Summary
Due metodi complementari basati sulla citometria di flusso e microscopia sono presentati che consentono la quantificazione, a livello di singola cellula, delle dinamiche di espressione genica indotte dall'attivazione di una via MAPK in lievito.
Abstract
La quantificazione dell'espressione genica a livello di singola cellula svela nuovi meccanismi di regolamentazione oscurate nelle misurazioni effettuate a livello di popolazione. Due metodi basati sulla microscopia e citometria a flusso sono presentati per illustrare come tali dati possono essere acquisiti. L'espressione di un reporter fluorescente indotto all'attivazione della elevata osmolarità glicerolo MAPK in lievito è usato come esempio. I vantaggi specifici di ciascun metodo sono evidenziati. Flusso misura citometria un gran numero di cellule (10.000) e fornisce una misura diretta delle dinamiche di espressione proteica indipendente delle lenti cinetica di maturazione della proteina fluorescente. Imaging di cellule viventi mediante microscopia è invece limitato alla misura della forma maturato del reporter in meno cellule. Tuttavia, le serie di dati generati da questa tecnica possono essere estremamente ricco grazie alle combinazioni di reporter multipli e alle informazioni spaziale e temporaleottenuto da cellule singole. La combinazione di questi due metodi di misurazione in grado di fornire nuove intuizioni sulla regolazione dell'espressione proteica mediante vie di segnalazione.
Introduction
Segnalazione via cascate di trasduzione spesso culmina nella espressione di proteine. La caratterizzazione di questo profilo di espressione è un elemento chiave per comprendere la funzione di percorsi biologici. L'identificazione dello spettro di up-regolata proteine e le dinamiche della loro attivazione può essere ottenuto attraverso diverse tecniche come micro-array, Northern blot o western blot 1-3. Tuttavia, queste tecniche media la risposta di un'intera popolazione di cellule. Per comprendere la regolazione fine della espressione delle proteine, è desiderabile raccogliere misurazioni a livello di singola cellula. Idealmente, queste misure dovrebbero anche fornire dati quantitativi suscettibili di sviluppare modelli matematici della via sottostante.
Microscopia e citometria a flusso sono due tecniche, che sono ideali per fornire tali misurazioni quantitative singola cellula. La codifica endogena di proteine con una proteina fluorescente può be utilizzato per quantificare il loro livello di espressione 4. Tuttavia, dato che l'aggiunta di una grande porzione fluorescente al terminale della proteina può renderlo non funzionale, è spesso più desiderabile generare specifici reporter di espressione basati su un promotore guida l'espressione di un costrutto fluorescente. Questa proteina giornalista è esogeno al sistema cellulare e quindi non influenza gli eventi di segnalazione che stanno avvenendo nella cella.
Sia microscopia e citometria a flusso sono stati ampiamente utilizzati in campo segnalamento lievito. Come esempi; collaboratori Colman-Lerner e correlati, in singole cellule, l'espressione di accoppiamento reporter specifici e costitutivamente espresse mediante microscopia a quantificare il rumore nel lievito accoppiamento trasduzione del segnale cascata 5, Acar e colleghi flusso citometria utilizzati per studiare la rete di regolamentazione controllo dell'espressione dei geni GAL 6. In uno studio precedente 7, abbiamo utilizzato una combinatisu queste due tecniche per studiare l'espressione uscita dal glicerolo alta osmolarità (HOG) percorso in erba lievito. Questo mitogen proteina chinasi attivata (MAPK) è innescato da stress iper-osmotico. Esso determina l'attivazione dei Hog1 MAPK, che trasloca nel nucleo della cellula per indurre un programma trascrizionale conseguente espressione di circa 300 geni. Per studiare questo processo, abbiamo costruito un reporter espressione basato sul promotore STL1 (un gene indotto specificamente in risposta all'attività Hog1 8) che guida l'espressione di una proteina fluorescente Venus quadrupla (p STL1-qv). Citofluorimetria misurazioni scoperto la presenza di due popolazioni di cellule a livello di stress intermedio (0.1 M NaCl) con solo una frazione della popolazione che esprime il reporter fluorescente. Abbiamo usato la microscopia di approfondire questo comportamento e abbiamo scoperto che questo rumore di espressione della proteina è stata governata da fattori intrinseci 9. Noi could osservano inoltre che le cellule con un analogo livello di attività Hog1 possono visualizzare profondamente diversi esiti di espressione. La combinazione di queste due tecniche ha permesso di dimostrare come la lenta ristrutturazione dei geni di risposta allo stress ha influenzato l'esito espressione a livello di singola cellula 7.
