierten Zellen.
- Saugen Bakteriensuspension von Gerichten und gelten 6 ml 0,54% igen Agarose / DMEM pro Well. Erlauben Agarose vollständig erstarren bei Raumtemperatur außerhalb der Haube für 15 min. Trocknen Sie die Platten mit dem Deckel entfernt, in der Biosicherheit Haube für 15 min.
Hinweis: Vibration aus der biologischen Einschlußglocke können die erstarrenden Agarose verzerren. - Bei 37 ° C in CO 2-Inkubator für 7-10 Tage. Plaques sichtbar sein soll mit Hilfe eines Binokular. (Refer bis 3 für ein typisches Bild von Plaques Abbildung.)
- Ein Tag vor der Isolierung von Mutanten, seed 1 x 10 4 Vero-Zellen in 100 ul pro Vertiefung einer 96-Well-Platte. Zellen werden innerhalb von 24 h konfluent.
- Mit einem Dissektionsmikroskop, zu markieren Plaques abgeholt werden. Sammle Stecker von Plaques mit einer sterilen 1,0 ml Barriere Pipettenspitze.
- Resuspendieren Plaques in 100 ul DMEM mit 10% FBS, 400 ng / ml Cycloheximid, 50 ug / ml Gentamicin.
- Um Mutanten zu erweitern, überlagern die Aussetzung auf konfluente Monolayer von Vero-Zellen. Spin Platten bei 2.700 xg, 15 ° C für 30 min.
- Bei 37 ° C / 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. Ernte EBs, wenn> 50% der Zellen infiziert sind, die auftreten, so früh wie 48 hpi und so spät wie 14 Tagen. Diese Menge an infizierten Zellen ermöglicht genügend lebensfähige Bakterien gespeichert werden. Mutant Stämme unterscheiden sich in Wachstumsraten und Infektiosität. Erlauben langsam wachsende Stämme naturally erneut infizieren benachbarte Zellen, bis genügend Zellen infiziert sind.
- Auszug EBs durch hypotone Lyse von infizierten Zellen:
- Vollständig absaugen Medium.
- In 160 ul sterilem Wasser. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
- Stören Zellen durch Auf-und Abpipettieren mehrmals, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten, verwenden Barriere Tipps, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
- Übertragen Sie 160 ul von Lysaten zu Mikrozentrifugenröhrchen.
- Mischen Sie in 40 ul 5x SPG. Lagerung bei -80 ° C.
- Assay und Bildschirm Mutanten Phänotyp (e) von Interesse.
3. Whole Genome Sequencing von Selected Chlamydia Mutanten
- Extrahieren genomischer DNA aus Gradienten-gereinigten EBs, die weitgehend frei von verunreinigenden Wirts-DNA sind. Protokolle für große Kultur von Chlamydia und Reinigung von EBs in ref gefunden werden. (17). Verwenden kommerziellen genomische DNA Aufreinigungskits (zB Qiagen Katze. 69504) an extRACT DNA aus 2 x 10 9 Bakterien nach Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie ein Fluorometer (Qubit, Invitrogen Katze. Q32866) zur genauen Messung der DNA-Menge. 1-5 ug gereinigte DNA wird für die Illumina-Sequenzierung Plattform erforderlich.
Hinweis: Mehrere Plattformen zu sequenzieren bakteriellen Genomen, einschließlich Illumina/Solexa- und Solid-Systemen verwendet werden. Wir entschieden uns, HiSeq (Illumina) verwenden, da es hohe Dichte von kurzen produziert, aber qualitativ hochwertigen Sequenzierung liest. Kleinere Skala Genom Sequencer, wie IonTorrent (Life Technologies) und MySeq (Illumina) eignen sich auch, und mehr als ausreichend für Multiplexen diese Sequenzierung von bis zu 4 Chlamydia Genome in einer Zeit, die die minimale Abdeckung von 25X übersteigt angemessene Genom Montage. Herstellung von DNA-Bibliotheken für die Sequenzierung Illumina Plattform beschrieben. - Fragment DNA entsprechende Größe (300-400 Basenpaar für Illumina Sequenzierung) unter Verwendung eines adaptiven Focused Acoustics S220 instrument (Covaris) nach dem vom Hersteller vorgeschlagenen Einstellungen. Hinweis: DNA-Fragmentierung durch Vernebelung Ergebnisse in größeren Verlust der Probe aufgrund Aerosolisierung Probe.
