Summary
फ्लो और माइक्रोस्कोपी पर आधारित दो पूरक तरीकों खमीर में एक MAPK मार्ग की सक्रियता से प्रेरित जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता की एकल कोशिका के स्तर पर मात्रा का ठहराव, जो सक्षम प्रस्तुत कर रहे हैं.
Abstract
एकल कोशिका के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव जनसंख्या के स्तर पर प्रदर्शन माप में छिप उपन्यास नियामक तंत्र uncovers. दो तरीकों माइक्रोस्कोपी पर आधारित है और प्रवाह cytometry इस तरह के डेटा का अधिग्रहण किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. खमीर में उच्च परासारिता ग्लिसरॉल MAPK मार्ग के सक्रियण पर प्रेरित एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. प्रत्येक विधि के विशिष्ट लाभ डाला जाता है. Cytometry कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या (10,000) उपायों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की धीमी परिपक्वता कैनेटीक्स की स्वतंत्र प्रोटीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता का एक सीधा उपाय प्रदान प्रवाह. माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग कम कोशिकाओं में रिपोर्टर के परिपक्व फार्म की माप के लिए सीमित इसके विपरीत है. हालांकि, इस तकनीक द्वारा उत्पन्न डेटा सेट कई पत्रकारों का संयोजन करने के लिए और स्थानिक और लौकिक जानकारी के लिए अत्यंत समृद्ध धन्यवाद किया जा सकता हैव्यक्ति की कोशिकाओं से प्राप्त की. इन दो माप तरीकों का संयोजन संकेत दे रास्ते से प्रोटीन अभिव्यक्ति के नियमन पर नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
Introduction
पारगमन Cascades के माध्यम से संकेत अक्सर प्रोटीन की अभिव्यक्ति में खत्म. इस अभिव्यक्ति प्रोफाइल के लक्षण वर्णन जैविक रास्ते के समारोह को समझने में एक महत्वपूर्ण तत्व है. विनियमित प्रोटीन और उनके सक्रियण की गतिशीलता के स्पेक्ट्रम की पहचान ऐसे सूक्ष्म सरणियों, उत्तरी blots या पश्चिमी blots 1-3 के रूप में विभिन्न तकनीकों के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, इन तकनीकों कोशिकाओं की एक पूरी आबादी की प्रतिक्रिया औसत. प्रोटीन की अभिव्यक्ति के ठीक विनियमन समझने के लिए, यह एकल कोशिका के स्तर पर माप इकट्ठा करने के लिए वांछनीय है. आदर्श रूप में, इन मापों भी अंतर्निहित मार्ग के गणितीय मॉडल विकसित करने के लिए उत्तरदायी मात्रात्मक डेटा प्रदान करना चाहिए.
माइक्रोस्कोपी और फ्लो आदर्श मात्रात्मक एकल कक्ष माप देने के लिए अनुकूल हैं, जो दो तकनीकों हैं. एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ प्रोटीन की अंतर्जात टैगिंग कर सकते हैं खई उनकी अभिव्यक्ति के स्तर 4 यों इस्तेमाल किया. प्रोटीन की टर्मिनस पर एक बड़ा फ्लोरोसेंट आधा भाग के अलावा गैर कार्यात्मक इसे प्रस्तुत कर सकते हैं हालांकि, बाद से, यह एक फ्लोरोसेंट निर्माण की अभिव्यक्ति ड्राइविंग एक प्रमोटर के आधार पर विशिष्ट अभिव्यक्ति संवाददाताओं से उत्पन्न करने के लिए अक्सर अधिक वांछनीय है. इस संवाददाता प्रोटीन सेलुलर प्रणाली को एक्सोजेनस है और इसलिए सेल में जगह ले जा रहे हैं कि संकेत घटनाओं को प्रभावित नहीं करता है.
माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry दोनों व्यापक रूप से खमीर संकेतन क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के रूप में, Colman-लर्नर और सह कार्यकर्ता सहसंबद्ध, एकल कक्षों में, खमीर संभोग संकेत पारगमन झरना 5 में शोर यों तो माइक्रोस्कोपी द्वारा विशिष्ट और रचनात्मक रूप में व्यक्त संवाददाताओं से संभोग की अभिव्यक्ति, Acar और विनियामक नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए प्रवाह cytometry इस्तेमाल किया सहयोगियों लड़की जीन 6 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित. पिछले एक अध्ययन 7 में, हम एक combinati का इस्तेमाल किया हैउच्च परासारिता ग्लिसरॉल नवोदित खमीर में (हॉग) मार्ग से अभिव्यक्ति उत्पादन अध्ययन करने के लिए इन दो तकनीकों का पर. इस माइटोजन सक्रिय प्रोटीन kinase (MAPK) मार्ग अति आसमाटिक तनाव से शुरू हो रहा है. यह मोटे तौर पर 300 जीनों की अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप एक transcriptional कार्यक्रम को प्रेरित करने के लिए सेल के नाभिक को translocates जो MAPK Hog1, की सक्रियता का परिणाम है. इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, हम एक चौगुनी वीनस फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पी STL1-QV) की अभिव्यक्ति ड्राइविंग STL1 प्रमोटर (Hog1 गतिविधि 8 के जवाब में विशेष रूप से प्रेरित एक जीन) के आधार पर एक अभिव्यक्ति संवाददाता इंजीनियर था. माप फ्लोरोसेंट संवाददाता व्यक्त जनसंख्या का केवल एक अंश के साथ मध्यवर्ती तनाव स्तर (0.1 एम NaCl) में आबादी के दो कक्षों की उपस्थिति का पर्दाफाश प्रवाह cytometry. हम आगे इस व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी और प्रोटीन अभिव्यक्ति के इस शोर आंतरिक कारकों 9 द्वारा शासित था की खोज की. हम couएलडी आगे Hog1 गतिविधि का एक समान स्तर के साथ कोशिकाओं strikingly अलग अभिव्यक्ति के परिणामों को प्रदर्शित कर सकता है कि निरीक्षण करते हैं. इन दो तकनीकों का संयोजन हमें तनाव प्रतिक्रिया जीन की धीमी remodeling एकल कोशिका के स्तर 7 पर अभिव्यक्ति परिणाम प्रभावित कैसे प्रदर्शित करने की अनुमति दी.
इस पत्र में, हम माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव का एक उदाहरण के रूप में अति आसमाटिक सदमे से प्रेरित पी STL1-QV रिपोर्टर की अभिव्यक्ति का उपयोग करें और प्रवाह cytometry. 0.2 एम NaCl तनाव के अधीन ही तनाव दोनों तकनीकों के साथ अध्ययन किया गया था. यह हमें इन दो अत्यधिक पूरक तकनीक में कुछ महत्वपूर्ण मतभेदों को उजागर करने की अनुमति देगा.
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Protocol
1. माइक्रोस्कोपी माप
- खमीर के साथ सिंथेटिक माध्यम के 5 मिलीलीटर टीका लगाना.
- रातोंरात 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित.
- अगली सुबह रातोंरात संस्कृति के आयुध डिपो 600 उपाय.
- 600 0.05 आयुध डिपो 5 मिलीलीटर सिंथेटिक मध्यम में रातोंरात संस्कृति पतला.
- कम से कम 4 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर पतला संस्कृति बढ़ें.
- तैयार करें 3 गुना सिंथेटिक माध्यम में (0.6 मीटर) NaCl समाधान ध्यान केंद्रित किया.
- पीबीएस में concanavalin ए (Cona) के एक 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करें.
- छानना ~ अच्छी तरह से स्लाइड में Cona समाधान के 200 μl.
- 30 मिनट के लिए खड़े हैं.
- Cona समाधान निकालें.
- अच्छी तरह से करने के लिए 150 μl एच 2 हे जोड़ें.
- एच 2 ओ निकालें
- सेल संस्कृति के आयुध डिपो 600 उपाय.
- एक 1.5 एमएल microtube में 0.02 = 600 आयुध डिपो में सेल संस्कृति के 300 μl तैयार करें.
- 45 सेकंड के लिए एक पानी के स्नान में कोशिकाओं Sonicate.
- भंवर संक्षिप्त मीलcrotube.
- 45 सेकंड के लिए एक पानी के स्नान में कोशिकाओं Sonicate.
- संक्षेप में भंवर microtube.
