Summary
Dos métodos complementarios basados en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.
Abstract
La cuantificación de la expresión génica a nivel de células individuales descubre nuevos mecanismos de regulación oscurecidas en las mediciones realizadas a nivel de población. Se presentan dos métodos basados en la microscopía y citometría de flujo para demostrar cómo se pueden adquirir esos datos. La expresión de un indicador fluorescente inducida tras la activación de la alta osmolaridad MAPK vía de glicerol en la levadura se utiliza como un ejemplo. Se destacan las ventajas específicas de cada método. La citometría de flujo mide un gran número de células (10.000) y proporciona una medida directa de la dinámica de la expresión de la proteína independiente de la cinética lenta maduración de la proteína fluorescente. Obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía es por el contrario limitado a la medición de la forma madurado del reportero en un menor número de células. Sin embargo, los conjuntos de datos generados por esta técnica pueden ser extremadamente rico gracias a la combinación de varios periodistas ya la información espacial y temporalobtenido a partir de células individuales. La combinación de estos dos métodos de medición puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la regulación de la expresión de proteínas por las vías de señalización.
Introduction
La señalización a través de cascadas de transducción menudo culmina en la expresión de proteínas. La caracterización de este perfil de expresión es un elemento clave en la comprensión de la función de las vías biológicas. La identificación de espectro de hasta reguladas proteínas y la dinámica de su activación se puede lograr mediante diversas técnicas como la micro-arrays, transferencias Northern o transferencias Western 1-3. Sin embargo, estas técnicas promedio de la respuesta de toda una población de células. Para entender la regulación fina de la expresión de proteínas, es deseable para reunir mediciones en el nivel de células individuales. Lo ideal sería que estas medidas también deben proporcionar datos cuantitativos susceptibles de desarrollar modelos matemáticos de la vía subyacente.
Microscopía y citometría de flujo son dos técnicas, que son ideales para ofrecer este tipo de mediciones cuantitativas de células individuales. El etiquetado endógena de proteínas con una proteína fluorescente puede be utilizado para cuantificar su nivel de expresión 4. Sin embargo, ya que la adición de un resto fluorescente grande en la parte terminal de la proteína puede hacer que no sea funcional, a menudo es más deseable generar reporteros de expresión específicos basados en un promotor que dirige la expresión de una construcción fluorescente. Esta proteína indicadora es exógeno al sistema celular y por lo tanto no influye en los eventos de señalización que están teniendo lugar en la célula.
Tanto la microscopía y citometría de flujo han sido ampliamente utilizados en el campo de la señalización de la levadura. Como ejemplos, los compañeros de trabajo-Colman Lerner y correlacionados, en celdas individuales, la expresión de apareamiento periodistas específicos y constitutivamente expresadas por microscopía de cuantificar el ruido en el apareamiento de levadura de transducción de señales en cascada 5, Acar y sus colegas utilizaron citometría de flujo para el estudio de la red de regulación el control de la expresión de los genes GAL 6. En un estudio anterior 7, hemos utilizado un combinatien una de estas dos técnicas para estudiar la salida de la expresión de la alta osmolaridad de glicerol (HOG) y la vía de levadura en ciernes. Esta proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) es provocada por el estrés hiper-osmótica. Es el resultado de la activación de las MAPK Hog1, que se transloca al núcleo de la célula para inducir un programa transcripcional que resulta en la expresión de aproximadamente 300 genes. Para estudiar este proceso, habíamos diseñado un reportero de expresión basado en el promotor STL1 (un gen inducido específicamente en respuesta a la actividad Hog1 8) que dirige la expresión de una proteína fluorescente Venus cuádruple (p STL1-qV). La citometría de flujo mediciones revelaron la presencia de dos poblaciones de células en el nivel de la tensión intermedia (NaCl 0,1 M) con sólo una fracción de la población que expresa el indicador fluorescente. Se utilizó microscopía de investigar más a fondo este comportamiento y descubrimos que este ruido en la expresión de proteínas se rige por factores intrínsecos 9. Nos COUld observan, además, que las células con un nivel similar de actividad Hog1 podrían mostrar resultados sorprendentemente diferentes de expresión. La combinación de estas dos técnicas nos ha permitido demostrar cómo la lenta remodelación de genes de respuesta al estrés influyó en el resultado de expresión a nivel de células individuales 7.
