A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

Summary

Dois métodos complementares baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentadas, que permitem a quantificação, no nível de uma única célula, da dinâmica da expressão de genes induzidos pela activação de uma via de MAPK em levedura.

Abstract

A quantificação da expressão gênica no nível da célula única descobre novos mecanismos de regulação obscurecidos em medições realizadas a nível da população. Dois métodos baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentados para demonstrar a forma como esses dados podem ser adquiridos. A expressão de um repórter fluorescente induzida após a activação da MAPK alta osmolaridade glicerol via em levedura é usada como um exemplo. As vantagens específicas de cada método são realçados. A citometria de fluxo mede um grande número de células (10.000) e proporciona uma medida direta da dinâmica da expressão proteica independente da cinética de maturação lenta da proteína fluorescente. Imagiologia de células vivas por microscopia por contraste é limitada para a medição da forma amadurecida do repórter no menor número de células. No entanto, os conjuntos de dados gerados por esta técnica pode ser extremamente ricos graças às combinações de vários jornalistas e à informação espacial e temporalobtido a partir de células individuais. A combinação destes dois métodos de medição pode oferecer novos insights sobre a regulação da expressão de proteínas por vias de sinalização.

Introduction

A sinalização por meio de cascatas de transdução de muitas vezes termina com a expressão de proteínas. A caracterização desse perfil de expressão é um elemento chave para a compreensão da função das vias biológicas. A identificação do espectro de sobre-regulada de proteínas e sua dinâmica de activação pode ser alcançada por diversas técnicas, tais como as micro-matrizes, transferências de Northern ou Western blot ^1-3. No entanto, essas técnicas de média a resposta de uma população inteira de células. Para compreender a regulação fina da expressão de proteínas, é desejável reunir as medições ao nível da célula individual. O ideal é que estas medidas também deve fornecer dados quantitativos passíveis de desenvolver modelos matemáticos da via subjacente.

Microscopia e citometria de fluxo são duas técnicas, as quais são idealmente adequados para entregar tais medições quantitativas de uma única célula. A marcação de proteínas endógeno com uma proteína fluorescente pode be utilizada para quantificar o nível de expressão ^4. No entanto, uma vez que a adição de uma grande porção fluorescente no terminal da proteína pode torná-la não-funcional, isto é, muitas vezes mais desejável gerar repórteres de expressão específicas com base em um promotor dirigindo a expressão de uma construção fluorescente. Esta proteína repórter é exógeno ao sistema celular e, portanto, não influencia os eventos de sinalização que estão ocorrendo na célula.

Ambos microscopia e citometria de fluxo têm sido amplamente utilizados no campo de sinalização de levedura. Como exemplos; Colman-Lerner e colaboradores correlacionados, em células individuais, a expressão de acasalamento repórteres específicos e constitutivamente expressos por microscopia para quantificar o ruído em levedura acasalamento cascata de transdução de sinal ^5, Acar e colegas utilizados citometria de fluxo para estudar a rede reguladora controlando a expressão dos genes GAL ^6. Em um estudo anterior ^7, nós usamos uma associaçem uma dessas duas técnicas para estudar a saída expressão do alto glicerol osmolaridade (HOG) via em brotamento da levedura. Este mitógeno proteína quinase ativada (MAPK) é desencadeada por estresse hiper-osmótico. Isso resulta na activação dos Hog1 MAPK, que transloca-se para o núcleo da célula para induzir um programa transcricional resultando na expressão de cerca de 300 genes. Para estudar este processo, que tinha engenharia um repórter com base na expressão do promotor STL1 (um gene induzido especificamente em resposta à actividade Hog1 ⁸⁾ dirigindo a expressão de uma proteína fluorescente Vénus quádruplo (p STL1-qV). A citometria de fluxo medições revelaram a presença de duas populações de células no nível de tensão intermédia (NaCl 0,1 M), com apenas uma fracção da população que expressa o repórter fluorescente. Nós usamos a microscopia para investigar mais este comportamento e descobriu que este ruído na expressão da proteína foi governada por fatores intrínsecos ^9. Nós could observar, ainda, que as células com um nível semelhante de atividade Hog1 poderia exibir resultados muito diferentes de expressão. A combinação destas duas técnicas permitiram-nos demonstrar como a remodelação lenta dos genes de resposta ao stress influenciou a expressão resultados ao nível da célula individual ^7.