- अच्छी तरह से करने के लिए सेल संस्कृति के 200 μl जोड़ें.
- कोशिकाओं को अच्छी तरह से नीचे के लिए व्यवस्थित जाने के लिए 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें.
- माइक्रोस्कोप पर अच्छी तरह से स्लाइड रखें.
- दर्ज किया जा फ्लोरोसेंट चैनल के लिए रोशनी सेटिंग का चयन करें.
- (: कक्षों की एक उचित विभाजन के लिए अनुमति देने के लिए केन्द्र विमान नीचे 3 माइक्रोन से थोड़ा ध्यान से बाहर एक) दो उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के लिए रोशनी सेटिंग का चयन करें.
- समय चूक माप के लिए समय अंतराल का चयन करें
- छवि को देखने के क्षेत्र का चयन करें.
- कुछ फ्रेम का अधिग्रहण शुरू.
- 0.6 एम NaCl माध्यम के 100 μl जोड़ने के लिए अधिग्रहण रोकें.
- इमेजिंग फिर से शुरू.
2. फ्लो माप
- खमीर के साथ सिंथेटिक माध्यम के 5 मिलीलीटर टीका लगाना.
- रातोंरात 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें.
- उपायआयुध डिपो रातोंरात संस्कृति की 600 अगली सुबह.
- 600 0.1 आयुध डिपो 5 मिलीलीटर सिंथेटिक मध्यम में रातोंरात संस्कृति पतला.
- एक आयुध डिपो 0.2-0.4 से 600 तक पहुंचने के लिए कम से कम 4 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें.
- एच 2 ओ में cycloheximide समाधान 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर की तैयारी
- तैयार करें 3 गुना सिंथेटिक माध्यम में (0.6 मीटर) NaCl समाधान ध्यान केंद्रित किया.
- मापा जा करने के लिए हर समय बिंदु के लिए 0.6 एम NaCl माध्यम के 100 μl के साथ एक 1.5 एमएल microtube तैयार करें.
- 0 समय, हर microtube के लिए सेल संस्कृति के 200 μl जोड़ें.
- 30 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ सेते
- समय टी में, एक microtube के लिए 30 μl cycloheximide जोड़ें.
- सभी वांछित समय अंक के लिए कदम 2.11 दोहराएँ.
- कम से कम 45 मिनट के लिए सभी microtubes सेते हैं और झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर सामने 3 घंटा.
- 400 μl पीबीएस के साथ FACS ट्यूबों तैयार करें.
- 1 मिनट के लिए पानी के स्नान में कोशिकाओं Sonicate.
- संक्षेप में भंवर microtubes.
- बेटा1 मिनट के लिए पानी के स्नान में कोशिकाओं icate.
- संक्षेप में भंवर microtubes.
- प्रत्येक microtube से अपनी इसी FACS ट्यूब 100 μl सेल संस्कृति जोड़ें.
- पता लगाने के लिए 488 एनएम उत्तेजना लेजर और 530/30 एनएम bandpass फिल्टर का चयन करें.
- टेस्ट गैर व्यक्त करने और पूरी तरह से वे डिटेक्टर संवेदनशीलता रेंज में गिर जाते हैं, तो सत्यापित करने के लिए नमूना व्यक्त.
- का अधिग्रहण प्रत्येक नमूने के लिए 10,000 कोशिकाओं उपाय.
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Representative Results
माइक्रोस्कोपी
अभिव्यक्ति संवाददाता पी STL1-QV (ySP9 7) असर खमीर कोशिकाओं अच्छी तरह से स्लाइड के नीचे से जुड़े और खुर्दबीन के नीचे रखा गया था. कोशिकाओं इमेजिंग सत्र के दौरान सीधे कुएं में तनाव मध्यम के अलावा द्वारा प्रेरित किया गया. यह हमें मार्ग प्रेरण से पहले कोशिकाओं के कुछ छवियों के अधिग्रहण और उत्तेजना के बाद उनके भाग्य का पालन करने के लिए अनुमति देता है. वर्तमान मामले में, कोशिकाओं 10 मिनट का समय अंतराल के साथ ~ 2 घंटे के लिए पीछा किया गया था. चित्रा 1 ए प्रेरण और चित्रा 1 बी पहले गैर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की एक छवि है अभिव्यक्ति रिपोर्टर है जब 2 घंटा तनाव के बाद ही कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है प्रेरित किया गया और फ्लोरोसेंट बन गया है.