- Bereiten Sie die genomische Sequenzierung Bibliotheken mit handelsüblichen Baukästen (Illumina FC-102-1001), folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Bibliotheken können indiziert mit Barcode-Primer (Illumina FC-121-1003), so dass mehrere Proben gepoolt werden können und gleichzeitig sequenziert werden.
- Führen Sequenzierungsproben. Dieser Schritt wird in der Regel durch kommerzielle Dienste oder Kern von engagierten technischen Personals betrieben durchgeführt. Folgen Sie ihre Verfahren und Empfehlungen.
- Illumina liest (FASTQ Format) können mit einer Referenz-Genom mit benutzerfreundliche grafische Benutzeroberfläche Software zusammengesetzt werden, wie Geneious (Biomatters), die auch für die SNP / Mutation Identifizierung verwendet werden. Zur Karte Mutationen, parametriert zu 90% für minimale Variante Frequenz und 50X für Mindestdeckung. Offene SOURCe Genom Monteure wie MAQ (18) und BWA (19), können ebenfalls verwendet werden.
- Bestätigen Mutationen durch Sanger-Sequenzierung nutzen genomischer DNA als Matrize für die PCR-Amplifikation von 300-500 bp flankierenden Regionen identifiziert Mutationen und Sequenz gereinigt oder verdünnt (1:20) PCR-Produkte durch Sanger-Sequenzierung.
4. Generierung von Chlamydia Rekombinanten
Hinweis: Chlamydia kann DNA während der Infektion austauschen, können die zur Erzeugung von rekombinanten Stämme (12, 13, 20). Nach der Co-Infektion von Zellen mit zwei einzigartigen Antibiotika-resistente Stämme, rekombinant "Nachkommen" für Dual Antibiotikaresistenz (12, 13). Wir nutzten dieses Phänomen, um Mutationen zu trennen und die Zusammenarbeit isogenen Stämmen zu erzeugen. Daher wurden Mutanten in antibiotikaresistenten Hintergrund erzeugt (z. B. Rifampicin Widerstand (R rif) H471Y in CTL0567 (rpoB)), so dass sie mit dem Wildtyp-Stamm bearin überquert werden kann,ga verschiedenen Antibiotika-resistente Allel (zB Spectinomycinresistenz (SPC R), G1197A in r01/r02 (16sRNA kopiert 1 und 2)). Angaben zur DNA Austausch und die Rekombination in Chlamydia, um Referenzen (12, 13) beziehen.
- Co-infizieren Wildtyp und Mutante klonale Stämme durch centrifuging6 x 10 5 Bakterien aus jedem Stamm auf konfluente Monolayer von Vero-Zellen auf einer 24-Well-Platte gewachsen. Parallel infizieren Monoschichten mit jedem Stamm allein.
- Mit 44 hpi, Ernte EBs durch hypotone Lyse von infizierten Zellen:
- Vollständig absaugen Medium.
- In 0,4 ml steriles Wasser und lassen Sie stehen für 10 min.
- Lyse Zellen durch kräftiges Pipettieren up & down für mindestens 10-mal. Transfer-Lysate zu einem Mikrozentrifugenröhrchen.
- Mischen in 0,1 ml 5x SPG eine Endkonzentration von 1x SPG.
- Rohlysaten kann sofort verwendet werden oder bei -80 ° C.