En este trabajo, utilizamos la expresión de la p-STL1 qV reportero inducida por choque hiper-osmótica como un ejemplo de la cuantificación de la expresión de proteínas por microscopía y citometría de flujo. La misma cepa sometida a estrés 0,2 M de NaCl se estudió con ambas técnicas. Esto nos permitirá poner de relieve algunas diferencias clave en estas dos técnicas altamente complementarias.
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Protocol
1. Medidas de Microscopía
- Inocular 5 ml de medio sintético con levadura.
- Se cultivan las células a 30 º C durante la noche.
- Mida la OD 600 de la cultura de la noche a la mañana siguiente.
- Diluir la cultura durante la noche en 5 ml de medio sintético a OD 600 0.05.
- Mantener el cultivo diluido a 30 ° C durante al menos 4 horas.
- Preparar 3 veces concentrado (0,6 M) una solución de NaCl en medio sintético.
- Preparar una solución de 1 mg / ml de Concanavalina A (ConA) en PBS.
- Filtrado ~ 200 l de solución de ConA en la diapositiva también.
- Deje reposar durante 30 min.
- Retire la solución ConA.
- Añadir 150 l de H 2 O al pozo.
- Retire H 2 O.
- Mida OD 600 de cultivo celular.
- Preparar 300 l de cultivo celular a OD 600 = 0,02 en un microtubo de 1.5 ml.
- Sonicar las células en un baño de agua durante 45 segundos.
- Vortex brevemente la microtube.
- Sonicar las células en un baño de agua durante 45 segundos.
- Vortex brevemente el microtubo.
- Añadir 200 l de cultivo celular para el pozo.
- Espere 30 minutos para dejar que las células se depositan en el fondo del pozo.
- Situar el porta bien en el microscopio.
- Seleccione los ajustes de iluminación para el canal de fluorescencia a grabar.
- Seleccionar los ajustes de iluminación para dos imágenes de campo claro (uno ligeramente fuera de foco: 3 micras por debajo del plano focal para permitir una segmentación adecuada de las células).
- Seleccione los intervalos de tiempo para la medición del tiempo-lapso
- Seleccione los campos de visión de la imagen.
- Iniciar la adquisición de una serie de imágenes.
- Pausa la adquisición de añadir los 100 l de 0,6 M NaCl medio.
- Reanudar la proyección de imagen.
2. Citometría de Flujo Medidas
- Inocular 5 ml de medio sintético con levadura.
- Haga crecer a 30 º C durante la noche.
- Medidael OD 600 de la cultura de la noche a la mañana siguiente.
- Diluir la cultura durante la noche en 5 ml de medio sintético a OD 600 0.1.
- Crece a 30 ° C durante al menos 4 horas para llegar a un OD 600 de 0,2 a 0,4.
- Preparar la solución de cicloheximida 1 mg / ml en H 2 O.
- Preparar 3 veces concentrado (0,6 M) una solución de NaCl en medio sintético.
- Preparar un microtubo de 1,5 ml con 100 l de 0,6 M NaCl medio para cada punto de tiempo para ser medidos.
- En el tiempo 0, añadir 200 l de cultivo celular a cada microtubo.
- Incubar con agitación a 30 ° C.
- En el momento T, añadir 30 l de cicloheximida a un microtubo.
- Repita paso 2,11 para todos los puntos de tiempo deseados.
- Incubar todos los microtubos durante al menos 45 min y hasta 3 horas a 30 º C con agitación.
- Preparar tubos de FACS con 400 l de PBS.
- Sonicar las células en baño de agua durante 1 min.
- Vortex brevemente los microtubos.