इन छवियों में उपस्थित मात्रात्मक जानकारी निकालने के लिए, एक जटिल छवि विश्लेषण की प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जाना है. यह मैं में वस्तुओं को परिभाषित करने के लिए कोशिकाओं का विभाजन भी शामिल हैदाना, अगले एक फ्रेम से इन वस्तुओं की ट्रैकिंग और इन वस्तुओं (आकार और तीव्रता गुण) की सुविधाओं की माप. हम इस विश्लेषण के 10 प्रदर्शन करने YeastQuant नामित हमारे अपने मंच का विकास किया है. कुछ अन्य गैर वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर इन कार्यों को करने के लिए उपलब्ध हैं. CellProfiler 11, 12 या CellX 13 CellID चित्रा 1C YeastQuant के साथ प्रदर्शन एक विश्लेषण के परिणामों को प्रदर्शित करता है. प्रत्येक लाल ट्रेस एक एकल कक्ष की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के अस्थायी विकास का प्रतिनिधित्व करता है. ब्लू लाइन एक ही अच्छी तरह से विचार के पांच अलग अलग क्षेत्रों से प्राप्त कर लिया पाँच समय चूक फिल्मों के 20 तख्ते भर खंडों और ट्रैक किए गए थे, जो 500 से अधिक कक्षों का औसत प्रदर्शित करता है. हल्के नीले क्षेत्र एक निश्चित समय बिंदु पर मापा सभी तीव्रता की 25 वीं और 75 वीं प्रतिशतक का प्रतिनिधित्व करता है.
फ्लो
फ्लो measurem के लिएपिता, सेल संस्कृति तनाव मध्यम युक्त microtubes में गिरा दिया गया था. पी STL1-QV अभिव्यक्ति की अस्थायी विकास का अध्ययन, अनुवाद cycloheximide के साथ अलग अलग समय बिंदुओं (5 से 10 मिनट के अंतराल) (चित्रा 2) में हिचकते हैं. यह दवा ब्लॉकों नए प्रोटीन के संश्लेषण, लेकिन पहले से ही व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन की परिपक्वता परेशान नहीं है. इसलिए, ऊष्मायन के एक घंटे के लिए 45 मिनट के बाद, कोशिकाओं cycloheximide अलावा के समय में उत्पादित प्रोटीन की मात्रा की मात्रा का ठहराव की अनुमति प्रवाह cytometer में मापा जा सकता है. इस रणनीति फ्लोरोसेंट प्रोटीन परिपक्वता की समस्या में गतिरोध उत्पन्न करने और इस तरह फ्लोरोसेंट प्रोटीन संश्लेषण का सच गतिशीलता quantifies.
दो तकनीकों की तुलना
चित्रा 3A अभिव्यक्ति रिपोर्टर की गतिशीलता माइक्रोस्कोपी से मापा और प्रवाह cytometry तुलना. फ्लोरोसेंट संकेत 30-40 वृद्धि करने के लिए शुरू होता हैमिनट माइक्रोस्कोपी के साथ तनाव के बाद, फ्लो माप स्पष्ट रूप से प्रोटीन पहले से ही प्रोत्साहन के बाद 10 से 15 मिनट के बीच का उत्पादन कर रहे हैं कि साबित होते हैं. यह आधे घंटे देरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 14 की धीमी परिपक्वता की वजह से है. दोनों तरीकों कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता यों हालांकि, एक इस अध्ययन में, वे एक ही जैविक प्रक्रिया उपाय नहीं है कि ध्यान में रखना है. जबकि, माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट संकेत के प्रेत इस प्रकार है, फ्लो वास्तव में प्रोटीन संश्लेषण की quantifies. यह जीना सेल इमेजिंग प्रदर्शन जब इस खाते में परिपक्वता कदम उठाना आवश्यक है. अपनी टैग के प्रतिदीप्ति पता लगाया जा सकता से पहले एक अंतर्जात प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग है ऐसी स्थिति में, अंतर्जात प्रोटीन व्यक्त की और सक्रिय किया जाएगा.
