Summary
يتم عرض طريقتين التكميلية على أساس التدفق الخلوي والمجهري الذي تمكن من القياس الكمي، على مستوى خلية واحدة، لديناميات التعبير الجيني الناجم عن تفعيل مسار MAPK في الخميرة.
Abstract
الكمي في التعبير الجيني على مستوى خلية واحدة تكشف آليات تنظيمية الرواية تحجب في قياسات أجريت على مستوى السكان. يتم عرض طريقتين على أساس المجهري والتدفق الخلوي لشرح كيفية يمكن الحصول على هذه البيانات. ويستخدم تعبير مراسل الفلورسنت التي يسببها على تفعيل الأسمولية عالية الجلسرين MAPK المسار في الخميرة كمثال على ذلك. ويسلط الضوء على المزايا المحددة لكل طريقة. التدفق الخلوي يقيس عدد كبير من الخلايا (10،000) ويوفر مقياسا مباشرا لديناميات البروتين التعبير مستقلة عن حركية النضج البطيء للبروتين فلوري. التصوير من الخلايا الحية بواسطة المجهر هو على النقيض من ذلك تقتصر على قياس شكل نضجت لمراسل في خلايا أقل. ومع ذلك، يمكن للمجموعات البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذه التقنية أن تكون غنية للغاية وذلك بفضل لمجموعات من الصحفيين ومتعددة للمعلومات المكانية والزمانيةتم الحصول عليها من الخلايا الفردية. يمكن الجمع بين هذه الطرق قياس اثنين تقديم رؤى جديدة بشأن تنظيم بروتين تعبير عن طريق مسارات الإشارات.
Introduction
إشارة عبر أجهزة الطرد المركزي تنبيغ غالبا ما يتوج في التعبير عن البروتينات. توصيف هذا الملف التعبير هي عنصر أساسي في فهم وظيفة المسارات البيولوجية. لا يمكن أن يتحقق تحديد الطيف من التنظيم حتى البروتينات وديناميات التنشيط من خلال تقنيات مختلفة مثل المصفوفات الدقيقة، البقع أو البقع شمال غرب 1-3. ومع ذلك، يبلغ متوسط هذه التقنيات الاستجابة شعب بأكمله من الخلايا. لفهم التنظيم غرامة من التعبير عن البروتينات، فمن المستحسن لجمع القياسات على مستوى خلية واحدة. من الناحية المثالية، ينبغي أن توفر هذه القياسات أيضا البيانات الكمية قابلة للتطوير النماذج الرياضية للمسار الأساسي.
المجهري والتدفق الخلوي هي اثنين من التقنيات، والتي هي مناسبة بشكل مثالي لتقديم مثل هذه القياسات وحيدة الخلية الكمي. وضع علامات الذاتية من البروتينات مع بروتين فلوري يمكن به تستخدم لقياس مستوى التعبير عنها 4. ومع ذلك، منذ إضافة شاردة الفلورسنت كبيرة في محطة من البروتين يمكن أن تجعل ذلك غير وظيفية، غالبا ما يكون أكثر من المرغوب فيه لتوليد صحفيين التعبير محددة تستند على المروج القيادة التعبير عن بناء الفلورسنت. هذا البروتين هو مراسل الخارجية لنظام الهاتف الخلوي، وبالتالي لا تؤثر على الأحداث يشير إلى أن تجري في الخلية.