- Hijoicar las células en baño de agua durante 1 min.
- Vortex brevemente los microtubos.
- Añadir 100 l de cultivo celular de cada microtubo a su correspondiente tubo de FACS.
- Seleccione el láser de excitación 488 nm y 530/30 nm de paso de banda de filtro para la detección.
- Prueba de que no expresa y expresar plenamente la muestra para verificar si se caen en el rango de sensibilidad del detector.
- Medir 10.000 células para cada muestra adquirida.
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Representative Results
Microscopía
Las células de levadura que llevan el reportero de la expresión de P-STL1 qV (ySP9 7) se adjunta a la parte inferior del pozo-portaobjetos y se coloca bajo el microscopio. Las células se estimularon mediante la adición de medio de estrés directamente en el pozo durante el curso de la sesión de formación de imágenes. Esto nos permite adquirir unas pocas imágenes de las células antes de la inducción vía y seguir su destino después de la estimulación. En el presente caso, las células fueron seguidos durante ~ 2 horas con un intervalo de tiempo de 10 min. Figura 1A es una imagen de las células no fluorescentes antes de la inducción y la Figura 1B muestra las mismas células 2 horas después de la tensión cuando el reportero expresión tiene sido inducida y se ha convertido en fluorescente.
Para extraer la información cuantitativa presente en estas imágenes, un proceso de análisis de imagen compleja tiene que ser realizado. Se incluye la segmentación de las células para definir objetos en el imago, el seguimiento de estos objetos de una trama a la siguiente y las mediciones de las características de estos objetos (forma y la intensidad propiedades). Hemos desarrollado nuestra propia plataforma llamada YeastQuant para realizar este análisis 10. Algunos otros softwares no comerciales están disponibles para realizar estas tareas:. CellProfiler 11, 12 o cellid CellX 13 Figura 1C muestra los resultados de un análisis realizado con YeastQuant. Cada traza de color rojo representa la evolución temporal de la intensidad media de fluorescencia de una sola célula. La línea azul muestra la mediana de más de 500 células que fueron segmentados y un seguimiento a lo largo de los 20 cuadros de cinco películas a intervalos adquiridos de cinco campos diferentes de las vistas desde el mismo pozo. El área de color azul claro representa el percentil 25 y 75 años de todas las intensidades medidas en un momento dado.
Citometría de Flujo
Para la citometría de flujo measurempadres, el cultivo celular se derramó en microtubos que contienen el medio de la tensión. Para estudiar la evolución temporal de la p STL1-qV expresión, la traducción se inhibió en diferentes puntos de tiempo (de 5 a intervalos de 10 min) con cicloheximida (Figura 2). Este medicamento bloquea la síntesis de nuevas proteínas, pero la maduración de la proteína fluorescente expresada ya no está perturbado. Por lo tanto, después de 45 minutos a una hora de incubación, las células se pueden medir en el citómetro de flujo que permite la cuantificación de la cantidad de proteína producida en el momento de la adición de cicloheximida. Esta estrategia evita el problema de la maduración de la proteína fluorescente y con ello se cuantifica la verdadera dinámica de la síntesis de proteínas fluorescentes.
La comparación de las dos técnicas
La Figura 3A compara la dinámica de la expresión de reportero medidos por microscopía y citometría de flujo. Mientras que la señal fluorescente comienza a subir 30-40min después de la tensión con la microscopía, las mediciones de citometría de flujo demuestra claramente que las proteínas ya se producen entre 10 a 15 minutos después del estímulo. Esta demora de media hora se debe a la lenta maduración de las proteínas fluorescentes 14. Aunque ambos métodos de cuantificar la intensidad de fluorescencia de las células, uno tiene que tener en cuenta que en este estudio, que no miden el mismo proceso biológico. Mientras, la microscopía sigue la aparición de la señal fluorescente, la citometría de flujo realmente cuantifica la síntesis de la proteína. Es fundamental tener en cuenta esta etapa de maduración al realizar imágenes de células vivas. En una situación en la que una proteína endógena se etiqueta con una proteína fluorescente, la proteína endógena se expresa y se activa antes de la fluorescencia de la etiqueta puede ser detectada.