Neste trabalho, usamos a expressão da p STL1-qV repórter induzida pelo choque hiper-osmótico como um exemplo da quantificação da expressão da proteína por microscopia e citometria de fluxo. A mesma cepa submetidos a 0,2 M NaCl estresse foi estudado com ambas as técnicas. Isto irá permitir-nos para destacar algumas das principais diferenças nestas duas técnicas altamente complementares.

Protocol

1. Medidas Microscopia

1. Inocular 5 ml de meio sintético com levedura.
2. Crescer as células a 30 ° C durante a noite.
3. Medir a OD ₆₀₀ da cultura durante a noite a na manhã seguinte.
4. Dilui-se a cultura durante a noite em 5 ml de meio sintético de OD ₆₀₀ de 0,05.
5. Crescer a cultura diluída a 30 ° C durante pelo menos 4 horas.
6. Preparar 3 vezes concentrado (0,6 M) de NaCl em meio sintético.
7. Prepara-se uma solução de 1 mg / ml de Concanavalina A (ConA) em PBS.
8. Filtrado ~ 200 mL de solução para o poço de ConA corrediça.
9. Deixe descansar por 30 min.
10. Remover solução ConA.
11. Adicionar 150 mL _de H ₂ O para o poço.
12. Retirar H ₂ O.
13. Medida _OD600 da cultura de células.
14. Prepare 300 mL de cultura de células em OD ₆₀₀ = 0,02 em um microtubo de 1,5 ml.
15. Sonicar as células num banho de água durante 45 segundos.
16. Vortex brevemente a microtube.
17. Sonicar as células num banho de água durante 45 segundos.
18. Vortex brevemente o microtubo.
19. Adicionar 200 mL de cultura de células para o bem.
20. Esperar 30 minutos para permitir que as células se depositam no fundo do poço.
21. Colocar o bem corrediça sobre o microscópio.
22. Selecione as configurações de iluminação para o canal fluorescente para ser gravado.
23. Seleccionar as configurações de iluminação por duas imagens de campo claro (um pouco fora do foco: 3 um abaixo do plano focal para permitir uma adequada segmentação das células).
24. Selecione os intervalos de tempo para a medição de lapso de tempo
25. Selecione os campos de visão a imagem.
26. Iniciar a aquisição de alguns fotogramas.
27. Pausa a aquisição para adicionar os 100 ml de 0,6 M NaCl médio.
28. Retomar imagem.

2. Medidas Citometria de Fluxo

1. Inocular 5 ml de meio sintético com levedura.
2. Crescer a 30 ° C durante a noite.
3. Medidaa _DO600 da cultura durante a noite a na manhã seguinte.
4. Dilui-se a cultura durante a noite em 5 ml de meio sintético de OD ₆₀₀ de 0,1.
5. Crescer a 30 ° C durante pelo menos 4 horas, para atingir uma DO ₆₀₀ de 0,2-0,4.
6. Preparar a solução de cicloheximida 1 mg / ml em H ₂ O.
7. Preparar 3 vezes concentrado (0,6 M) de NaCl em meio sintético.
8. Preparar um microtubo de 1,5 mL com 100 uL de 0,6 M de NaCl média para cada ponto de tempo a ser medidos.
9. No tempo 0, adicionar 200 mL de cultura de células a cada microtubo.
10. Incubar, sob agitação, a 30 ° C.
11. No tempo t, adicionar 30 mL cicloheximida para um microtubo.
12. Repita o passo 2.11 para todos os momentos desejados.
13. Incubar todas microtubos durante pelo menos 45 minutos e até 3 horas a 30 ° C com agitação.
14. Prepare os tubos de FACS com 400 mL PBS.
15. Sonicar das células em banho de água durante 1 min.
16. Vortex brevemente os microtubos.
17. Filhoicate das células em banho de água durante 1 min.
18. Vortex brevemente os microtubos.
19. Adicionar 100 ul de cultura de células a partir de cada microtubo no seu correspondente tubo de FACS.
20. Selecione o laser de excitação 488 nm e 530/30 nm filtro passa-banda para a detecção.
21. Teste não expressar e expressar totalmente amostra para verificar se eles estão na faixa de sensibilidade do detector.
22. Medir 10.000 células por cada amostra adquirida.