كلا المجهري والتدفق الخلوي قد استخدمت على نطاق واسع في مجال الإشارات الخميرة. كأمثلة؛ كولمان، ليرنر وزملاء العمل المترابطة، في زنازين انفرادية، والتعبير عن التزاوج للصحفيين محددة وأعرب جوهري بواسطة المجهر لقياس الضوضاء في الخميرة التزاوج نقل الإشارة سلسلة 5، أكار وزملاؤه تستخدم التدفق الخلوي لدراسة الشبكة التنظيمية السيطرة على التعبير عن الجينات GAL 6. في دراسة سابقة 7، ونحن قد استخدمت تواليفعلى هذه التقنيات اثنين لدراسة الإخراج التعبير عن الأسمولية الجلسرين عالية (HOG) مسار في مهدها الخميرة. يتم تشغيل هذا mitogen تنشيط بروتين كيناز ([مبك]) الطريق بسبب الإجهاد المفرط الاسموزي. أنه يؤدي إلى تفعيل Hog1 MAPK التي translocates إلى نواة الخلية للحث على برنامج النسخي مما أدى إلى التعبير عن الجينات تقريبا 300. لدراسة هذه العملية، ونحن دبرت مراسل التعبير استنادا إلى المروج STL1 (الجينات المستحثة تحديدا ردا على النشاط Hog1 8) القيادة تعبير عن البروتين الفلوري الرباعي فينوس (ع STL1-QV). التدفق الخلوي القياسات كشفت وجود اثنين من السكان من الخلايا في مستوى التوتر المتوسط (0.1 M كلوريد الصوديوم) مع جزء فقط من السكان معربا عن مراسل الفلورسنت. استخدمنا المجهري لمزيد من التحقيق في هذا السلوك، واكتشفت أن هذا الضجيج في تعبير البروتين وتحكمها العوامل الجوهرية 9. نحن فصول التوجيه الجامعيمزيد دينار نلاحظ أن الخلايا مع مستوى مماثل من النشاط Hog1 يمكن عرض نتائج التعبير افت للنظر مختلفة. مزيج من هذه التقنيات اثنين سمح لنا لشرح كيفية إعادة عرض بطء الاستجابة للضغط النفسي الجينات أثرت على نتيجة التعبير على مستوى خلية واحدة 7.
في هذه الورقة، ونحن نستخدم تعبير ع مراسل STL1-QV الناجم عن صدمة شديدة الاسموزي كمثال على القياس الكمي للبروتين التعبير بواسطة المجهر والتدفق الخلوي. ودرس نفس السلالة تتعرض ل0.2 M كلوريد الصوديوم الإجهاد مع كل التقنيات. وهذا يسمح لنا لتسليط الضوء على بعض الاختلافات الرئيسية في هذين التقنيات التكميلية للغاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. المجهر القياسات
- تطعيم 5 مل من المتوسط الاصطناعية مع الخميرة.
- تنمو الخلايا عند 30 درجة مئوية خلال الليل.
- قياس OD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها في صباح اليوم التالي.
- تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة الاصطناعية لOD 600 0.05.
- تنمو ثقافة المخفف عند 30 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة.
- إعداد 3 أضعاف تتركز (0.6 M) كلوريد الصوديوم الحل في المتوسطة الاصطناعية.
- يعد حل 1 ملغ / مل من كونكانافالين A (كونا) في برنامج تلفزيوني.
- رشاحة ~ 200 ميكرولتر من الحل CONA في الشريحة جيدا.
- اسمحوا الوقوف لمدة 30 دقيقة.
- إزالة حل CONA.
- إضافة 150 ميكرولتر H 2 O إلى البئر.
- إزالة H 2 O.
- قياس OD 600 من ثقافة الخلية.
- إعداد 300 ميكرولتر من خلية ثقافة في OD 600 = 0.02 في 1.5 مل microtube.
- يصوتن الخلايا في حمام مائي لمدة 45 ثانية.
- دوامة لفترة وجيزة ميلcrotube.
- يصوتن الخلايا في حمام مائي لمدة 45 ثانية.
- دوامة لفترة وجيزة microtube.
- إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة الخلية إلى البئر.
- انتظر 30 دقيقة للسماح للخلايا تستقر في قاع البئر.
- وضع الشريحة على المجهر جيدا.
- حدد إعدادات الإضاءة الفلورسنت للقناة ليتم تسجيلها.
- حدد إعدادات الإضاءة لصورتين حقل مشرق (واحد قليلا من التركيز: 3 ميكرون أدناه البؤري للسماح لتجزئة السليم للخلايا).
- تحديد فترات زمنية لقياس الوقت الفاصل
- تحديد الحقول من أجل الصورة.
- بدء اقتناء عدد قليل من الإطارات.
- وقفة اقتناء لإضافة 100 ميكرولتر من 0.6 M كلوريد الصوديوم المتوسط.
- استئناف التصوير.
2. تدفق الخلوي القياسات
- تطعيم 5 مل من المتوسط الاصطناعية مع الخميرة.