Como se indicó anteriormente, las dos técnicas ofrecen información complementaria. La citometría de flujo puede medir un gran número de células muy rápidamente (10.000 o más). Por lo tanto, puede ofrecer conjuntos de datos estadísticamente ricos donde dos poblaciones superpuestas se puedan identificar o una serie de eventos raros se pueden observar. Microscopía proporciona información sobre un número limitado de células (del orden de 100). Sin embargo, debido a este conjunto de datos contiene información temporal y espacial y permite la correlación de las mediciones múltiples en la misma célula, puede ofrecer información de gran valor en el proceso biológico investigado.
Figura 1. Medición de la expresión del indicador por microscopía. A y B. Imágenes de células que llevan el fluorescente reportero expresión p STL1-qV antes (A) y 2 h después de la estimulación con NaCl 0,2 M (B). C. Evolución temporal de la gripe aparición orescence. Las curvas rojas representan la intensidad media de fluorescencia celular de algunos rastros de células individuales representativos. La curva azul representa la fluorescencia media de 550 huellas de una sola célula. El área de color azul claro representa el percentil 25 y 75 de la expresión fluorescente de la población de células en cada momento. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Medición de la expresión del indicador por citometría de flujo. Histogramas de la fluorescencia celular de células que llevan el fluorescente reportero expresión p STL1-qV tratada con NaCl 0,2 M y con cicloheximida inhibió en diferentes puntos de tiempo.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Comparación de la dinámica de expresión medidos por microscopía y citometría de flujo. A. Media de la intensidad de fluorescencia medida por citometría de flujo (línea continua) y microscopía (línea discontinua) como función del tiempo para tres réplicas biológicas. Las barras de error representan el error estándar de la media. B y C. Los histogramas de la intensidad de fluorescencia normalizada a 120 min después de la tensión para microscopía (B) y 60 min después de la tensión de la citometría de flujo (C) para las tres repeticiones. Haga clic aquí paraver la imagen más grande.
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Discussion
Microscopía
El tratamiento del pozo con ConA es un paso esencial para asegurar una imagen adecuada de las células. Debido a ConA tiene baja solubilidad en PBS (5 mg / ml), el proceso de filtración permite la eliminación de grandes agregados que están presentes en la solución sin filtrar y interfieren con la formación de imágenes. Las células se adhieren relativamente fuerte a la superficie tratada y la adición de la solución de la inducción no deben perturbar la localización de las células, lo que permite un seguimiento continuo antes y después del estímulo. Este tratamiento también se puede aplicar a fluir canales o dispositivos de microfluidos se las células se someten a un flujo constante de 7,15. Si el pozo no se enjuaga bien con agua después del tratamiento, las células no se adhieren adecuadamente al vidrio, presumiblemente debido a la ConA en solución se une directamente a las células y se les impide para formar una fuerte unión a la superficie del vidrio. Después de la etapa de lavado, el pozo puede permanecer seco durante 3 -4 horas antes de la adición de las células sin afectar notablemente la unión de las células al vidrio.
La selección del tiempo de exposición para el canal fluorescente es un entorno crítico para el éxito del experimento. Dado que la fluorescencia de la célula aumentará a lo largo del lapso de tiempo, es importante para poner a prueba de antemano con una muestra inducida por lo que es el tiempo de exposición máxima que se puede utilizar para evitar la saturación de las imágenes durante la adquisición. Otro parámetro a tener en cuenta a la hora de seleccionar el tiempo de exposición es el blanqueo de la señal fluorescente. Para cada muestra, se debe encontrar un equilibrio entre el brillo de la imagen y de la degradación de la señal debido a la decoloración durante el lapso de tiempo. El intervalo de tiempo entre cada adquisición también influye fuertemente en el blanqueo del fluoróforo. Dado que la expresión de proteínas es un proceso relativamente lento, por lo general utilizamos 10-15 min. intervalos. Si otros procesos más rápidos necesitan ser followed en paralelo a la expresión de la proteína, puede ser aconsejable usar diferentes intervalos de tiempo a través de toda la película de lapso de tiempo (1-2 min al inicio y 5-15 min para las adquisiciones posteriores).
