シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

Summary

フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査に基づいて、二つの相補的な方法は、酵母におけるMAPK経路の活性化によって誘導される遺伝子発現の動態を、単一細胞レベルで、定量化を可能にする提示されている。

Abstract

単一細胞レベルでの遺伝子発現の定量化は、集団レベルで実行される測定に不明瞭新規調節機構をが明らかになりました。二つの方法に基づいて、顕微鏡およびフローサイトメトリーは、このようなデータを取得することができる方法を示すために提示される。酵母における高浸透圧グリセロールMAPK経路の活性化の際に誘導される蛍光レポーターの発現は、例として使用される。各方法の具体的な利点が強調表示されます。フローサイトメトリーは、細胞（10,000）を多数測定し、蛍光タンパク質の成熟遅い速度の独立したタンパク質発現の動力学を直接測定を提供する。顕微鏡による生細胞のイメージングは​​、少数の細胞におけるレポーターの成熟した形での測定に限定された対照的である。しかし、この技術によって生成されたデータ·セットは、複数のレポーターの組合せ及び空間的及び時間的情報のおかげで非常に豊富であることができる個々の細胞から得られた。これら二つの測定法の組み合わせはシグナル伝達経路によってタンパク質発現の調節に関する新たな洞察を提供することができます。

Introduction

伝達カスケードを介したシグナル伝達は、多くの場合、タンパク質の発現で絶頂に達する。この発現プロファイルの特徴付けは、生物学的経路の機能を理解する上で重要な要素です。アップレギュレートされたタンパク質およびその活性化の動態のスペクトルの同定は、例えば、マイクロアレイ、ノーザンブロットまたはウェスタンブロット^1-3のような様々な技術によって達成することができる。しかしながら、これらの技術は、細胞の集団全体の応答を平均化する。タンパク質の発現の微調節を理解するためには、単一細胞レベルでの測定値を収集することが望ましい。理想的には、これらの測定は、根本的な経路の数学モデルを開発するために適し定量的データを提供すべきである。

顕微鏡およびフローサイトメトリー、理想的な定量的な単一細胞の測定値を提供するのに適している二つの技術、である。蛍光タンパク質とタンパク質の内因性のタグ付けはできるBeは、それらの発現レベル^4を定量するために使用。タンパク質の末端における大きな蛍光部分の付加は、それを非機能的にすることができるので、それは、蛍光構築物の発現を駆動するプロモーターに基づいて、特定の発現レポーターを生成するために、多くの場合望ましい。このレポータータンパク質は、セルラーシステムに対して外因性であるため、セルに行われているシグナル伝達事象に影響を与えることはない。

顕微鏡法およびフローサイトメトリーの両方が広く酵母シグナリング分野で使用されてきた。例として、コールマン·ラーナーらは相関単一細胞では、酵母接合シグナル伝達カスケード⁵のノイズを定量化するために顕微鏡によって具体的かつ構成的に発現記者を交配の発現、Acarのと制御ネットワークを研究するフローサイトメトリーを使用し、同僚GAL遺伝子⁶の発現を制御する。以前の研究⁷において、我々はcombinatiを使用している出芽酵母では高浸透圧グリセロール（HOG）経路からの発現の出力を研究するため、これら2つの技術の上。このマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路は、超浸透圧ストレスによって誘発される。それは、およそ300の遺伝子の発現を生じる転写プログラムを誘導するために、細胞の核に移行しHOG1 MAPKの活性化をもたらす。このプロセスを研究するために、我々は、四重ビーナス蛍光タンパク質（STL1のp-QV）の発現を駆動STL1プロモーター（HOG1活性⁸に応答して特異的に誘導される遺伝子）に基づく発現レポーターを設計した。測定はフローサイトメトリー、蛍光レポーターを表現する人口のほんの一部に中間ストレスレベル（0.1MのNaCl）で細胞の2集団が存在することを発見した。今後も、この動作を調査するために顕微鏡を使用し、タンパク質発現におけるこのノイズは本質的な要因⁹に支配されたことを発見した。我カップLDさらにHOG1活動の同様のレベルを有する細胞が著しく異なる発現の結果を表示できることを確認します。これら2つの技術の組み合わせは、私たちはストレス応答遺伝子の遅いリモデリングは、単一細胞レベル⁷での発現の結果に影響を与えたかを証明することができました。

本論文では、顕微鏡によるタンパク質発現の定量化の一例として、超浸透圧ショックにより誘導されたP STL1-QVレポーターの式を使用し、フローサイトメトリー。 0.2 MのNaClストレスを受ける同じ株を、両方の技術を用いて研究した。これは、私たちは、これらの2つの高度に補完的な技術のいくつかの重要な違いを強調することができます。