Representative Results

Microscopia

As células de levedura que ostentam a expressão repórter p-STL1 qV (ySP9 ⁷⁾ foram ligados ao fundo do poço de deslizamento e colocado sob o microscópio. As células foram estimuladas pela adição de meio de pressão directamente para dentro do poço, durante o decurso da sessão de imagem. Isso nos permite adquirir algumas imagens das células antes da indução da via e seguir o seu destino após a estimulação. No presente caso, as células foram seguidos durante ~ 2 horas com um intervalo de tempo de 10 min. Figura 1A é uma imagem de células não fluorescentes antes da indução e a Figura 1B mostra as mesmas células 2 horas após a tensão, quando a expressão de repórter foi induzida e tornou-se fluorescente.

Para extrair a informação quantitativa presente nestas imagens, um processo de análise de imagem complexo tem de ser realizada. Ele inclui a segmentação das células para definir objectos na imago, o rastreamento desses objetos a partir de um quadro para o outro e as medições das características destes objetos (de forma e intensidade de propriedades). Nós desenvolvemos nossa própria plataforma chamada YeastQuant para realizar esta análise ^10. Alguns outros softwares não-comerciais estão disponíveis para executar essas tarefas:. CellProfiler ^{11, 12} ou CellID CellX ¹³ Figura 1C mostra os resultados de uma análise realizada com YeastQuant. Cada traço vermelha representa a evolução temporal da intensidade média de fluorescência de uma única célula. A linha azul mostra a mediana de mais de 500 células que foram segmentados e monitorados ao longo dos 20 quadros de cinco filmes time-lapse adquiridos de cinco campos diferentes de pontos de vista a partir do mesmo bem. A área em azul claro representa o percentil 25 e 75 de todas as intensidades medidas em um determinado ponto do tempo.

Citometria de Fluxo

Para a citometria de fluxo measurements, a cultura celular foi derramado em microtubos contendo o meio de pressão. Para estudar a evolução temporal da expressão de p-STL1 qV, a tradução foi inibida em diferentes pontos de tempo (5 a 10 minutos de intervalo) com ciclo-heximida (Figura 2). Este fármaco bloqueia a síntese de novas proteínas, mas a maturação da proteína fluorescente já expresso não é perturbado. Portanto, depois de 45 minutos a uma hora de incubação, as células podem ser medidos no citómetro de fluxo que permite a quantificação da quantidade de proteína produzida no momento da adição de ciclo-heximida. Esta estratégia evita o problema de maturação da proteína fluorescente e, assim, quantifica os verdadeiros dinâmica da síntese de proteína fluorescente.

A comparação das duas técnicas

Figura 3A compara a dinâmica da expressão repórter medidos por microscopia e citometria de fluxo. Enquanto o sinal fluorescente começa a subir 30-40min após o stress com microscopia, as medições de citometria de fluxo provam claramente que as proteínas são já produzidas entre 10 a 15 minutos após o estímulo. Este atraso de meia-hora é devido à maturação lenta das proteínas fluorescentes ^14. Embora os dois métodos quantificar a intensidade de fluorescência das células, é preciso ter em mente que, neste estudo, eles não medem o mesmo processo biológico. Enquanto, microscopia segue a aparição do sinal fluorescente, a citometria de fluxo, na verdade, quantifica a síntese da proteína. É essencial ter em conta esta etapa de maturação ao realizar imagens ao vivo de células. Em uma situação em que uma proteína endógena é marcado com uma proteína fluorescente, a proteína endógena será expressa e activa antes da sua fluorescência da marca pode ser detectada.