El control de la densidad celular es un parámetro crucial para tener en cuenta. Si la densidad es demasiado baja, sólo unas pocas células estarán presentes en cada campo de visión que resulta en las estadísticas pobres para el conjunto de datos. Sin embargo, si la densidad es demasiado alta, puede amenazar la segmentación, el seguimiento y la cuantificación de las células, lo que hace difícil extraer la información deseada de las imágenes. Para determinar la densidad de siembra, un parámetro adicional a tener en cuenta es la duración del experimento. Si un experimento tiene una duración de varios ciclos de división, es aconsejable comenzar con un campo de vista escasa que llenará gradualmente durante el curso del tiempo de la formación de imágenes debido a la división de las células y estableciéndose de las células en solución. En el protocolo, se sugiere el uso deun OD 600 de 0,02, dependiendo del tipo de experimento que realizamos utilizamos OD 600 de 0,05 para películas a intervalos cortos a 0.005 para las más largas.
El número de células analizadas es claramente un parámetro clave para la validez del experimento. A veces tan sólo 20 a 30 células se combinan para generar un conjunto de datos. Sin embargo, para empezar a tener datos estadísticamente significativos, un centenar de células o más son probablemente necesarias. El aumento del objetivo determina el tamaño del área de la imagen y por lo tanto el número de células de imágenes. Para las mediciones de expresión de proteínas, donde el objetivo es medir la fluorescencia media de la celda, un alto objetivo de inmersión 40X apertura numérica es la mejor solución que proporciona tanto buena relación señal a ruido y un gran campo de visión. Si las estructuras sub-celulares tienen que ser analizados, mayores aumentos (60X o 100X objetivos) a menudo son necesarios, lo que resulta en la medición de un menor número de células. El advenimiento de la OCMCámaras de S con un tamaño detector de casi cuatro veces más grande que la de CCD convencional es claramente una ventaja para obtener más células por campo de visión.
Con un XY-etapa motorizada, es posible a la imagen en múltiples campos paralelos de vista de aumentar el número de células en el conjunto final de datos. Sin embargo, existe un trade-off entre el número de posiciones XY visitados y la velocidad de la adquisición de la imagen. Dependiendo de la velocidad de la etapa y el número de iluminaciones grabadas, normalmente es factible imagen diez posiciones en menos de un minuto. Para cuantificar los eventos de señalización rápidas, esto puede convertirse en un factor limitante. Para las mediciones de expresión de proteínas, donde los cambios de fluorescencia suceden en una escala de tiempo más lento, por lo general no es una limitación. Alternativamente, debido a que estos experimentos de expresión duran unos pocos horas y debido a la lenta resolución temporal requerida, se vuelve ventajoso imagen múltiples muestras en paralelo. Pozos vecinos múltiples can puede sembrar con células de tipo salvaje y mutantes, diferentes estímulos se puede aplicar a cada pocillo o réplicas biológicas puede ser medido en paralelo. Escaneo a través de todos los pocillos de una placa de 96 pocillos se logra de forma rutinaria con objetivo de aire para pantallas de microscopía 16. Debido a la baja abundancia de proteínas endógenas en la levadura, su cuantificación requiere un objetivo de aceite con alta apertura numérica. Esto limita seriamente el alcance que se puede recorrer con el objetivo. No obstante, nos rutinariamente imagen cuatro pozos vecinos por permanecer cerca de su esquina común. Sin embargo, es más difícil para una imagen de mayor número de pozos. Objetivos de agua con dispensadores automáticos pueden eludir este problema, a expensas de una pérdida menor en el brillo.