In questo lavoro, usiamo l'espressione della p STL1-qV giornalista indotta dallo shock iper-osmotico come un esempio della quantificazione dell'espressione proteica mediante microscopia e citometria a flusso. Lo stesso ceppo sottoposto a 0,2 M NaCl sforzo è stato studiato con entrambe le tecniche. Questo ci permetterà di evidenziare alcune differenze fondamentali in queste due tecniche altamente complementari.
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Protocol
1. Misure Microscopia
- Inoculare 5 ml di terreno sintetico con il lievito.
- Crescere le cellule a 30 ° C per una notte.
- Misurare il diametro esterno 600 della cultura durante la notte la mattina successiva.
- Diluire cultura durante la notte in mezzo sintetico 5 ml di OD 600 0.05.
- Far crescere la cultura diluito a 30 ° C per almeno 4 ore.
- Preparare 3 volte concentrato (0,6 M) soluzione di NaCl in terreno sintetico.
- Preparare una soluzione 1 mg / ml di Concanavalina A (ConA) in PBS.
- Filtrato ~ 200 ml di soluzione di ConA nella diapositiva bene.
- Lasciate riposare per 30 min.
- Rimuovere la soluzione ConA.
- Aggiungere 150 microlitri H 2 O al pozzo.
- Rimuovere H 2 O.
- Misurare OD 600 di coltura cellulare.
- Preparare 300 ml di coltura cellulare a OD 600 = 0,02 in una provetta da 1,5 ml.
- Sonicare le cellule in un bagno di acqua per 45 sec.
- Vortex brevemente la microtube.
- Sonicare le cellule in un bagno di acqua per 45 sec.
- Vortex brevemente la provetta.
- Aggiungere 200 ml di coltura cellulare al pozzo.
- Attendere 30 minuti per consentire le cellule si depositano sul fondo del pozzo.
- Posizionare il vetrino bene sul microscopio.
- Selezionare le impostazioni di illuminazione per il canale fluorescente da registrare.
- Selezionare le impostazioni di illuminazione per due immagini in campo chiaro (uno leggermente fuori fuoco: 3 micron sotto il piano focale per permettere una corretta segmentazione delle cellule).
- Selezionare gli intervalli di tempo per la misurazione time-lapse
- Selezionare i campi di vista di immagine.
- Avviare l'acquisizione di alcuni fotogrammi.
- Pausa l'acquisizione di aggiungere 100 ml di 0,6 M NaCl medie.
- Riprendere immagini.
2. Misure Citometria a flusso
- Inoculare 5 ml di terreno sintetico con il lievito.
- Coltivare a 30 ° C durante la notte.
- Misural'OD 600 della cultura durante la notte la mattina successiva.
- Diluire cultura durante la notte in mezzo sintetico 5 ml di OD 600 0.1.
- Coltivare a 30 ° C per almeno 4 ore per raggiungere un OD 600 di 0,2-0,4.
- Preparare la soluzione cycloheximide 1 mg / ml in H 2 O.
- Preparare 3 volte concentrato (0,6 M) soluzione di NaCl in terreno sintetico.
- Preparare una provetta da 1,5 ml con 100 ml di 0,6 M NaCl medio per ciascun punto di tempo da misurare.
- Al tempo 0, aggiungere 200 ml di coltura cellulare per ogni provetta.
- Incubare con agitazione a 30 ° C.
- Al tempo T, aggiungere 30 microlitri cycloheximide a una provetta.
- Ripetere passo 2.11 per tutti i punti di tempo desiderati.
- Incubare tutte microtubi per almeno 45 minuti e fino a 3 ore a 30 ° C con agitazione.
- Preparare tubi FACS con 400 microlitri di PBS.
