Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток

Published: October 4, 2013 doi: 10.3791/50637

Summary

Два дополнительных методы, основанные на цитометрии потока и микроскопии представлены которые позволяют количественно, в уровне одной клетки, динамики экспрессии генов, вызванных активацией MAPK пути в дрожжах.

Abstract

Количественная оценка экспрессии генов на уровне одной клетки раскрывает новые регуляторные механизмы уведут в измерениях, выполненных на уровне населения. Два методы, основанные на микроскопии и проточной цитометрии представлены продемонстрировать, как такие данные могут быть приобретены. Выражение флуоресцентного репортера, индуцированной при активации высокой осмолярности глицерин пути МАРК в дрожжах используется в качестве примера. Особые преимущества каждого метода выделены. Проточная цитометрия измеряет большое количество клеток (10000) и обеспечивает прямое измерение динамики белка экспрессии независимо от медленных созревания кинетики флуоресцентного белка. Изображений живых клеток с помощью микроскопа является напротив ограничено измерением зрелой форме репортера в меньшем количестве клеток. Тем не менее, наборы данных, генерируемые этой техники может быть чрезвычайно богатые благодаря комбинации нескольких репортеров и в пространственном и временном информацииполучены из отдельных клеток. Сочетание этих двух методов измерений может доставить новый взгляд на регуляцию экспрессии белка на сигнальных путей.

Introduction

Сигнализация с помощью трансдукции каскадов часто достигает кульминации в экспрессии белков. Характеристика этого профиля экспрессии является ключевым элементом в понимании функции биологических путей. Идентификация спектра до регулируемых белков и динамики их активации может быть достигнуто различными способами, такими как микро-массивов, северных пятнами или западных помарки 1-3. Однако, эти методы в среднем отклик всей популяции клеток. Чтобы понять тонкую регуляцию экспрессии белков, желательно, чтобы собрать измерения на уровне одной клетки. В идеале, эти измерения должны также обеспечить количественные данные поддаются развивать математические модели базового пути.

Микроскопия и проточной цитометрии две методики, которые идеально подходят для доставки таких количественных измерений одной ячейки. Эндогенный мечение белков с флуоресцентным белком может бе используется для количественной оценки их уровня экспрессии 4. Однако, так как добавление большого флуоресцентного фрагмента в конце белка может сделать его нефункциональным, часто более желательны, чтобы генерировать определенные репортеров экспрессии на основе промотора движущей экспрессию флуоресцентного конструкции. Этот репортер белок экзогенными для сотовой системы и, следовательно, не влияет на сигнальные события, которые происходят в клетке.

Оба микроскопии и проточной цитометрии были широко использованы в поле сигнализации дрожжей. В качестве примеров; Колман-Лернер и его коллеги коррелирует, в одиночных камерах, выражение спаривания конкретные и конструктивно, высказанные журналистам с помощью микроскопии для количественной оценки шума в дрожжи спаривания передачи сигнала каскада 5, Акар и его коллеги использовали проточной цитометрии для изучения нормативно-сеть контролирующий экспрессию генов GAL 6. В предыдущем исследовании 7, мы использовали combinatiна этих двух методов для изучения выход экспрессии с высокой осмолярности глицерина (HOG) тропа в почкующихся дрожжей. Это митоген активированной протеинкиназы (МАРК) пути инициируется гипер-осмотического стресса. Это приводит к активации MAPK Hog1, который перемещает в ядро ​​клетки, чтобы вызвать программу транскрипции, что приводит к экспрессии примерно 300 генов. Для изучения этого процесса, мы инженерии выражения репортера на основе STL1 промоутер (гена индуцируется в частности, в ответ на Hog1 деятельности 8) движущей выражение четырехместном Венеры флуоресцентного белка (р STL1-см.). Проточной цитометрии измерения обнаружили наличие двух популяций клеток на среднем уровне напряжения (0,1 М NaCl) и только часть населения, выражающей флуоресцентного репортера. Мы использовали микроскопию для дальнейшего расследования это поведение и обнаружил, что этот шум в экспрессии белка регулируется внутренними факторами 9. Мы CoUл.д. далее заметить, что клетки с аналогичным уровнем Hog1 деятельности может отображать поразительно разные результаты экспрессии. Сочетание этих двух методов позволило нам продемонстрировать, как медленно ремоделирования генов стресс-ответа повлияло на исход выражение в одном уровне клетки 7.