Como indicado acima, ambas as técnicas entregar informação complementar. A citometria de fluxo pode medir um grande número de células muito rapidamente (10.000 ou mais). Ele pode, assim, fornecer conjuntos de dados estatisticamente ricos em duas populações que se sobrepõem podem ser identificados ou alguns eventos raros podem ser observados. Microscopia fornece informações sobre um número limitado de células (da ordem de 100). No entanto, porque este conjunto de dados contém informação temporal e espacial e permite a correlação de várias medições na mesma célula, pode oferecer insights altamente valiosas sobre o processo biológico investigado.

Figura 1. Medição da expressão de repórter por microscopia. A e B. De imagens de células portadoras do repórter fluorescente expressão p STL1-qV antes (A) e 2 horas após a estimulação com NaCl 0,2 M (B). C. Curso Tempo de gripe aparição orescence. As curvas vermelhas representam a intensidade média de fluorescência celular de alguns traços unicelulares representativas. A curva azul representa a fluorescência média de 550 únicos vestígios celulares. A área em azul claro representa o percentil 25 e 75 da expressão fluorescente da população de células em cada momento. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2. Medição da expressão de repórter por citometria de fluxo. Histogramas de fluorescência celular de células portadoras do repórter fluorescente expressão p STL1-qV tratada com 0,2 M de NaCl e inibida com cicloheximida em diferentes pontos de tempo.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3. Comparação da dinâmica de expressão medidos por microscopia e citometria de fluxo. A. média da intensidade de fluorescência medido por citometria de fluxo (linha sólida) e microscopia (linha a tracejado) em função do tempo para três réplicas biológicas. As barras de erro representam o erro padrão da média. B e C. Os histogramas da intensidade de fluorescência normalizada a 120 minutos após o stress por microscopia (B) e 60 min depois de stress para citometria de fluxo (C) para as três repetições. clique aqui paraver imagem ampliada.

Discussion

Microscopia

O tratamento do poço com ConA é um passo essencial para assegurar uma imagem adequada das células. Porque ConA tem uma baixa solubilidade em PBS (5 mg / ml), o processo de filtração permite a remoção de grandes agregados que se encontram presentes na solução não filtrada e interferem com a imagem latente. Células prender de forma relativamente forte à superfície tratada e a adição da solução de indução não deve perturbar a localização das células, o que permite um acompanhamento contínuo antes e após o estímulo. Este tratamento também pode ser aplicado aos canais ou dispositivos de microfluidos de fluxo foram as células são sujeitas a um fluxo constante de ^7,15. Se o poço não é adequadamente lavada com água após o tratamento, as células não adere correctamente ao vidro, presumivelmente porque a ConA na solução se liga directamente às células e impede-os de modo a formar uma ligação forte à superfície do vidro. Após o passo de lavagem, o bem pode permanecer seco durante 3 -4 horas antes da adição das células sem afectar sensivelmente a ligação das células ao vidro.

A selecção de o tempo de exposição para o canal de fluorescência é uma configuração crítica para o sucesso da experiência. Uma vez que a fluorescência da célula irá aumentar em todo o lapso de tempo, é importante testar previamente, com uma amostra induziu o que é o tempo máximo de exposição que pode ser usado para evitar a saturação das imagens durante a aquisição. Outro parâmetro a ter em consideração ao selecionar o tempo de exposição é o branqueamento do sinal fluorescente. Para cada amostra, é preciso encontrar um trade-off entre o brilho da imagem e da degradação do sinal devido ao branqueamento durante o lapso de tempo. O intervalo de tempo entre cada aquisição também influencia fortemente o branqueamento do fluoróforo. Uma vez que a expressão de proteínas é um processo relativamente lento, que usam tipicamente 10-15 min. intervalos. Se outros processos mais rápidos precisa ser followed em paralelo com a expressão da proteína, pode ser aconselhável a utilização de diferentes intervalos de tempo ao longo de todo o filme de lapso de tempo (1-2 min no início e 5-15 min para aquisições posteriores).