ऊपर संकेत दिया है, दोनों तकनीकों पूरक जानकारी देने के लिए. (बहुत तेजी से कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या उपाय कर सकते हैं प्रवाह cytometry10,000 या अधिक). इसलिए यह दो अतिव्यापी आबादी की पहचान की जा सकती है या कुछ दुर्लभ घटनाओं मनाया जा सकता है, जहां सांख्यिकीय अमीर डेटा सेट वितरित कर सकते हैं. माइक्रोस्कोपी (100 के आदेश पर) कोशिकाओं की सीमित संख्या के बारे में जानकारी प्रदान करता है. इस डेटा सेट अस्थायी और स्थानिक जानकारी होती है और एक ही सेल में कई माप के सहसंबंध की अनुमति देता है, फिर भी, यह जांच की जैविक प्रक्रिया में अत्यधिक बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
चित्रा 1. माइक्रोस्कोपी द्वारा संवाददाता अभिव्यक्ति की माप. 0.2 एम NaCl (बी). सी के साथ उत्तेजना के बाद (ए) और 2 घंटा पहले फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति संवाददाता पी STL1-QV असर कोशिकाओं के ए और बी. छवियाँ. फ्लू के समय पाठ्यक्रम orescence प्रेत. लाल घटता कुछ प्रतिनिधि एकल कक्ष निशान के औसत सेलुलर प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं. नीले वक्र 550 एकल कक्ष निशान की औसत प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है. हल्के नीले क्षेत्र हर समय बिंदु पर सेल की आबादी का फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति की 25 वीं और 75 वीं प्रतिशतक का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. फ्लो ने संवाददाता अभिव्यक्ति की माप. अलग समय बिंदुओं पर 0.2 एम NaCl और cycloheximide साथ हिचकते साथ इलाज फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति संवाददाता पी STL1-QV असर कोशिकाओं के सेलुलर प्रतिदीप्ति की Histograms.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. माइक्रोस्कोपी से मापा और प्रवाह cytometry अभिव्यक्ति की गतिशीलता की तुलना. प्रतिदीप्ति तीव्रता के ए मीन तीन जैविक प्रतिकृति के लिए समय के समारोह के रूप में फ्लो (ठोस लाइन) और माइक्रोस्कोपी (धराशायी लाइन) द्वारा मापा. त्रुटि सलाखों माइक्रोस्कोपी के लिए तनाव (बी) और तीन प्रतिकृति के लिए फ्लो (सी) के लिए तनाव के बाद 60 मिनट के बाद मतलब. बी और 120 मिनट में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता के सी. Histograms की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. के लिए क्लिक करेंबड़ी छवि को देखने.
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Discussion
माइक्रोस्कोपी
Cona के साथ अच्छी तरह से इलाज कोशिकाओं का एक उचित इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए एक आवश्यक कदम है. Cona पीबीएस (5 मिलीग्राम / एमएल) में कम विलेयता है क्योंकि, निस्पंदन प्रक्रिया की अनुमति देता है अनफ़िल्टर्ड समाधान में मौजूद हैं और इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कि बड़े समुच्चय को हटाने. कोशिकाओं का इलाज सतह को अपेक्षाकृत मजबूती से देते हैं और उत्प्रेरण समाधान के अलावा प्रोत्साहन पहले और बाद में एक लगातार नज़र रखने के लिए अनुमति देता है, कोशिकाओं के स्थानीयकरण को परेशान नहीं करना चाहिए. कोशिकाओं एक निरंतर प्रवाह 7,15 के अधीन हैं थे इस इलाज भी चैनल या microfluidic उपकरणों प्रवाह करने के लिए लागू किया जा सकता है. अच्छी तरह से ठीक से उपचार के बाद पानी से rinsed नहीं है, तो समाधान में Cona कोशिकाओं को सीधे बांध और कांच की सतह पर एक मजबूत बांड फार्म करने के लिए उन्हें रोकता है, शायद क्योंकि कोशिकाओं, कांच के लिए ठीक से पालन नहीं करेंगे. धोने कदम के बाद अच्छी तरह से 3 के लिए सूखी रह सकते हैं -ज़ाहिर गिलास को कोशिकाओं के बंधन को प्रभावित किए बिना कोशिकाओं के अलावा पहले 4 घंटे.