Protocol

1。顕微鏡測定

1. 酵母で合成培地5mlに植菌。
2. 30℃で一晩細胞を成長させる。
3. 翌朝一晩培養物のOD _600を測定します。
4. ₆₀₀ 0.05にOD 5ミリリットル合成培地中で一晩培養を希釈します。
5. 少なくとも4時間、30℃で希釈した培養を育てる。
6. 合成培地に集中して3倍（0.6 M）のNaCl溶液を調製する。
7. PBSにコンカナバリンA（ConAを）の1 mg / mLの溶液を調製する。
8. ろ液〜ウェルスライドにConAを溶液200μl。
9. 30分間放置してみましょう。
10. のConA溶液を除去。
11. ウェルに150μlのH ₂ Oを追加します。
12. H ₂ Oを削除
13. 細胞培養のOD _600を測定します。
14. 1.5ミリリットルマイクロチューブに= 0.02 OD ₆₀₀で細胞培養液300μlを準備します。
15. 45秒間、水浴中で細胞を超音波処理する。
16. 渦簡単にマイルcrotube。
17. 45秒間、水浴中で細胞を超音波処理する。
18. 簡単に渦マイクロチューブ。
19. ウェルに、細胞培養液200μlを加える。
20. 細胞がウェルの底に沈殿させるために30分待ちます。
21. 顕微鏡上でうまくスライドを配置します。
22. 記録される蛍光チャンネル用照明設定を選択します。
23. （：細胞の適切なセグメンテーションを可能にするために、焦点面下の3程度やや焦点のうち、1）2明視野画像の照明設定を選択します。
24. タイムラプス測定のための時間間隔を選択します。
25. 画像への視野を選択します。
26. 数フレームの取得を開始します。
27. 0.6MのNaClを培地100μlを追加し、取得を一時停止します。
28. 画像を再開する。

2。フローサイトメトリー測定

1. 酵母で合成培地5mlに植菌。
2. 一晩30℃で成長する。
3. 対策OD一晩培養の₆₀₀翌朝。
4. OD ₆₀₀ 0.1に5ミリリットル合成培地中で一晩培養を希釈します。
5. 0.2〜0.4のOD ₆₀₀に_到達するために、少なくとも4時間、30℃で成長する。
6. H ₂ Oにシクロヘキシミド溶液1 mg / mlのを準備します
7. 合成培地に集中して3倍（0.6 M）のNaCl溶液を調製する。
8. 測定対象の各時点での0.6 MのNaCl培地100μlで1 1.5ミリリットルマイクロチューブを準備します。
9. 時間0で、各マイクロチューブに細胞培養液200μlを加える。
10. 30℃で振とうしながらインキュベート
11. 時刻tでの、マイクロチューブに30μlのシクロヘキシミドを追加します。
12. すべての希望する時点について、手順2.11。
13. 少なくとも45分間、すべてのマイクロチューブをインキュベートし、振とうしながら30℃まで3時間。
14. 400μlのPBSでFACSチューブを準備します。
15. 1分間水浴中で細胞を超音波処理する。
16. 簡単に渦マイクロチューブ。
17. 息子1分間水浴中で細胞をicate。
18. 簡単に渦マイクロチューブ。
19. 各マイクロチューブからそれに対応する、FACSチューブに100μlの細胞培養を追加します。
20. 検出のために488nmの励起レーザーと30分の530 nmのバンドパスフィルタを選択します。
21. テスト非発現し、完全に彼らは検出器の感度の範囲に入るかどうかを確認するためにサンプルを表現する。
22. 取得した各サンプルについて、10,000個の細胞を測定します。

Representative Results

顕微鏡検査

発現レポーターSTL1のp-QV（ySP9 ^7）を有する酵母細胞は、ウェルスライドの底部に取り付けられ、顕微鏡下に置いた。細胞は、撮像セッションの過程の間に直接ウェルに応力媒体を添加することにより刺激した。これは、私たちは、経路誘導前の細胞のいくつかの画像を取得し、刺激後、彼らの運命をたどることができます。この場合、細胞を10分間の時間間隔で〜2時間追跡した。 図1Aは、誘導前に、非蛍光細胞の画像であり、発現レポーターを有する場合、図1Bは、ストレス後の同じ細胞を2時間を表示する誘導されて、蛍光となっています。