- Plaque 50 ul des rohen EB preps eind 5 x 1.10 serielle Verdünnungen in Agarose / DMEM ergänzt mit geeigneten Antibiotika für Rekombinanten auszuwählen. (Siehe Tabelle für typische Konzentrationen von Antibiotika zur Selektion von Rekombinanten.)
- Plaque reinigen und bereichern rekombinanten Stämme wie oben. Ergebnis Rekombinanten Anwesenheit oder Abwesenheit des gewünschten Phänotyp. Extrahieren von DNA aus rekombinanten Stämmen von DNAzol Behandlung (nächster Abschnitt) zur Genotypisierung auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Mutationen.
- Kreuze mit anderen Stämme tragen Antibiotikaresistenzmarkern weiter trennen Mutationen und erzeugen isogenen Stämmen wiederholt werden. Co-infizieren ausgewählten Rekombinanten zu einem anderen Wildtyp-Stamm mit einer unterschiedlichen Antibiotika-Marker.
Tabelle 1: Antibiotika-Konzentrationen für die Selektion von Rekombinanten:
| Endkonzentration | Anweisungen für die Zubereitung |
|---|---|
| 200 ng / ml Rifampicin Machen Sie 25 mg / ml Lagerung Lager in Dimethylsulfoxid (DMSO). Make-up 200 ug / ml Arbeitslösung durch Verdünnen der Lagerung Lager mit H 2 O. Lagerung bei -20 ° C in der Dunkelheit. | |
| 200 ug / ml Trimethoprim | Machen Sie eine 100 mg / ml in DMSO Lager. Lagerung bei -20 ° C |
| 200 ug / ml Spectinomycin | Machen Sie eine 100 mg / ml in Wasser stock in 100 ul Aliquots. Lagerung bei -20 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. |
5. Extraktion genomischer DNA aus rekombinanten Stämmen zur Genotypisierung
Hinweis: Spaltenbasierte Aufreinigungskits können ebenfalls verwendet werden. Ein Vorteil der DNA-Extraktion durch DNAzol Behandlung kosten.
- Infect 1,2 x 10 5 Chlamydien auf Einzelschichten von Vero-Zellen in 12-well Platten kultiviert.
- Bei 36-48 hpi absaugen Medium und fügen 0,375 ml DNAzol (Invitrogen 10503-027). Vorsichtig geschwenkt, die Zellen und die Pipette lysates in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Niederschlag DNA durch Zugabe von 0.188 ml 100% Ethanol. Durch Umdrehen mischen.
- Auszug DNA von Spulen mit einer Pipettenspitze und legen Sie sie in ein sauberes Röhrchen. Alternativ Pellet die DNA durch Zentrifugation bei Höchstgeschwindigkeit für 2 min bei Raumtemperatur oder 4 ° C, und dekantieren.
- Waschen DNA auszufällen zweimal mit 1,0 ml 75% Ethanol.
- Air-dry DNA nach dem Entfernen des Ethanol für 15 Sekunden.
- Löslich DNA mit 0,2 ml 8 mM NaOH auf pH 8,0 neutralisiert mit 20,2 ul 0,1 M HEPES. Bringt bis zu einem Gesamtvolumen von 0,5 ml mit Wasser oder TE. Alternativ resuspendieren DNA in TE-Puffer (DNA-Pellet nicht vollständig. Gelöst).
- Verwenden DNAzol extrahierten DNA als Matrize für die PCR-Amplifikation von 300-500 bp flankierenden Regionen identifiziert Mutationen. Sequence gereinigt oder verdünnt (1:20) PCR-Produkte durch Sanger-Sequenzierung.