- ينمو بمعدل 30 درجة مئوية خلال الليل.
- التدبيروOD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها في صباح اليوم التالي.
- تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة الاصطناعية لOD 600 0.1.
- ينمو بمعدل 30 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة للتوصل الى OD 600 من 0.2-0.4.
- إعداد الحل سيكلوهيكسيميد 1 ملغ / مل في H 2 O.
- إعداد 3 أضعاف تتركز (0.6 M) كلوريد الصوديوم الحل في المتوسطة الاصطناعية.
- إعداد واحد microtube 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من 0.6 M كلوريد الصوديوم المتوسطة لكل نقطة زمنية المراد قياسها.
- في الوقت 0، إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة الخلية إلى كل microtube.
- احتضان مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية.
- في الوقت T، إضافة 30 ميكرولتر سيكلوهيكسيميد إلى microtube.
- كرر الخطوة 2.11 لجميع النقاط الوقت المطلوب.
- احتضان جميع microtubes لمدة 45 دقيقة على الأقل وحتى 3 ساعة على 30 درجة مئوية مع الهز.
- إعداد أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية مع 400 ميكرولتر PBS.
- يصوتن الخلايا في حمام الماء لمدة 1 دقيقة.
- دوامة لفترة وجيزة microtubes.
- ابنicate الخلايا في حمام الماء لمدة 1 دقيقة.
- دوامة لفترة وجيزة microtubes.
- إضافة 100 ميكرولتر من خلية ثقافة كل microtube إلى المقابلة أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية لها.
- حدد 488 نانومتر ليزر الإثارة و530/30 نانومتر تصفية ممر الموجة للكشف.
- اختبار عدم التعبير عن ومعربا عن كامل عينة للتحقق مما إذا كانت تقع في نطاق حساسية كاشف.
- قياس 10،000 الخلايا لكل عينة المكتسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المجهر
كانت تعلق خلايا الخميرة تحمل مراسل التعبير ع STL1-QV (ySP9 7) إلى الجزء السفلي من الشريحة جيدا ووضعها تحت المجهر. وقد حفز الخلايا بإضافة التوتر المتوسط مباشرة في البئر أثناء الدورة التصوير. وهذا يسمح لنا للحصول على عدد قليل من الصور من قبل خلايا مسار الاستقراء والمتابعة مصيرهم بعد التحفيز. في هذه الحالة، وتلت الخلايا ل~ 2 ساعة مع فاصل زمني من 10 دقيقة. الشكل 1A هو صورة من الخلايا غير الفلورسنت قبل الاستقراء و1B الشكل يعرض نفسه خلايا 2 ساعة بعد الإجهاد عندما يكون المراسل التعبير تم يسببها وأصبح الفلورسنت.
لاستخراج المعلومات الكمية الموجودة في هذه الصور، وهي عملية تحليل الصور المعقدة لابد من القيام بها. أنه يتضمن تجزئة الخلايا لتحديد الكائنات في طبركه، وتتبع هذه الكائنات من إطار واحد إلى أخرى وقياسات ملامح هذه الكائنات (شكل وكثافة الخصائص). قمنا بتطوير منصة منطقتنا اسمه YeastQuant لأداء هذا التحليل 10. تتوفر لأداء هذه المهام بضعة برامج غير تجارية أخرى: CellProfiler 11، CellID 12 أو 13 CellX يعرض الشكل 1C نتائج تحليل يؤديها مع YeastQuant. يمثل كل أثر أحمر تطور الزمني للمتوسط كثافة مضان من خلية واحدة. يعرض الخط الأزرق وسيطة من أكثر من 500 الخلايا التي كانت مجزأة وتتبع في جميع أنحاء 20 لقطة من خمسة أفلام مرور الزمن اكتسبت من خمسة حقول مختلفة من وجهات النظر من نفس البئر. يمثل منطقة الضوء الأزرق المئين 25 و75 من كل شدة يقاس عند نقطة زمنية معينة.