これらの画像中に存在する定量的な情報を抽出するために、複雑な画像解析処理が実行されなければならない。それは私のオブジェクトを定義するために、細胞のセグメンテーションが含まれていMAGE、あるフレームから次のフレームへのこれらのオブジェクトの追跡と、これらのオブジェクト（形状や強度特性）の特徴の採寸です。我々は、この分析^10を実行するためにYeastQuantという私たちの独自のプラットフォームを開発しました。他のいくつかの非商用のソフトウェアがこれらのタスクを実行するために用意されています。CellProfiler ^11は、12またはCellX ^13のセルID 図1Cは、YeastQuantで行われた分析の結果が表示されます。各赤色トレースは、単一細胞の平均蛍光強度の時間変化を表している。青い線は同一のウェルからの眺め、5つの異なる分野から取得した5時間経過映画の20フレーム全体にセグメント化され、追跡された500以上の細胞の中央値を表示します。水色のエリアは、与えられた時点で測定されたすべての強度の25日と75パーセンタイルを表しています。

フローサイトメトリー

フローサイトメトリーのためのmeasuremエント細胞培養ストレス培地を含むマイクロチューブに流出した。 p個のSTL1-QV発現の時間的な進化を研究するために、変換がシクロヘキシミド（ 図2）の異なる時点（5〜10分間隔）で阻害された。この薬のブロックが新たなタンパク質の合成が、既に表明蛍光タンパク質の成熟は乱されていません。したがって、1時間のインキュベーションの45分後、細胞をシクロヘキシミド添加時に生じるタンパク質の量の定量化を可能にするフローサイトメーターで測定することができる。この戦略は、蛍光タンパク質成熟の問題を回避し、それにより蛍光タンパク質合成の真の動態を定量化する。

2つの技術の比較

図3Aは、顕微鏡によって測定された発現レポーターの動態を比較し、フローサイトメトリー。蛍光シグナルは30〜40の上昇を開始しながら、minは、顕微鏡とストレス後、フローサイトメトリー測定値は、明らかにタンパク質が既に、刺激後10〜15分の間に産生されることを証明している。この半時間遅延は蛍光タンパク質¹⁴のゆっくりとした成熟が原因です。両方の方法は、細胞の蛍光強度を定量化するが、1本研究では、それらが同一の生物学的プロセスを測定しないことを心に留めています。 、顕微鏡で蛍光シグナルの出現に続く一方で、フローサイトメトリーは、実際にタンパク質の合成を定量化する。これは、生細胞イメージングを行う際に考慮この熟成工程を行うことが不可欠である。内因性タンパク質が蛍光タンパク質でタグ付けされている状況では、内因性タンパク質は、そのタグの蛍光が検出される前に発現し、活性説明する。

上述したように、両方の技術は、補足情報を配信する。 （非常に迅速に多数のセルを測定することができるフローサイトメトリー10,000以上）。従って、二つの重複集団が同定され得るか、またはいくつかの稀な事象を観察することができる統計的に豊富なデータセットを送達することができる。顕微鏡は、細胞（100程度）の限られた数の情報を提供します。このデータセットは時間的および空間的情報を含み、同じセル内の複数の測定値の相関関係を可能にするので、それを調べ、生物学的プロセスに非常に貴重な洞察を提供することができる。

図1。顕微鏡によるレポーター発現の測定。 A及びB（A）の前に、蛍光レポーター発現のp STL1-QVを有する細胞および0.2 MのNaCl（B）による刺激後2時間の画像はC。インフルエンザの時間経過 orescenceの幻影。赤色の曲線は、いくつかの代表的な単一細胞のトレースの平均細胞蛍光強度を表す。青い曲線は550単細胞トレースの蛍光中央値を表している。水色のエリアは、各時点での細胞集団の蛍光式の25日と75パーセンタイルを表しています。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。フローサイトメトリーによるレポーター発現を測定する蛍光レポーター発現のp STL1-QVは0.2 M NaClで処理し、異なる時点でのシクロヘキシミドで阻害を有する細胞の細胞蛍光のヒストグラム。www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図3。顕微鏡によって測定し、フローサイトメトリーの発現動態の比較。蛍光強度の平均A.三の生物学的反復時間の関数として、フローサイトメトリー（実線）および顕微鏡（破線）により測定した。エラーバーは、顕微鏡検査のための応力（B）と、3回の反復のためのフローサイトメトリーのためのストレス後60分（c）の後120分で正規化された蛍光強度の平均値。BとCのヒストグラムの標準誤差を表す。 するには、ここをクリックしてください拡大表示する。