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Representative Results
Die Exposition gegenüber erbgutverändernd führt zu Einschlüssen, die frei von Bakterien, vermutlich wegen der bakteriellen Zelltod erscheinen. Typischerweise wird Serovar LGV-L2 vollständig lysieren infizierten Zellen innerhalb von 48 h nach der Infektion, aber die Behandlung mit Mutagene können diesen Zyklus auf> 90 Stunden zu verlängern. Rund 10% der Einschlüsse werden erwartet zu erholen. In unseren Experimenten infizierten Vero-Zellen mit 20 mg / ml behandelt EMS führte zu einem 99% igen Rückgang bei der Gewinnung von infektiösen Nachkommen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Mutagenbehandlung führte auch zur Entstehung von Plaques mit veränderter Morphologie, einschließlich der kleinen Plaques (LLG) (Abbildung 3). Andere Morphologien sind Plaques, die eine granulare, klumpig oder wabenförmigen (Abbildung 3) erscheinen. Diese Phänotypen kann reflektieren Mängel in Prozessen für die Infektion und das Überleben in der Host-Umgebung erforderlich. Mutanten mit kleine Plakette (LLG) Morphologie erzeugen im Allgemeinen deutlich weniger infektiöse Nachkommen und kann bis zu 2-3 Wochen auf einmplify. Vorsicht ist geboten bei Passagieren diese Stämme als Rückschläge und Suppressormutationen bei einer hohen Frequenz ansammeln kann.
Die Dosen von EMS in diesen Studien verwendet werden, um zwischen 3 bis 30 Mutationen pro Chlamydia Genom, wie experimentell durch WGS (Abbildung 4) beurteilt führen. Obwohl Gradienten gereinigte EBs weitgehend frei von Wirtszelle Material, wird Wirts-DNA ebenfalls erkannt und besteht zu 10-15% der genomischen preps.
Co-Infektion von zwei Nachkommen-Stämme können mit genetischen Beiträge von beiden Stämme erzeugen und tritt bei Frequenzen von 10 -4 bis 10 -3, 10 etwa 4-mal häufiger als spontane Widerstand (13). Rekombination Haltepunkte treten typischerweise zwischen ~ 100 kb bis 800 kb (12). Eine Analyse solcher rekombinanter Stämme offenbaren kann Mutationen, die genetisch mit dem Phänotyp unter Studie verbunden sind.
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Discussion
Diese Methode entspricht den grundlegenden Anforderungen für die genetische Analyse, wie es Verbindung zwischen Genotypen und Phänotypen herstellt. Wichtig ist, dass diese ohne Hilfe üblicher molekulare Werkzeuge für die rekombinante DNA-Transformation und Insertions-Inaktivierung von Genen in Bakterien, die oft eine geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Analyse der Genfunktion in nicht-Modell Mikroben erreicht.
Ein kritischer Schritt ist Klonalitätsanalyse von plaquegereinigt Mutanten zu gewährleisten. Kreuzkontamination mit Wildtyp oder "fitter" Mutanten können schnell auf Mutanten ist outcompeted führen. Ebenso können Mapping Mutationen durch Sequenzierung ganzer Genome von nicht-klonale Proben zu mehrdeutigen Ergebnissen führen. Isolierung von Mutanten aus stark Plaques Brunnen oder Einstecken Plaques, die zu nahe beieinander liegen sollten vermieden werden. Darüber hinaus ist für langsam wachsende Mutanten können Revertanten bei relativ hohen Frequenzen entstehen. Wir empfehlen, um die ursprünglichen oder niedrigen Durchgang Aktien. Replaque Mutanten wenn Kreuzkontamination oder Revertanten vermutet werden.
Die Konzentration von EMS abgesenkt werden, um die Häufigkeit von Mutationen zu verringern. Die Mutationsrate, wie durch die Erzeugung von Rifampicin resistenten Varianten beurteilt (aufgrund von Mutationen im Gen für RNA-Polymerase hinweisen, rpoB) war optimal in unsere Hände bei 20 mg / ml EMS. Die Induktion von Rifampin Widerstand kann durch die Frequenz der Plaques in Gegenwart von Rifampin und ausgebildet ist, um die Frequenz des chemisch induzierte Mutationen korreliert beurteilt werden.
EMS mit anderen Mutagene ersetzt werden, um das Spektrum von Mutationen, die erhalten werden können, zu erweitern. Zum Beispiel können DNA interkalierenden Mitteln wie Psoralen und ihren Derivaten, die Deletionen und Insertionen (21) zu induzieren.