تدفق الخلوي
لmeasurem التدفق الخلويالوالدان، وقد امتد ثقافة خلية في microtubes تحتوي على المتوسطة الإجهاد. لدراسة تطور الزمني للع STL1-QV التعبير، كانت تحول دون ترجمة في نقاط زمنية مختلفة (5-10 فترات دقيقة) مع سيكلوهيكسيميد (الشكل 2). كتل المخدرات وهذا ليس مضطرب تخليق بروتينات جديدة، ولكن نضوج بروتين فلوري أعرب بالفعل. لذلك، بعد 45 دقيقة إلى ساعة واحدة من الحضانة، والخلايا يمكن قياسها في تدفق عداد الكريات السماح الكمي لكمية البروتين أنتجت في وقت بالإضافة سيكلوهيكسيميد. هذه الاستراتيجية تلتف مشكلة البروتين الفلوري النضج وبالتالي الكمي الديناميات الحقيقية لتخليق بروتين فلوري.
مقارنة بين الطريقتين
الرقم 3A يقارن ديناميات مراسل التعبير تقاس بواسطة المجهر والتدفق الخلوي. بينما يبدأ إشارة الفلورسنت في الارتفاع 30-40دقيقة بعد التوتر مع المجهري، وقياسات التدفق الخلوي تثبت بوضوح أن البروتينات يتم إنتاجها بالفعل بين 10 إلى 15 دقيقة بعد التحفيز. ويرجع ذلك إلى نضوج بطيئة من البروتينات الفلورية 14 هذا التأخير لمدة نصف ساعة. على الرغم من أن كلتا الطريقتين قياس كثافة فلوري من الخلايا، على المرء أن نضع في اعتبارنا أن في هذه الدراسة، فإنها لا قياس عملية بيولوجية نفسه. في حين، المجهري يلي الظهور للإشارة الفلورسنت، والتدفق الخلوي الكمي في الواقع توليف البروتين. فمن الضروري أن تأخذ في الاعتبار هذه الخطوة النضج عند تنفيذ التصوير الخلية الحية. في الحالة التي تكون فيها غير الموسومة البروتين الذاتية مع بروتين الفلورسنت، وسيتم التعبير البروتين الذاتية ونشطة قبل أن يتم الكشف عن مضان من علامة لها.
كما هو مبين أعلاه، سواء تقنيات تقديم معلومات تكميلية. التدفق الخلوي يمكن قياس عدد كبير من الخلايا بسرعة كبيرة (10،000 أو أكثر). وبالتالي فإنه يمكن تقديم مجموعات البيانات الغنية إحصائيا حيث يمكن التعرف على اثنين من السكان تداخل أو يمكن ملاحظة بعض الأحداث النادرة. يوفر المجهر المعلومات على عدد محدود من الخلايا (بناء على أمر من 100). ومع ذلك، لأن هذا مجموعة من البيانات تحتوي على معلومات الزمانية والمكانية ويسمح للارتباط قياسات متعددة في نفس الخلية، فإنه يمكن أن تقدم معلومات قيمة للغاية في عملية بيولوجية التحقيق.
الشكل 1. قياس مراسل التعبير بواسطة المجهر. ألف وباء. صور من الخلايا التي تحمل فلوري مراسل التعبير ع STL1-QV قبل (A) و 2 ساعة بعد التحفيز مع 0.2 M كلوريد الصوديوم (B). C. بالطبع وقت الانفلونزا orescence الظهور. المنحنيات الحمراء تمثل متوسط كثافة مضان الخلوية من عدد قليل من آثار ممثل خلية واحدة. يمثل المنحنى الأزرق مضان وسيطة من 550 آثار خلية واحدة. يمثل منطقة الضوء الأزرق المئين 25 و75 للتعبير الفلورسنت من السكان الخلية في كل نقطة زمنية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. قياس مراسل التعبير بواسطة التدفق الخلوي. المدرج الإحصائي من مضان من الخلايا الخلوية تحمل فلوري مراسل التعبير ع STL1-QV تعامل مع 0.2 M كلوريد الصوديوم، ويحول دون مع سيكلوهيكسيميد في نقاط زمنية مختلفة.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. مقارنة بين ديناميات التعبير تقاس بواسطة المجهر والتدفق الخلوي. A. متوسط كثافة مضان يقاس التدفق الخلوي (خط الصلبة) والمجهر (خط متقطع) وظيفة من الوقت لمدة ثلاثة مكررات البيولوجية. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. B و C. المدرج الإحصائي للتطبيع كثافة مضان في 120 دقيقة بعد الإجهاد للفحص المجهري (B) و 60 دقيقة بعد الإجهاد لالتدفق الخلوي (C) لمكررات الثلاثة. اضغط هنا لعرض صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المجهر