Discussion

顕微鏡検査

ConAを持つウェルの治療は、細胞の適切な画像化を確保するための重要なステップです。のConAをPBS（5 mg / ml）を、低溶解性を有するため、濾過工程は、フィルタリングされていない溶液中に存在し、撮像を妨害する大きな凝集物を除去することができる。細胞が処理された表面に比較的強く付着し、誘導溶液の添加は、刺激の前と後の継続的な追跡を可能にし、細胞の局在を乱すべきではありません。細胞は一定流量^7,15に供されたこの処置はまた、チャネルまたは微小流体デバイスを流すために適用することができる。ウェルを適切に処理した後に水でリンスされていない場合、細胞は、溶液中のConAを細胞に直接結合し、ガラス表面に強い結合を形成することを妨げるためと考え、ガラスに適切に付着しない。洗浄工程の後、ウェルを3ドライ残ることができる -著しくガラスへの細胞の結合に影響を与えることなく、細胞の添加の前に4時間。

蛍光チャネルのための露光時間の選択は、実験の成功のための重要な設定である。細胞の蛍光が経時にわたって増加するので、獲得中に画像の飽和を回避するために使用することができる最大の露出時間が何であるかを事前に誘導された試料とテストすることが重要である。露光時間を選択する際に考慮すべき別のパラメータは、蛍光シグナルの漂白である。各サンプルについて、1は時間が経過する間に起因漂白信号の画像と劣化の明るさとのトレードオフを見つける必要があります。各収集の間の時間間隔も強く、フルオロフォアの漂白に影響を与えます。タンパク質の発現は比較的遅いプロセスであるため、我々は、典型的には10〜15分を使用する。間隔。他のより高速なプロセスがFにする必要がある場合タンパク質発現と並行してollowed、それは全体のタイムラプスムービー（後で買収最初と5〜15分間で1〜2分）間で異なる時間ステップを使用することをお勧めかもしれません。

細胞密度の制御は考慮すべき重要なパラメータである。密度が低すぎると、わずかな細胞は、データ·セットの乏しい統計結果ビューの各フィールドに存在するであろう。密度が高すぎる場合は、それが困難な画像の中から所望の情報を抽出すること、セグメント化、追跡及び細胞の定量を妨げるかもしれない。播種密度を決定するために、考慮すべき一つの追加のパラメータは、実験期間中である。実験は、複数の分割サイクル続くと、それは徐々に細胞の分裂や溶液中の細胞の沈降による撮影時の経過中にいっぱいになり、ビューのまばらな分野から始めることをお勧めします。プロトコルでは、使用することをお勧め我々は長いもののために0.005に短いタイムラプス映画のための0.05からOD _600を使用して行う実験の種類に応じて、0.02のOD _600、。

分析した細胞の数は、明らかに、実験の有効性のために重要なパラメータである。時々、わずか20〜30の細胞は、1つのデータセットを生成するために組み合わされる。しかし、統計的に有意なデータセットを持ち始めるために、百セル以上はおそらく必要です。目的の倍率は画像化された領域のサイズおよび画像化された細胞の、それによって数を決定します。目的は、細胞の平均蛍光を測定することでタンパク質発現測定のために、高開口数40X浸対物レンズは、対雑音比の良好な信号と広い視野の両方を提供する最善の解決策である。サブ細胞構造を分析しなければならない場合には、高倍率（60Xまたは100X目標は）より少ない細胞の測定、その結果、多くの場合必要である。 sCMOの出現従来のCCDのものよりもほぼ4倍の検出器サイズを有するSカメラは、視野あたりの細胞を得るために明らかに利点である。

電動XYステージにより、最終的なデータセット内のセルの数を増加させるために、ビューの並列の複数のフィールドに画像化することが可能である。しかしながら、訪問先XY位置の数と画像取得の速度の間にトレードオフが存在する。ステージの速度と記録された照明の数に応じて、画像分未満で10箇所を、典型的には実現可能である。高速のシグナル伝達事象を定量化するために、これが制限要因になることができる。蛍光の変化が遅い時間スケールで起こるタンパク質発現測定のために、それは通常、限定するものではない。あるいは、数時間、これらの発現実験は、最後の理由及び必要なため遅い時間分解能のではなく、並行して複数のサンプル画像に有利となる。複数の隣接するウェルはでCAnは、野生型および変異細胞を播種すること、異なる刺激を各ウェルに適用することができ、または生物学的複製を並行して測定することができる。 96ウェルプレートの全てのウェルを介して走査顕微鏡法を日常画面¹⁶用の空気対物レンズを用いて達成される。原因酵母における内因性タンパク質の少量に、その定量化は、高開口数の油浸対物を必要とします。これは深刻な目的とした走行可能範囲を制限する。彼らの共通のコーナーの近くに滞在して、それにもかかわらず、我々が日常的画像4隣接井戸を。しかしながらウェルより多数の画像より困難である。自動ディスペンサー水の目的は、明るさのわずかな損失を犠牲にしてこの問題を回避する可能性があります。