В данной работе мы используем выражение р STL1-QV репортера, вызванного гипер-осмотического шока в качестве примера количественной оценки экспрессии белка по микроскопии и проточной цитометрии. Этот же штамм подвергается 0,2 М NaCl стресса изучали с обоих методов. Это позволит нам выделить несколько ключевых различия в этих двух весьма дополнительных методов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Микроскопии Измерения

  1. Инокулировать 5 мл синтетической среде с дрожжами.
  2. Рост клеток при 30 ° С в течение ночи.
  3. Измерьте OD 600 из ночной культуры на следующее утро.
  4. Развести ночной культуры в 5 мл синтетической среде с OD 600 0,05.
  5. Grow разбавленной культуры при 30 ° С в течение по меньшей мере 4 часов.
  6. Подготовка 3-кратный концентрированный (0,6 М) раствора NaCl в синтетической среде.
  7. Подготовка 1 мг / мл раствора конканавалин А (ConA) в PBS.
  8. Фильтрата ~ 200 мкл ConA раствора в слайде хорошо.
  9. Дайте постоять в течение 30 минут.
  10. Удалить решение ConA.
  11. Добавить 150 мкл H 2 O к колодцу.
  12. Удалить H 2 O.
  13. Измерьте OD 600 из клеточной культуры.
  14. Подготовка 300 мкл клеточной культуре при OD 600 = 0,02 в 1,5 мл микропробирки.
  15. Обрабатывают ультразвуком клеток в водяной бане в течение 45 сек.
  16. Vortex кратко мильcrotube.
  17. Обрабатывают ультразвуком клеток в водяной бане в течение 45 сек.
  18. Vortex кратко микропробирку.
  19. Добавить 200 мкл клеточной культуре к колодцу.
  20. Подождите 30 минут, чтобы клетки оседают на дно скважины.
  21. Поместите а скользят по микроскопом.
  22. Выберите настройки освещения для люминесцентной канал для записи.
  23. Выберите настройки освещения для двух ярких изображений на местах (один немного не в фокусе: 3 мкм ниже фокальной плоскости для обеспечения надлежащего сегментации клеток).
  24. Выберите временные интервалы для измерения покадровой
  25. Выберите поля зрения в изображении.
  26. Начните приобретение нескольких кадров.
  27. Пауза приобретение добавить 100 мкл 0,6 М NaCl среды.
  28. Резюме изображений.

2. Проточная цитометрия Измерения

  1. Инокулировать 5 мл синтетической среде с дрожжами.
  2. Расти при 30 ° С в течение ночи.
  3. МераОП 600 из ночной культуры на следующее утро.
  4. Развести ночной культуры в 5 мл синтетической среде с OD 600 0.1.
  5. Расти при 30 ° С в течение по меньшей мере 4 ч, чтобы достичь OD 600 0,2-0,4.
  6. Подготовка циклогексимид решения 1 мг / мл в H 2 O.
  7. Подготовка 3-кратный концентрированный (0,6 М) раствора NaCl в синтетической среде.
  8. Подготовьте 1,5 мл микропробирок 100 мкл 0,6 М NaCl среды для каждой временной точки должны быть измерены.
  9. В момент времени 0, добавьте 200 мкл клеточной культуры в каждую микропробирку.
  10. Выдержите при встряхивании при 30 ° С.
  11. В момент времени Т, добавить 30 мкл циклогексимид в микропробирки.
  12. Повторите шаг 2,11 для всех желаемых времени.
  13. Выдержите все микропробирок по крайней мере 45 минут и до 3 ч при 30 ° С при встряхивании.
  14. Подготовка FACS труб с 400 мкл PBS.
  15. Разрушать ультразвуком клеток в водяной бане в течение 1 мин.
  16. Vortex кратко Микропробирки.
  17. Сынicate клетки в водяной бане в течение 1 мин.
  18. Vortex кратко Микропробирки.
  19. Добавить 100 мкл культуры клеток из каждой микропробирку в соответствующий FACS трубы.
  20. Выберите лазер на 488 нм возбуждения и 530/30 нм полосовой фильтр для обнаружения.
  21. Тест не-выражения и полностью выражая образец для проверки, если они попадают в диапазон чувствительности извещателя.
  22. Измерьте 10000 клеток для каждого образца приобретенной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Микроскопия

Клетки дрожжей, несущие выражение репортер р STL1-QV (ySP9 7) были прикреплены к нижней части скважины горкой и помещен под микроскопом. Клетки стимулировали добавлением напряжений среды непосредственно в скважине в ходе сеанса изображения. Это позволяет нам приобрести несколько изображений клеток перед индукцией пути и следовать их судьбу после стимуляции. В данном случае, были затем клетки в течение ~ 2 часов с интервалом времени в 10 мин. Рис. 1А это образ нефлуоресцентных клеток до индукции и рисунке 1b отображает те же клетки 2 ч после стресса, когда выражение репортер индуцируется и стала люминесцентная.