علاج بشكل جيد مع CONA هو خطوة أساسية لضمان التصوير السليم للخلايا. لأن CONA ديه قدرة منخفضة على الذوبان في برنامج تلفزيوني (5 ملغ / مل)، يسمح للعملية الترشيح إزالة الركام الكبيرة التي تكون موجودة في الحل غير المرشحة وتتداخل مع التصوير. خلايا إرفاق بقوة نسبيا على السطح المعالجة وإضافة الحل حمل يجب عدم إزعاج توطين الخلايا، والسماح لتتبع مستمر قبل وبعد التحفيز. ويمكن أيضا أن هذا العلاج يتم تطبيقها على تدفق قنوات أو الأجهزة ميكروفلويديك كانت تتعرض الخلايا إلى 7،15 تدفق مستمر. إذا لم يتم بشكل صحيح تشطف جيدا بالماء بعد العلاج، فإن الخلايا لا تلتزم بشكل صحيح على الزجاج، ويفترض لأن CONA في حل يربط مباشرة إلى الخلايا ويمنعها من تشكيل رابطة قوية على سطح الزجاج. بعد خطوة الغسيل، ويمكن أن البئر جافة تبقى لمدة 3 -4 ساعة قبل إضافة الخلايا دون التأثير بشكل ملحوظ الربط من الخلايا على الزجاج.
اختيار وقت التعرض للقناة الفلورسنت هو إعداد الحاسمة لنجاح التجربة. منذ مضان من الخلايا سوف تزيد في جميع أنحاء مرور الوقت، من المهم لاختبار مسبقا مع عينة بفعل ما هو زمن التعرض القصوى التي يمكن استخدامها لتجنب التشبع من الصور أثناء عملية الاستحواذ. معلمة أخرى أن تأخذ في الاعتبار عند اختيار وقت التعرض هو تبيض للإشارة الفلورسنت. لكل عينة، على المرء أن يجد مفاضلة بين سطوع الصورة وتدهور إشارة نظرا لتبيض خلال مرور الوقت. الفاصل الزمني بين كل اقتناء يؤثر أيضا بقوة تبيض من fluorophore. منذ البروتين التعبير هو عملية بطيئة نسبيا، ونحن عادة استخدام 10-15 دقيقة. فترات. إذا كان بحاجة إلى عمليات أخرى لتكون أسرع وollowed بالتوازي مع التعبير البروتين، قد يكون من المستحسن استخدام الخطوات زمنية مختلفة في كل أنحاء فيلم الوقت الفاصل بين (1-2 دقيقة في البداية و5-15 دقيقة لعمليات استحواذ في وقت لاحق).
السيطرة على كثافة الخلية هي معلمة حاسمة لتأخذ بعين الاعتبار. إذا كانت كثافة منخفضة جدا، وليس هذا فقط عدد قليل من الخلايا تكون موجودة في كل مجال الرؤية مما أدى إلى إحصاءات الفقراء لمجموعة البيانات. ومع ذلك، إذا كانت كثافة عالية جدا، قد تعيق تجزئة، وتتبع وتقدير حجم الخلايا، مما يجعل من الصعب استخراج المعلومات المطلوبة من الصور. لتحديد كثافة البذر، واحدة معلمة إضافية إلى أن تأخذ في الاعتبار هي مدة التجربة. إذا يستمر تجربة لدورات متعددة الانقسام، فمن المستحسن أن تبدأ مع حقل متفرق النظر التي سوف تملأ تدريجيا أثناء وقت التصوير بسبب انقسام الخلايا ويستقر من الخلايا في الحل. في البروتوكول، نقترح استخداموOD 600 من 0.02، وهذا يتوقف على نوع من التجربة ونحن أداء نستخدم OD 600 من 0.05 للأفلام الوقت الفاصل بين القصير إلى 0.005 لفترة أطول منها.