- Sonicare le cellule in bagnomaria per 1 min.
- Vortex brevemente i microtubi.
- Figlioicate le cellule in bagnomaria per 1 min.
- Vortex brevemente i microtubi.
- Aggiungere 100 microlitri di coltura cellulare da ciascuna provetta al corrispondente tubo FACS.
- Selezionare il laser di eccitazione 488 nm e 530/30 filtro passa-banda nm per il rilevamento.
- Test di non esprimere e di esprimere appieno esempio per verificare se rientrano nel campo di sensibilità del rivelatore.
- Misurare 10.000 cellule per ogni campione acquisito.
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Representative Results
Microscopia
Le cellule di lievito recanti l'espressione giornalista STL1 p-q V (ySP9 7) sono stati attaccati al fondo del pozzo scorrevole e posti sotto il microscopio. Le cellule sono state stimolate con l'aggiunta di mezzo sollecitazioni direttamente nel pozzo nel corso della sessione di imaging. Questo ci permette di acquisire alcune immagini delle cellule prima dell'induzione percorso e seguiamo il loro destino dopo la stimolazione. Nella fattispecie, le cellule sono state seguite per ~ 2 ore con un intervallo di tempo di 10 min. Figura 1A è l'immagine di cellule non fluorescenti prima dell'induzione e la Figura 1B mostra le stesse cellule 2 ore dopo stress quando il reporter espressione contiene stata indotta ed è diventato fluorescente.
Per estrarre le informazioni quantitative presenti in queste immagini, un processo di analisi dell'immagine complesso deve essere eseguita. Esso comprende la segmentazione delle cellule per definire gli oggetti nel imago, il monitoraggio di questi oggetti da un fotogramma all'altro e le misure delle caratteristiche di questi oggetti (forma e intensità proprietà). Abbiamo sviluppato la nostra piattaforma denominata YeastQuant effettuare questa analisi 10. Un paio di altri software non commerciali sono a disposizione per eseguire queste operazioni:. CellProfiler 11, CellID 12 o CellX 13 Figura 1C visualizza i risultati di un'analisi effettuata con YeastQuant. Ogni traccia rossa rappresenta l'evoluzione temporale della intensità media di fluorescenza di una singola cella. La linea blu mostra la mediana di oltre 500 cellule che sono stati segmentati e monitorati nel corso dei 20 fotogrammi di cinque film in time-lapse acquisiti da cinque diversi campi di vista dello stesso bene. L'area in azzurro rappresenta il percentile 25 e 75 ° di tutte le intensità misurata in un dato punto nel tempo.
Citometria a Flusso
Per il measurem citometria a flussogenitori, la coltura cellulare è stato versato in microprovette contenenti il mezzo di stress. Per studiare l'evoluzione temporale della p espressione STL1-qV, la traduzione è stata inibita a diversi intervalli di tempo (da 5 a 10 intervalli di minimo) con cycloheximide (Figura 2). Questo farmaco blocca la sintesi di nuove proteine, ma la maturazione della proteina fluorescente già espressa non è perturbata. Pertanto, dopo 45 minuti ad un'ora di incubazione, le cellule possono essere misurate nel citometro a flusso permettendo la quantificazione della quantità di proteina prodotta al momento della cicloesimide aggiunta. Questa strategia elude il problema della proteina fluorescente maturazione e quindi quantifica le vere dinamiche fluorescente sintesi proteica.
Confronto delle due tecniche
Figura 3A confronta le dinamiche del giornalista espressione misurati mediante microscopia e citometria a flusso. Mentre il segnale fluorescente inizia a salire 30-40min dopo lo stress con microscopia, le misurazioni citofluorimetria dimostrano chiaramente che le proteine sono già prodotte tra 10 a 15 minuti dopo lo stimolo. Questo ritardo mezz'ora è dovuta alla lenta maturazione delle proteine fluorescenti 14. Sebbene entrambi i metodi quantificare l'intensità di fluorescenza delle cellule, si deve tener presente che in questo studio, non misurano lo stesso processo biologico. Mentre, microscopia segue l'apparizione del segnale fluorescente, la citometria a flusso effettivamente quantifica la sintesi della proteina. È essenziale tener conto di questo passaggio maturazione durante l'esecuzione live-cell imaging. In una situazione in cui una proteina endogena viene etichettato con una proteina fluorescente, la proteina endogena sarà espresso e attivo prima della fluorescenza della sua tag può essere rilevato.