O controlo da densidade das células é um parâmetro importante a ter em conta. Se a densidade for demasiado baixa, apenas algumas células estarão presentes em cada campo de visão resultante de estatísticas pobres para o conjunto de dados. No entanto, se a densidade for muito elevada, pode impedir a segmentação, rastreamento e quantificação das células, tornando-o difícil de extrair a informação desejada a partir das imagens. Para determinar a densidade de sementeira, de um parâmetro adicional para ter em conta é a duração da experiência. Se uma experiência dura vários ciclos de divisão, é aconselhável começar com um campo de visão escasso que vai encher gradualmente durante o curso de tempo da imagem devido à divisão das células e se estabelecer de células em solução. No protocolo, sugerimos o usouma OD ₆₀₀ de 0,02, dependendo do tipo de experiência que executar usamos _DO600 de 0,05 para filmes de lapso de tempo de curta duração para 0,005 para os mais longos.

O número de células analisadas é claramente um parâmetro chave para a validade do ensaio. Às vezes, sómente 20-30 células são combinados para gerar um conjunto de dados. No entanto, para começar a ter conjuntos de dados estatisticamente significativos, uma centena de células ou mais provavelmente necessário. A ampliação do objectivo determina o tamanho da área representada por imagem e, assim, o número de células fotografadas. Para medições de expressão de proteínas, onde o objetivo é medir a fluorescência média da célula, um objetivo numérico de alta imersão abertura 40X é a melhor solução proporcionando boa relação sinal-ruído e um grande campo de visão. Se as estruturas sub-celulares têm de ser analisados, maiores ampliações (objectivos ou 60X 100X) são muitas vezes necessário, resultando na medição de um número de células. O advento da sCMOCâmaras S com um detector de tamanho quase quatro vezes maior do que a de um CCD convencional é claramente uma vantagem para obter mais células por campo de visão.

Com um XY-platina motorizada, é possível para a imagem em campos múltiplos paralelos de modo a aumentar o número de células na base de dados final. No entanto, há um trade-off entre o número de posições XY visitados e a velocidade da aquisição de imagem. Dependendo da velocidade da fase e o número de iluminações gravadas, é normalmente possível imagem dez posições em menos de um minuto. Para quantificar eventos de sinalização rápida, isso pode se tornar um fator limitante. Para as medições de expressão de proteína, onde ocorrem alterações de fluorescência numa escala de tempo mais lento, que geralmente não é uma limitação. Alternativamente, porque estas experiências de expressão durar algumas horas e por causa da resolução temporal lenta necessária, torna-se vantajoso para imagem de múltiplas amostras em paralelo. Vários poços vizinhos can ser semeada com células de tipo selvagem e mutantes, estímulo diferente pode ser aplicada a cada poço ou réplicas biológicas podem ser medida em paralelo. Digitalização através de todos os poços de uma placa de 96 poços é rotineiramente realizada com objetivo de ar para as telas de microscopia ^16. Devido à baixa abundância de proteínas endógenas em leveduras, a sua quantificação requer um objetivo de óleo com alta abertura numérica. Isto limita severamente a gama que pode ser percorrida com o objectivo. No entanto Rotineiramente imagem quatro poços vizinhos por ficar perto de seu canto comum. No entanto, é mais difícil para a imagem de um número maior de poços. Objectivos de água com distribuidores automáticos pode contornar este problema à custa de uma menor perda de brilho.