عدد الخلايا تحليلها ومن الواضح أن المعلمة الرئيسية للصحة التجربة. أحيانا يتم الجمع بين عدد قليل من 20-30 الخلايا لتوليد بيانات واحدة. ولكن، لتبدأ بعد مجموعات البيانات ذات دلالة إحصائية، ومئات من الخلايا أو أكثر ضرورية على الأرجح. التكبير الهدف يحدد حجم المنطقة التي جرى تصويرها، وبالتالي عدد الخلايا المصورة. لقياس التعبير البروتين، حيث كان الهدف هو قياس متوسط مضان من الخلايا، وهي الفتحة العددية 40X الهدف عالية الغمر هو الحل الأفضل وتوفير كل إشارة جيدة إلى نسبة الضوضاء وحقل كبير من الرأي. إذا الهياكل الفرعية الخلوية يتعين تحليلها، أعلى تكبير (60X أو 100X أهداف) وغالبا ما تكون ضرورية، مما أدى إلى قياس خلايا أقل. ظهور sCMOكاميرات S مع حجم كاشف تقريبا أربع مرات أكبر من واحد من CCD التقليدية بشكل واضح ميزة للحصول على المزيد من الخلايا في مجال الرؤية.
مع مرحلة XY بمحركات، فمن الممكن أن الصورة في حقول متعددة موازية من أجل زيادة عدد الخلايا في ورقة العمل النهائية. ومع ذلك، هناك مفاضلة بين عدد من المناصب XY زار وسرعة الحصول على الصور. اعتمادا على سرعة المرحلة وعدد إضاءات سجلت، فمن الممكن عادة لصورة عشرة مناصب في أقل من دقيقة. لتحديد الأحداث إشارات سريعة، وهذا يمكن أن تصبح عاملا مقيدا. لقياس التعبير البروتين، حيث يحدث تغييرات على نطاق ومضان الوقت أبطأ، فإنه عادة ما لا وجود قيود. بدلا من ذلك، لأن هذه التجارب التعبير تستمر لبضع ساعات وبسبب القرار الزماني بطيئة المطلوبة، يصبح من المفيد أن العديد من الصور عينات بشكل متواز. كاليفورنيا الآبار المجاورة متعددةن يكون المصنف مع نوع البرية والخلايا الطافرة، التحفيز مختلفة يمكن تطبيقها على كل بئر أو يمكن قياس مكررات البيولوجية بشكل متواز. المسح الضوئي من خلال جميع الآبار من 96 لوحة جيدا ويتحقق الهدف بشكل روتيني مع الهواء لشاشات المجهري 16. بسبب وفرة منخفضة من البروتينات الذاتية في الخميرة، ويتطلب تحديد قيمتها هدفا النفط مع الفتحة العددية عالية. هذا يحد بشدة من النطاق الذي يمكن سافر مع الهدف. مع ذلك نحن بشكل روتيني صورة أربعة آبار المجاورة من خلال البقاء على مقربة من الزاوية المشتركة. غير أنه أكثر تحديا لصورة عدد أكبر من الآبار. الأهداف الماء مع موزعات أوتوماتيكية قد تحايل على هذه المشكلة على حساب خسارة طفيفة في السطوع.
التدفق الخلوي
جمع عدد كاف من الخلايا ليست مشكلة مع أجهزة قياس التدفق الخلوي. عادة 10،000-100،000 الخلايا يمكن الحصول عليها في دقيقة واحدة. ومع ذلك، لأنه لا يوجد صورة طنوقال انه يتم الحصول على الخلايا، فمن المهم لتحديد بشكل صحيح السكان الخلية ليتم تحليلها. المعزولة من الخلايا استنادا إلى قياس إلى الأمام، ويفرق الجانب يمكن أن تسمح لتحديد الخلايا الفردية بدلا من مجموعات من الخلايا وإزالة الحطام الخلية من التحليل. في الشكل 2، يمثل كل رسم بياني يبلغ عدد سكانها ما يقرب من 5،000 الخلايا، والتي تم اختيارها استنادا على خصائص نثر من الأحداث 10،000 قياسها.