Come indicato in precedenza, entrambe le tecniche forniscono informazioni complementari. La citometria a flusso può misurare un gran numero di cellule molto rapidamente (10.000 o più). Si può quindi fornire set di dati statisticamente ricchi in cui due popolazioni si sovrappongono possono essere identificati o pochi eventi rari possono essere osservate. Microscopia fornisce informazioni su un numero limitato di cellule (dell'ordine di 100). Tuttavia, poiché questo insieme di dati contiene informazioni temporali e spaziali e permette la correlazione delle misurazioni multiple nella stessa cella, può offrire molto preziose nel processo biologico indagato.
Figura 1. Misura di espressione giornalista al microscopio. A e B. Immagini di cellule che portano il fluorescente espressione giornalista p STL1-qV prima (A) e 2 ore dopo stimolazione con 0,2 M NaCl (B). C. Naturalmente il tempo di influenza orescence apparizione. Le curve rosse rappresentano l'intensità media di fluorescenza cellulare di alcuni rappresentativi tracce singola cellula. La curva blu rappresenta la fluorescenza mediana di 550 tracce singola cellula. L'area in azzurro rappresenta il percentile 25 e 75 ° dell'espressione fluorescente della popolazione di cellule in ogni punto. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Misura di espressione giornalista mediante citometria di flusso. Istogrammi della fluorescenza cellulare delle cellule che portano il fluorescente espressione giornalista p STL1-qV trattati con 0,2 M NaCl e inibito con cycloheximide in diversi momenti.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Confronto delle dinamiche di espressione misurati mediante microscopia e citometria a flusso. A. medio dell'intensità di fluorescenza misurata mediante citofluorimetria a flusso (linea continua) e microscopia (linea tratteggiata) in funzione del tempo per tre repliche biologiche. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. B e C. istogrammi dell'intensità di fluorescenza normalizzata a 120 minuti dopo stress per microscopia (B) e 60 minuti dopo stress per citometria a flusso (C) per le tre repliche. clicca qui pervedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Microscopia
Il trattamento del pozzetto con ConA è un passo essenziale per assicurare una corretta rappresentazione delle cellule. Poiché ConA ha una bassa solubilità in PBS (5 mg / ml), il processo di filtrazione permette la rimozione di grandi aggregati che sono presenti nella soluzione filtrata e interferiscono con l'imaging. Cellule attribuiscono relativamente fortemente alla superficie trattata e l'aggiunta della soluzione indurre non dovrebbero disturbare la localizzazione delle cellule, consentendo un controllo continuo prima e dopo lo stimolo. Questo trattamento può essere applicato anche a fluire canali o dispositivi microfluidici sono le cellule sono sottoposte ad un flusso costante di 7,15. Se il bene non è correttamente risciacquato con acqua dopo il trattamento, le cellule non aderisca perfettamente al vetro, presumibilmente perché il ConA in soluzione lega direttamente alle cellule e impedisce loro di formare un forte legame alla superficie del vetro. Dopo la fase di lavaggio, il pozzo può rimanere asciutto da 3 -4 ore prima dell'aggiunta di cellule senza influenzare sensibilmente il legame delle cellule al vetro.
La selezione del tempo di esposizione per il canale fluorescente è un'impostazione critica per il successo dell'esperimento. Poiché la fluorescenza della cella aumenta durante il time-lapse, è importante testare preventivamente con un campione indotta qual è il tempo di esposizione massimo che può essere utilizzato per evitare la saturazione delle immagini durante l'acquisizione. Un altro parametro da tenere in considerazione quando si seleziona il tempo di esposizione è lo sbiancamento del segnale fluorescente. Per ogni campione, si deve trovare un compromesso tra luminosità dell'immagine e la degradazione del segnale a causa di sbiancamento durante il time-lapse. L'intervallo di tempo tra ogni acquisizione influenza fortemente lo sbiancamento del fluoroforo. Poiché l'espressione della proteina è un processo relativamente lento, si utilizzano in genere 10-15 min. intervalli. Se hanno bisogno di essere f altri processi più velocisusseguono in parallelo per l'espressione della proteina, potrebbe essere opportuno utilizzare diverse fasi temporali nell'intero Film accelerato (1-2 min all'inizio e 5-15 min per acquisizioni successive).