フローサイトメトリー

十分な数の細胞を収集することはほとんどのフローサイトメーターでの問題ではありません。通常、10,000〜100,000細胞分で取得することができます。しかし、Tの画像がありませんので、細胞を取得した彼は、適切に分析される細胞集団を選択することが重要である。測定された前方および側方散乱に基づく細胞のゲーティングは、個々の細胞よりもむしろ細胞のクラスターを選択し、解析から細胞破片を除去することを可能にすることができる。 図2では、各ヒストグラムは、測定された10,000事象からの散乱特性に基づいて選択したおおよそ5,000細胞の集団を表す。

個々の細胞への細胞のクラスターを破壊することによって、細胞培養物の超音波処理は、取得したデータの品質を改善するための追加の方法である。これは、細胞のクラスターが正常にセグメントが非常に困難であることができる顕微鏡用にも当てはまる。このステップの持続時間は、実験的に試験されなければならない。我々は通常、細胞懸濁液のボルテックスが続く分に30秒の水浴中で超音波処理の2ラウンドを行う。長時間の超音波処理は、いくつかの細胞の溶解をもたらすことができる。しかし、我々はOしませんでしたこの実験的な段階に起因するストレス応答遺伝子のアップレギュレーションをbserve。たとえばW303細胞はS288C細胞よりも、凝集する強い傾向を表示し、細胞の凝集が背景に依存する表現型であることに注意してください。

単一セル測定の変動性

図3Aに、フローサイトメトリーおよび顕微鏡によって実施した3つの独立した実験の平均値と標準誤差がプロットされている。 3曲線間のわずかな違いは、実験誤差はこれらの簡単な測定のために、多くの細胞は、（顕微鏡用370から550の間で、フローサイトメトリーのための5,000以上）で測定されることが比較的小さいという事実から生じる。顕微鏡曲線の時間的な進化は、フローサイトメトリーデータの一よりも滑らかである。この動作の一つは可能性の高い原因は、サンプル調製プロセスである。顕微鏡観察のために、実験ではすべての時点では、しばらくの間、同じストレス事象から生じるFACSは、各時点でのサンプルを個別に強調されている。ストレスおよび培養液の体積の小さな変化は、遺伝子発現の出力に小さな違いをもたらすことができる。一つの代替戦略は、細胞を5mlの培養物を強調し、シクロヘキシミドでそれらを阻害するために所望の時点でアリコートを除去することである。両方の方法は、より柔軟性を提供し、複数のNaCl濃度を並行して測定する必要が用量応答曲線の測定にも適しているので、我々はマイクロチューブの製造方法を使用して、うまくいく。

これらを平均曲線における低ノイズ、しかし、単一細胞レベルでの変動に存在するすべての範囲を反映していない。 図3Bおよび3Cにおいて、発現のヒストグラム顕微鏡法により測定すると、単一の時点でフローサイトメトリープロットされている。これらの2つのパネルがエスペック、ウェルの複製物の間の技術的変動は比較的小さいという事実を示してially個々の細胞の発現が観察された大きな変動と比較した。測定顕微鏡およびフローサイトメトリーとの間の分布の形状の差は、顕微鏡画像における平均細胞性強度を算出しながら、全細胞の強度をフローサイトメトリーで定量化されるという事実から生じる。この後者の測定値を平均セルサイズの変動うち、従って狭い分布が生じる。

ここで紹介する2つの技術が定量的単一細胞の挙動を研究することを可能にする。この機能は通常、集団レベルで行われ、伝統的な生物学的測定の中に隠されている。個々の細胞の応答の変動性が出てくるか理解することは、生物学的プロセスの複雑な規制への重要な洞察を提供することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base	ForMedium	CYN6202
CSM amino-acid mix	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Microscope control software	Micro-manager	Ver 1.4.11
Incubation chamber	LIS	The Box
Fluorescence light source	Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Flow cytometer	BD	FACS calibur
Sonicator bath	Telesonic	TUC-150
8-well-slide	Thermo Lab-tek	155409
96-well-plate	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tube	BD Falcon	352054