Mutationen, die nahe beieinander Karte in das Genom (<100 kb abgesehen) sind schwierig, durch Rekombination aufheben. Wenn hohe Mutagenese Preise sind achieved, kann es schwierig sein, eindeutig identifizieren eine kausale Mutation. Da jedoch Transformation von C. trachomatis ist nun möglich, mit Shuttle-Plasmide (22), wenn auch ineffizient, kann es möglich sein, diese Verknüpfung Probleme durch die Ergänzung Mutationen in trans mit einer Wildtyp-Kopie des mutierten Gens auf einem Plasmid anzugehen.
Abbildung 1. Strategie für vorne und Rekombination genetischen Analyse-basierte Mapping in Chlamydia. Rifampicin resistent (Rif R) C. trachomatis wurde während seiner replikativen Phase mutiert und verwendet, um Vero-Zellen zu infizieren, bis sichtbare Plaques gebildet. Einzelne Klone von Mutanten wurden gesammelt und nach bestimmten Phänotypen, wie veränderter Plaque Morphotypen getestet. Die Genome von Mutanten, die eine gemeinsame Phänotyp wurden sequenziert iekb.html gemeinsame genetische Läsionen. Um diese Verbindung zwischen Gen und spezifische Läsionen Plaque Morphologien herzustellen, wurden Vero-Zellen mit Mutanten in Arif R Hintergrund und Wildtyp-SPC R Chlamydienstämmen generiert co-infiziert und rekombinante Rif R SPC R-Stämme unter den resultierenden infektiösen Nachkommen wurden in die ausgewählte Anwesenheit von Rifampicin und Spectinomycin ("Kreuze"). Die Trennung der einzelnen Mutationen in der elterlichen Rif R mutierten Stamm unter den rekombinanten Bakterien Anzeigen veränderten Plaquemorphologie wurde durch gezielte DNA-Sequenzierung bestimmt. (Wiedergabe mit Genehmigung aus PNAS (14)) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 2. Schematische Darstellung der EMS-Mutagenese-Protokoll. Chlamydia trachomatis LGV-L2-infizierten Zellen wurden während der EMS RB Phase des Infektionszyklus ausgesetzt, und die Infektion wurde für 72 h gehen zur Erzeugung von infektiösen einfachen Körper (EB) zu ermöglichen . Mutagenisierte EB Pools wurden geerntet und titriert für die Aufnahme bildenden Einheiten (IFU) und Plaque-bildenden Einheiten auf Vero-Zellen. N, Kern. (Wiedergabe mit Genehmigung aus PNAS (14)) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 3. Beispiele für häufig Plaque Morphologien unter EMS-mutagenisierte C. trachomatis. Mutagenisierte C. trachomatis LGV-L2 dürfen Plaques auf Vero-Zellen bildens für 14 Tag. Plaques in der Größe (A) und Morphologie variieren (B), die isoliert werden können, in Vero-Zellen vermehrt, und in Reinfektion von Vero Monoschichten, um die Stabilität der Platte Morphotypen bestätigen. Beispiele für häufig Phänotypen einschließlich Waben (HCM), verklumpter (CLMP), kleine Plakette (LLG), und granulare (GRN) gezeigt. Die Pfeile zeigen große granuläre Ablagerungen innerhalb eines Grn Plaque. (Wiedergabe mit Genehmigung aus PNAS (14)) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 4. Bezeichnung des EMS-induced gene Läsionen. Chromosomale Lage von Nukleotid-Varianten in Mutanten, die das Grn Plaque Morphotyp anzuzeigen. Whole-Genom-Sequenzierung von drei Grn Mutanten identifiziert Mutations, dass bis Aminosäure Änderungen in glgB führen, die für ein Glykogen-Branching-Enzym. (Wiedergabe mit Genehmigung aus PNAS (14)) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Disclosures
Es gibt nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