फ्लोरोसेंट चैनल के लिए जोखिम समय का चयन प्रयोग की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण सेटिंग है. सेल के प्रतिदीप्ति समय चूक भर में वृद्धि होगी के बाद से, यह अधिग्रहण के दौरान छवियों का संतृप्ति से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अधिक से अधिक जोखिम समय है क्या एक प्रेरित नमूने के साथ पहले से परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. जोखिम समय का चयन करते समय ध्यान में रखना एक अन्य पैरामीटर फ्लोरोसेंट संकेत के विरंजन है. प्रत्येक नमूना के लिए, एक समय चूक के दौरान कारण विरंजन के लिए संकेत की छवि और गिरावट की चमक के बीच एक व्यापार बंद मिल गया है. प्रत्येक अधिग्रहण के बीच समय अंतराल भी दृढ़ता की fluorophore विरंजन को प्रभावित करती है. प्रोटीन अभिव्यक्ति एक अपेक्षाकृत धीमी प्रक्रिया है, हम आम तौर पर 10-15 मिनट का उपयोग करें. अंतराल. अन्य तेजी से प्रक्रियाओं च किए जाने की जरूरत हैप्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए समानांतर में ollowed, यह पूरी फिल्म समय चूक (जो बाद में अधिग्रहण के लिए शुरुआत है और 5-15 मिनट में 1-2 मिनट) भर में अलग अलग समय चरणों का उपयोग करने की सलाह दी जा सकती है.
सेल घनत्व के नियंत्रण के खाते में लेने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. घनत्व बहुत कम है, केवल कुछ कोशिकाओं डेटा सेट के लिए गरीब आँकड़ों में जिसके परिणामस्वरूप देखने के प्रत्येक क्षेत्र में मौजूद रहेंगे. घनत्व बहुत अधिक है, तो हालांकि, यह मुश्किल छवियों से वांछित जानकारी निकालने के लिए कर रही है, विभाजन, ट्रैकिंग और कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव में बाधा हो सकती है. बोने घनत्व निर्धारित करते हैं, खाते में लेने के लिए एक अतिरिक्त पैरामीटर प्रयोग की अवधि है. एक प्रयोग के कई विभाजन चक्र के लिए रहता है, तो यह धीरे - धीरे वजह से कोशिकाओं के विभाजन और समाधान में कोशिकाओं के बसने के लिए इमेजिंग के समय के पाठ्यक्रम के दौरान भरना होगा कि देखने का एक विरल क्षेत्र के साथ शुरू करने की सलाह दी जाती है. प्रोटोकॉल में, हम उपयोग करने का सुझावहम हम अब लोगों के लिए 0.005 करने के लिए कम समय चूक फिल्मों के लिए 0.05 से ओवर ड्राफ्ट 600 का उपयोग करने के प्रयोग के प्रकार के आधार पर 0.02 के एक आयुध डिपो के 600,.
विश्लेषण किया कोशिकाओं की संख्या स्पष्ट रूप से प्रयोग की वैधता के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. कभी कभी के रूप में कुछ 20-30 के रूप में कोशिकाओं को एक डाटासेट उत्पन्न करने के लिए संयुक्त रहे हैं. हालांकि, सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डेटासेट, एक सौ कोशिकाओं या अधिक होने शुरू करने के लिए शायद जरूरी हैं. उद्देश्य से बढ़ाई imaged क्षेत्र का आकार और imaged कोशिकाओं की जिससे संख्या निर्धारित करता है. उद्देश्य सेल की औसत प्रतिदीप्ति उपाय है जहां प्रोटीन अभिव्यक्ति माप, के लिए, एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर 40X विसर्जन उद्देश्य शोर अनुपात करने के लिए अच्छा संकेत है और देखने का एक बड़ा क्षेत्र दोनों प्रदान करने का सबसे अच्छा समाधान है. उप सेलुलर संरचनाओं का विश्लेषण किया जाना है, तो उच्च आवर्धन (60X या 100X उद्देश्यों) कम कोशिकाओं की माप, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर आवश्यक हैं. sCMO के आगमनपारंपरिक सीसीडी के एक से लगभग चार गुना बड़ा एक डिटेक्टर के आकार के साथ एस कैमरों को देखने के क्षेत्र के प्रति अधिक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए स्पष्ट रूप से एक फायदा है.