عن طريق كسر مجموعات من الخلايا في الخلايا الفردية، صوتنة للثقافة الخلية هو وسيلة إضافية لتحسين جودة البيانات المكتسبة. هذا ينطبق على المجهري حيث مجموعات من الخلايا يمكن أن يكون من الصعب جدا أن الجزء بشكل صحيح. مدة هذه الخطوة لابد من اختبارها تجريبيا. نحن عادة إجراء جولتين من صوتنة في حمام مائي لمدة 30 ثانية إلى دقيقة تليها vortexing لمن التعليق الخلية. صوتنة لفترات طويلة يمكن أن يؤدي إلى تحلل من عدد قليل من الخلايا. ومع ذلك، ونحن لم سbserve لتنظيم ما يصل الإجهاد الجينات استجابة بسبب هذه الخطوة التجريبية. لاحظ أن تجميع الخلايا هو النمط الظاهري تعتمد الخلفية، لعرض المثال خلايا W303 نزعة أقوى لتجميع الخلايا من S288C.
التباين في القياسات خلية واحدة
في الشكل 3A، يتم رسم المتوسط والخطأ المعياري لثلاث تجارب مستقلة يؤديها التدفق الخلوي والمجهري. تنشأ الفروق الطفيفة بين منحنيات ثلاثة من حقيقة أن الأخطاء التجريبية صغيرة نسبيا لهذه القياسات بسيطة والتي يتم قياسها العديد من الخلايا (أكثر من 5،000 لالتدفق الخلوي، وبين 370-550 للفحص المجهري). تطور الزمني للمنحنيات المجهري هو أكثر سلاسة من واحدة من البيانات التدفق الخلوي. أحد الأسباب المحتملة لهذا السلوك هو عملية إعداد العينة. للفحص المجهري، وجميع النقاط مرة في تجربة تنجم عن حالة الإجهاد نفسها، في حين أن لونظام مراقبة الأصول الميدانية، وشدد على عينة لكل نقطة زمنية على حدة. الاختلافات الصغيرة في حجم الضغط والثقافة حلول يمكن أن تؤدي إلى اختلاف صغير في إخراج التعبير الجيني. أن تكون استراتيجية واحدة بديلة لأؤكد 5 مل من ثقافة الخلايا وإزالة مأخوذة في الأوقات المرجوة لكبح لهم سيكلوهيكسيميد. كلتا الطريقتين تعمل بشكل جيد، ونحن نستخدم طريقة إعداد microtube لأنها توفر المزيد من المرونة وأيضا مناسبة تماما لقياسات منحنيات الاستجابة للجرعة حيث لديهم تركيزات كلوريد الصوديوم متعددة ليتم قياسها بشكل متواز.
انخفاض مستوى الضجيج في هذه المنحنيات متوسط ومع ذلك لا يعكس النطاق الكامل من التقلبات الحالية على مستوى خلية واحدة. في يتم رسم الشكل 3B و 3C، ورسوم بيانية للتعبير قياسها بواسطة المجهر والتدفق الخلوي في نقطة زمنية واحدة. توضيح هذه الفريقين جيدا حقيقة أن الاختلافات التقنية بين مكررات هي صغيرة نسبيا، ولا سيمially بالمقارنة مع التقلبات الكبيرة التي لوحظت في التعبير عن الخلايا الفردية. الفرق في أشكال التوزيع بين المجهر والتدفق الخلوي القياسات ينبع من حقيقة أنه مع التدفق الخلوي مجموع كثافة الخلوية وكميا بينما في الصور المجهري تم حساب متوسط الكثافة الخلوية. هذه المتوسطات القياس الأخير من الاختلافات في حجم الخلية، وبالتالي يؤدي إلى توزيع أضيق.
الطريقتين المقدمة هنا تسمح لدراسة كميا سلوك الخلايا واحد. يتم إخفاء هذه الميزة عادة في القياسات البيولوجية التقليدية أجريت على مستوى السكان. يمكن فهم كيف أن التباين في استجابة الخلايا الفردية يظهر تقدم معلومات هامة عن تنظيم معقدة من العمليات البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر ماتياس بطرس وجماعته في معهد الكيمياء الحيوية في ETH في زيوريخ حيث تم تطوير هذه الأساليب. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 | |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