La citometría de flujo
Recopilación de un número suficiente de células no es un problema con los citómetros de flujo. Típicamente 10.000-100.000 células se pueden adquirir en un minuto. Sin embargo, como no hay imagen de tél celular se adquiere, es importante seleccionar adecuadamente la población celular a analizar. Supresión de las células sobre la base de las dispersiones secundarios medidos hacia adelante y puede permitir para seleccionar células individuales en lugar de grupos de células y para eliminar los residuos celulares del análisis. En la figura 2, cada histograma representa una población de aproximadamente 5.000 células, que fueron seleccionados en base a sus propiedades de dispersión de los 10.000 eventos medidos.
Al romper grupos de células en células individuales, la sonicación del cultivo celular es una forma adicional de mejorar la calidad de los datos adquiridos. Esto es válido para la microscopía donde grupos de células pueden ser muy difíciles de segmento correctamente. La duración de este paso tiene que ser probado experimentalmente. Por lo general, realizamos dos rondas de sonicación en un baño de agua de 30 segundos a un minuto seguido por agitación de la suspensión celular. Sonicación prolongada puede resultar en la lisis de algunas células. Sin embargo, no lo hicimos oBSERVAR una sobre regulación de genes de respuesta de estrés debido a esta etapa experimental. Tenga en cuenta que la agregación de las células es un fondo fenotipo dependiente de, por ejemplo, células W303 muestran una tendencia más fuerte a agregarse que las células S288C.
La variabilidad en las mediciones de células individuales
En la figura 3A, se traza la media y el error estándar de tres experimentos independientes realizados por citometría de flujo y microscopía. Las diferencias menores entre las tres curvas surgen del hecho de que los errores experimentales son relativamente pequeñas para estas mediciones simples y que muchas células se miden (más de 5000 para citometría de flujo, entre 370-550 para microscopía). La evolución temporal de las curvas de microscopía es más suave que la de los datos de citometría de flujo. Una razón probable de este comportamiento es el proceso de preparación de la muestra. Para la microscopía, todos los puntos de tiempo en un experimento resultan de la misma evento de estrés, mientras que parala FACS, la muestra para cada punto de tiempo se destacó de forma individual. Las pequeñas variaciones en el volumen de las soluciones de estrés y de cultivo pueden dar lugar a una pequeña diferencia en la salida de la expresión génica. Una estrategia alternativa sería hacer hincapié en 5 ml de cultivo de células y eliminar partes alícuotas en los momentos deseados para inhibir con cicloheximida. Ambos métodos funcionan bien, se utiliza el método de preparación de microtubos, ya que ofrece una mayor flexibilidad y también está bien adaptado para las mediciones de las curvas de dosis-respuesta que múltiples concentraciones de NaCl tienen que medirse en paralelo.
El bajo nivel de ruido en estas curvas promediadas sin embargo no refleja toda la gama de la variabilidad presente en el nivel de células individuales. En la Figura 3B y 3C, los histogramas de la expresión medidos por microscopía y citometría de flujo en un solo punto de tiempo se representan gráficamente. Estos dos paneles ilustran bien el hecho de que las variaciones técnicas entre las réplicas son relativamente pequeñas, especially en comparación con la gran variabilidad observada en la expresión de células individuales. La diferencia en las formas de la distribución entre la microscopía y la citometría de flujo mediciones surge del hecho de que con citometría de flujo la intensidad celular total se cuantifica mientras que en las imágenes de microscopía se calculó la intensidad celular promedio. Este último promedios de medición las variaciones en el tamaño celular y por lo tanto resulta en distribuciones más estrechas.
Las dos técnicas presentadas aquí permiten estudiar cuantitativamente el comportamiento de las células individuales. Esta característica suele estar escondido en las mediciones biológicas tradicionales realizadas a nivel de población. La comprensión de cómo la variabilidad en la respuesta de las células individuales emerge puede ofrecer importantes conocimientos sobre la compleja regulación de procesos biológicos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Matthias Peter y su grupo en el Instituto de Bioquímica de la ETH en Zürich, donde se han desarrollado estos métodos. Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 | |
References
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