एक मोटर चालित XY चरण के साथ, यह अंतिम डाटासेट में कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए देखने के समानांतर कई क्षेत्रों में छवि के लिए संभव है. हालांकि, दौरा XY पदों की संख्या और छवि के अधिग्रहण की गति के बीच एक व्यापार बंद है. मंच की गति और दर्ज illuminations की संख्या पर निर्भर करता है, यह छवि एक मिनट से भी कम समय में दस पदों के लिए आम तौर पर संभव है. तेजी से संकेत घटनाओं यों, यह एक सीमित कारक बन सकता है. प्रतिदीप्ति परिवर्तन एक धीमी समय के पैमाने पर हुआ जहां प्रोटीन अभिव्यक्ति माप, के लिए, यह आमतौर पर एक सीमा नहीं है. इन अभिव्यक्ति प्रयोगों कुछ घंटों के लिए पिछले है और क्योंकि आवश्यक धीमी अस्थायी समाधान की वजह से वैकल्पिक रूप से, यह समानांतर में छवि कई नमूने के लिए लाभप्रद हो जाता है. एकाधिक पड़ोसी कुओं can जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया, विभिन्न प्रोत्साहन प्रत्येक अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है या जैविक प्रतिकृति समानांतर में मापा जा सकता है. एक 96 अच्छी तरह से थाली से सभी कुओं के माध्यम से स्कैनिंग नियमित माइक्रोस्कोपी स्क्रीन 16 के लिए हवा उद्देश्य के साथ हासिल की है. कारण खमीर में अंतर्जात प्रोटीन की कम बहुतायत के लिए, उनके मात्रा का ठहराव उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक तेल उद्देश्य की आवश्यकता है. यह गंभीर रूप से उद्देश्य के साथ कूच किया जा सकता है कि सीमा की सीमा. फिर भी हम उनके पास आम कोने में रह कर नियमित छवि चार पड़ोसी वेल्स. यह हालांकि कुओं की एक बड़ी संख्या छवि को और अधिक चुनौतीपूर्ण है. स्वचालित dispensers साथ जल उद्देश्यों चमक में एक मामूली नुकसान की कीमत पर इस समस्या को दरकिनार कर सकता है.
प्रवाह cytometry
कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या में एकत्रित शायद ही प्रवाह cytometers के साथ एक समस्या है. आमतौर पर 10,000-100,000 कोशिकाओं को एक मिनट में हासिल किया जा सकता है. हालांकि, क्योंकि टी की कोई छविसेल का अधिग्रहण किया है वह, यह ठीक से विश्लेषण किया जा करने के लिए सेल आबादी का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. आगे मापा और पक्ष scatters के आधार पर कोशिकाओं की gating व्यक्ति की कोशिकाओं के बजाय कोशिकाओं के समूहों का चयन करने के लिए और विश्लेषण से सेल मलबे को हटाने के लिए अनुमति दे सकते हैं. चित्रा 2 में, प्रत्येक हिस्टोग्राम मापा 10,000 घटनाओं से उनके बिखरने गुणों के आधार पर चयन किया गया है, जो मोटे तौर पर 5,000 कोशिकाओं की आबादी का प्रतिनिधित्व करता है.
व्यक्ति की कोशिकाओं में कोशिकाओं के समूहों को तोड़ने से, सेल संस्कृति के sonication अधिग्रहीत डेटा की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए एक अतिरिक्त तरीका है. यह कोशिकाओं के समूहों ठीक से क्षेत्र के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है, जहां माइक्रोस्कोपी के लिए सच है. इस चरण की अवधि प्रयोगात्मक परीक्षण किया जाना है. हम आम तौर पर सेल निलंबन की vortexing द्वारा पीछा किया एक मिनट में 30 सेकंड के एक पानी के स्नान में sonication के दो राउंड प्रदर्शन करते हैं. लम्बे समय तक sonication कुछ कोशिकाओं के सेल में परिणाम कर सकते हैं. हालांकि, हम ओ नहीं कियाइस प्रयोगात्मक कदम की वजह से तनाव उत्तरदायी जीनों के एक ऊपर विनियमन bserve. उदाहरण W303 कोशिकाओं S288C कोशिकाओं की तुलना में कुल करने के लिए एक मजबूत प्रवृत्ति प्रदर्शित लिए कोशिकाओं का एकत्रीकरण, एक पृष्ठभूमि निर्भर phenotype है कि ध्यान दें.