Il controllo della densità cellulare è un parametro essenziale tener conto. Se la densità è troppo bassa, solo poche cellule saranno presenti in ciascun campo visivo conseguente poca statistica per il set di dati. Tuttavia, se la densità è troppo alta, potrebbe ostacolare la segmentazione, il monitoraggio e la quantificazione delle cellule, rendendo difficile per estrarre le informazioni desiderate dalle immagini. Per determinare la densità di semina, un parametro aggiuntivo per tenere in considerazione è la durata dell'esperimento. Se un esperimento dura per più cicli di divisione, è consigliabile iniziare con un campo sparso di vista che gradualmente riempire durante il decorso della rappresentazione a causa divisione delle cellule e stabilirsi di cellule in soluzione. Nel protocollo, si consiglia di utilizzareun OD 600 di 0,02, a seconda del tipo di esperimento eseguiamo usiamo OD 600 da 0,05 per brevi film intervallati a 0.005 per quelle più lunghe.
Il numero di cellule analizzate è chiaramente un parametro essenziale per la validità dell'esperimento. A volte un minimo di 20-30 cellule sono combinati per generare un dataset. Tuttavia, per iniziare ad avere set di dati statisticamente significativi, un centinaio di cellule o di più sono probabilmente necessarie. L'ingrandimento dell'obiettivo determina la dimensione dell'area immaginata e così il numero di cellule impressionate. Per misurazioni di espressione della proteina, in cui lo scopo è quello di misurare la fluorescenza media della cella, di elevata apertura numerica 40X obiettivo ad immersione è la soluzione migliore fornendo sia buon rapporto segnale rumore e un ampio campo visivo. Se le strutture sub-cellulari devono essere analizzati, ingrandimenti maggiori (obiettivi 60X o 100X) sono spesso necessari, con conseguente misurazione del minor numero di cellule. L'avvento di OCM unicaTelecamere S con una taglia rivelatore quasi quattro volte più grande di quella dei CCD tradizionale è evidentemente un vantaggio avere più cellule per campo.
Con un XY-stadio motorizzato, è possibile immagine in parallelo più campi visivi per aumentare il numero di cellule nel dataset finale. Tuttavia, vi è un compromesso tra il numero di posizioni XY visitati e la velocità di acquisizione dell'immagine. A seconda della velocità di fase e il numero di illuminazioni registrati, di solito è fattibile immagine dieci posizioni in meno di un minuto. Per quantificare eventi di segnalazione veloci, questo può diventare un fattore limitante. Per misurazioni di espressione della proteina, in cui avvengono i cambiamenti di fluorescenza su una scala temporale più lento, di solito non è una limitazione. In alternativa, poiché questi esperimenti di espressione durano per qualche ora e causa della lenta risoluzione temporale richiesto, diventa vantaggioso immagine campioni multipli in parallelo. Diverse fonti vicine can essere seminato con wild type e mutante cellule, stimolo differente può essere applicato a ciascun pozzetto o repliche biologiche può essere misurata in parallelo. Scansione attraverso tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti viene normalmente realizzato con l'obiettivo di aria per schermi di microscopia 16. A causa della bassa abbondanza di proteine endogene in lievito, la loro quantificazione richiede un obiettivo di olio ad alta apertura numerica. Questo limita fortemente l'intervallo che può essere percorsa con l'obiettivo. Tuttavia noi abitualmente immagine quattro pozzi vicini di stare vicino a loro angolo comune. È comunque più impegnativo all'immagine un maggior numero di pozzi. Obiettivi acqua con distributori automatici potrebbero aggirare questo problema a scapito di una perdita minore di luminosità.