A citometria de fluxo

Coleta de um número suficiente de células não é um problema com citômetros de fluxo. Normalmente 10.000-100.000 células pode ser adquirido em um minuto. No entanto, porque não há imagem de tele célula é adquirido, é importante seleccionar adequadamente a população de células a ser analisadas. Gating das células com base em medidas para a frente e as dispersa laterais podem permitir a escolha de células individuais em vez de grupos de células e para remover os detritos celulares a partir da análise. Na Figura 2, cada histograma representa uma população de aproximadamente 5.000 células, que foram selecionados com base em suas propriedades de dispersão dos 10.000 eventos medidos.

Ao quebrar aglomerados de células em células individuais, de ultra-sons da cultura de células é um meio adicional para melhorar a qualidade dos dados adquiridos. Isto é válido para a microscopia onde grupos de células pode ser muito difícil de segmento adequada. A duração deste passo tem que ser testada experimentalmente. Nós normalmente realizar dois ciclos de sonicação em um banho de água de 30 segundos a um minuto, seguido por centrifugação da suspensão de células. Sonicação prolongada pode resultar na lise de algumas células. No entanto, não fez observe um aumento da regulação do estresse genes responsivos devido a esta etapa experimental. Note-se que a agregação das células é um fundo fenótipo dependente, por exemplo células W303 exibir uma tendência mais forte para agregar do que as células S288C.

A variabilidade nas medições de uma única célula

Na Figura 3A, a média eo erro padrão para três ensaios independentes realizados por citometria de fluxo e microscopia é traçado. As pequenas diferenças entre as três curvas resultam do facto de que os erros experimentais são relativamente pequenos para estas medidas simples e que muitas células são medidos (mais de 5000 por citometria de fluxo, entre 370-550 por microscopia). A evolução temporal das curvas de microscopia é mais suave do que a dos dados de citometria de fluxo. Uma provável razão para este comportamento é o processo de preparação de amostras. Para a microscopia, todos os pontos de tempo em um experimento resultar do mesmo evento de stress, enquanto que paraFACS, a amostra de cada ponto de tempo é sublinhado individualmente. Pequenas variações no volume das soluções de stress e de cultura pode resultar em uma pequena diferença no resultado a expressão do gene. Uma estratégia alternativa seria a de salientar 5 ml de cultura de células e remover aliquotas a tempos desejados para inibir os com ciclo-heximida. Ambos os métodos funcionam bem, usamos o método de preparação microtubo porque oferece mais flexibilidade e é também adequado para as medições de curvas de dose-resposta em que várias concentrações de NaCl tem que ser medido em paralelo.

O baixo nível de ruído nessas curvas médias, entretanto, não refletem a gama de variabilidade presente no nível da célula única. Na Figura 3B e 3C, os histogramas da expressão medidos por microscopia e citometria de fluxo em um único ponto de tempo são traçados. Estes dois painéis ilustram bem o facto de que as variações entre as repetições técnicas são relativamente pequenos, especra me nt em comparação com a grande variabilidade na expressão de células individuais. A diferença nas formas de distribuição entre a microscopia e a citometria de fluxo medidas resulta do facto de que, com a citometria de fluxo a intensidade total celular é quantificada, enquanto nas imagens de microscopia de intensidade média celular foi calculada. Este último médias de medição fora variações no tamanho da célula e, portanto, resulta em distribuições mais estreitas.

As duas técnicas aqui apresentados permitem estudar quantitativamente o comportamento de células individuais. Este recurso é geralmente escondido em medidas biológicas tradicionais realizados a nível da população. Compreender como a variabilidade na resposta das células individuais emerge pode oferecer importantes insights sobre a regulamentação complexa de processos biológicos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base	ForMedium	CYN6202
CSM amino-acid mix	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Microscope control software	Micro-manager	Ver 1.4.11
Incubation chamber	LIS	The Box
Fluorescence light source	Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Flow cytometer	BD	FACS calibur
Sonicator bath	Telesonic	TUC-150
8-well-slide	Thermo Lab-tek	155409
96-well-plate	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tube	BD Falcon	352054