एकल कक्ष माप में परिवर्तनशीलता
चित्रा 3 में, फ्लो और माइक्रोस्कोपी द्वारा निष्पादित तीन स्वतंत्र प्रयोगों के लिए मतलब है और मानक त्रुटि साजिश रची है. तीन घटता के बीच मामूली अंतर प्रयोगात्मक त्रुटियों इन सरल माप के लिए अपेक्षाकृत छोटे हैं और कई कोशिकाओं (माइक्रोस्कोपी के लिए 370-550 के बीच, प्रवाह cytometry के लिए 5,000 से अधिक) मापा जाता है कि इस तथ्य से उत्पन्न होती हैं. माइक्रोस्कोपी घटता के अस्थायी विकास फ्लो डेटा की एक से चिकनी है. इस व्यवहार के लिए एक संभावित कारण यह है कि नमूना तैयार करने की प्रक्रिया है. माइक्रोस्कोपी के लिए, एक प्रयोग में हर समय अंक थोड़ी देर के लिए, एक ही तनाव घटना से परिणामFACS, हर समय बिंदु के लिए नमूना व्यक्तिगत रूप से बल दिया है. तनाव और संस्कृति समाधान की मात्रा में छोटे बदलाव जीन अभिव्यक्ति उत्पादन में एक छोटा सा फर्क हो सकता है. एक वैकल्पिक रणनीति कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर संस्कृति तनाव और cycloheximide के साथ उन्हें मना करने के लिए वांछित समय पर aliquots को दूर करने के लिए किया जाएगा. दोनों तरीकों से इसे और अधिक लचीलापन प्रदान करता है और भी कई NaCl सांद्रता समानांतर में मापा जाना है जहां खुराक प्रतिक्रिया घटता की माप के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि हम microtube तैयारी विधि का उपयोग करें, अच्छी तरह से काम करते हैं.
इन औसतन घटता में कम शोर हालांकि एकल कोशिका के स्तर पर परिवर्तनशीलता वर्तमान की पूरी श्रृंखला को प्रतिबिंबित नहीं करता. में यह आंकड़ा 3 बी और 3C, माइक्रोस्कोपी से मापा और एक ही समय बिंदु पर प्रवाह cytometry अभिव्यक्ति की histograms प्लॉट किए जाते हैं. इन दो पैनलों espec, अच्छी तरह से प्रतिकृति के बीच तकनीकी विविधताओं अपेक्षाकृत छोटे हैं कि तथ्य को वर्णनially व्यक्ति की कोशिकाओं की अभिव्यक्ति में मनाया बड़ी परिवर्तनशीलता की तुलना में. माप cytometry माइक्रोस्कोपी और प्रवाह के बीच वितरण के आकार में अंतर माइक्रोस्कोपी छवियों में औसत सेलुलर तीव्रता की गणना की गई है, जबकि कुल सेलुलर तीव्रता प्रवाह cytometry के साथ मात्रा निर्धारित है कि इस तथ्य से उत्पन्न होती है. इसलिए यह बाद माप सेल आकार में बदलाव बाहर औसत और संकरा वितरण में यह परिणाम है.
यहाँ प्रस्तुत दो तकनीकों मात्रात्मक एकल कक्षों के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं. यह सुविधा आमतौर पर आबादी के स्तर पर प्रदर्शन परंपरागत जैविक माप में छिपा हुआ है. व्यक्ति की कोशिकाओं की प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता उभर समझ कैसे जैविक प्रक्रियाओं के जटिल विनियमन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
लेखकों मथायस पीटर और इन तरीकों का विकास किया गया है, जहां पर ETH ज्यूरिख में जैव रसायन के संस्थान में उनके समूह को धन्यवाद. इस काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 | |
References
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