Citometria a flusso
Raccogliere un numero sufficiente di cellule è quasi un problema con citometri a flusso. Tipicamente 10,000-100,000 cellule possono essere acquisite in un minuto. Tuttavia, perché nessuna immagine di tegli cella viene acquistata, è importante selezionare correttamente la popolazione cellulare da analizzare. Soppressione delle celle in base ai misurati in avanti e disperde laterali può permettere di selezionare le singole celle piuttosto che gruppi di cellule e per rimuovere i detriti cellulari dall'analisi. In figura 2, ciascun istogramma rappresenta una popolazione di circa 5.000 cellule, che sono stati selezionati in base alle loro proprietà di diffusione di 10.000 eventi misurati.
Suddividendo gruppi di cellule in cellule singole, sonicazione della coltura cellulare è un ulteriore modo per migliorare la qualità dei dati acquisiti. Questo vale per la microscopia in cui gruppi di cellule possono essere molto difficili da segmento correttamente. La durata di questa fase deve essere testato sperimentalmente. Di solito eseguire due cicli di sonicazione in un bagno d'acqua di 30 secondi ad un minuto seguita da vortex della sospensione cellulare. Sonicazione prolungata può provocare la lisi delle poche cellule. Tuttavia, non abbiamo observe un up-regulation degli stress geni responsivi a causa di questa fase sperimentale. Si noti che l'aggregazione delle cellule è un fondo fenotipo dipendente, per le cellule W303 esempio mostrano una maggiore tendenza ad aggregare rispetto alle cellule S288C.
La variabilità nelle misurazioni singola cella
Nella Figura 3A, la media e l'errore standard per tre esperimenti indipendenti eseguiti da citometria di flusso e microscopia è tracciata. Le piccole differenze tra le tre curve derivano dal fatto che gli errori sperimentali sono relativamente piccole per queste misurazioni semplici e che molte cellule sono misurati (più di 5.000 per citometria a flusso, tra 370-550 per microscopia). L'evoluzione temporale delle curve microscopia è più liscia di quella dei dati di citometria a flusso. Una probabile ragione di questo comportamento è il processo di preparazione del campione. Per la microscopia, tutti i punti temporali in un esperimento derivano dallo stesso evento stress, mentre peril FACS, il campione per ciascun punto di tempo si sottolinea singolarmente. Piccole variazioni di volume delle soluzioni di stress e la cultura può comportare una piccola differenza nell'output espressione genica. Una strategia alternativa potrebbe essere quella di sottolineare 5 ml coltura di cellule e rimuovere aliquote nei momenti desiderati per inibire loro con cycloheximide. Entrambi i metodi funzionano bene, usiamo il metodo di preparazione provetta perché offre una maggiore flessibilità ed è adatto anche per le misure di curve dose-risposta in cui più concentrazioni di NaCl devono essere misurate in parallelo.
Il basso rumore in queste curve medi tuttavia non riflette l'intera gamma di variabilità presenti a livello di singola cellula. Nella Figura 3B e 3C, gli istogrammi dell'espressione misurati mediante microscopia e citometria a flusso in un singolo punto di tempo sono tracciate. Questi due pannelli illustrano bene il fatto che le variazioni tra le repliche tecniche sono relativamente piccole, especbuona resa in confronto alla grande variabilità osservata nell'espressione delle singole cellule. La differenza nelle forme di distribuzione tra la microscopia e la citometria a flusso misurazioni deriva dal fatto che con citofluorimetria l'intensità cellulare totale è quantificato mentre nelle immagini di microscopia è stata calcolata l'intensità media cellulare. Quest'ultimo medie di misura su variazioni nelle dimensioni delle cellule e quindi si traduce in distribuzioni più stretti.
Le due tecniche qui presentate permettono di studiare quantitativamente il comportamento delle singole cellule. Questa caratteristica è di solito nascosto in misurazioni biologiche tradizionali eseguite a livello di popolazione. Capire come la variabilità nella risposta delle singole cellule emerge in grado di offrire importanti intuizioni nella complessa regolazione di processi biologici.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Matthias Peter e il suo gruppo presso l'Istituto di Biochimica presso l'ETH di Zurigo, dove sono stati sviluppati questi metodi. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation svizzero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 | |
References
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