Чтобы извлечь количественную информацию, присутствующую в этих изображениях, это сложный процесс анализа изображений должна быть выполнена. Она включает в себя сегментацию клеток для определения объектов в Iмаг, отслеживание этих объектов от одного кадра к другому и измерения особенностей этих объектов (форма и интенсивность свойств). Мы разработали собственную платформу под названием YeastQuant выполнить этот анализ 10. Несколько других некоммерческих программного обеспечения доступны для выполнения этих задач:. CellProfiler 11, CellID 12 или CellX 13 Рисунок 1С отображает результаты анализа проведенного с YeastQuant. Каждая красная кривая представляет временную эволюцию средней интенсивности флуоресценции одной клетки. Синяя линия показывает медиану более 500 клеток, которые были сегментированных и отслеживаться на протяжении всего 20 кадров пяти покадровой фильмов, приобретенных из пяти различных областях видом из той же скважине. Светло-голубой область представляет 25-й и 75-й процентиль всех света, измеренного в данный момент времени.

Проточной цитометрии

Для потока цитометрии ИзмерительнЭнты, культуры клеток было пролито в микропробирках содержащих стресс среду. Для изучения временной эволюции р STL1-QV выражения, перевод ингибировалось в различные моменты времени (от 5 до 10-минутными интервалами) с циклогексимида (рис. 2). Этот препарат блокирует синтез новых белков, но созревание флуоресцентного белка уже выразили не возмущается. Таким образом, после 45 мин до одного часа инкубации клетки могут быть измерены в проточном цитометре позволяет количественно определить количество белка, полученного во время циклогексимида того. Эта стратегия позволяет обойти проблему флуоресцентного созревания белка и тем самым количественно истинные динамику флуоресцентного синтеза белка.

Сравнение двух методов

сравнивает динамику экспрессии репортера измеренных с помощью микроскопии и проточной цитометрии. В то время как флуоресцентный сигнал начинает расти 30-40мин после стресса с микроскопии, измерения потока цитометрии четко доказать, что белки уже произведено от 10 до 15 мин после стимуляции. Это полчаса задержки из-за медленного созревания флуоресцентных белков 14. Хотя оба метода количественной оценки интенсивности флуоресценции клеток, следует иметь в виду, что в этом исследовании, они не проверяют те же биологические процессы. В то время как, микроскопии следует призрак флуоресцентного сигнала, цитометрии потока фактически количественно синтез белка. Очень важно учитывать этот созревания шаг при выполнении визуализации живых клеток. В ситуации, когда эндогенный белок помечен флуоресцентным белком, эндогенный белок будет выражаться и активны до флуоресценция его тега могут быть обнаружены.

Как указано выше, оба метода доставки дополнительную информацию. Проточная цитометрия может измерять большое количество ячеек очень быстро (10000 и более). Таким образом, можно поставить статистически богатые наборы данных, где два перекрывающихся популяций могут быть идентифицированы или несколько редких событий можно наблюдать. Микроскопия предоставляет информацию на ограниченном числе клеток (порядка 100). Однако, поскольку этот набор данных содержит временную и пространственную информацию и позволяет корреляцию нескольких измерений в одной камере, он может предложить весьма ценную информацию исследуемого биологического процесса.

Рисунок 1
Рисунок 1. Измерение репортера выражению микроскопии. А и В. Изображения клеток, несущих флуоресцентную выражение репортер р STL1-QV до (а) и 2 ч после стимуляции 0,2 М NaCl (B). C. Временной ход гриппа orescence привидение. Красные кривые представляют среднюю интенсивность сотовой флуоресценции несколько представительных следов одиночных клеток. Синяя кривая представляет среднее флуоресценцию 550 одиночных следов клеток. Светло-голубой область представляет 25-й и 75-й процентиль флуоресцентного выражение клеточной популяции в каждый момент времени. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2
Рисунок 2. Измерение репортера экспрессии с помощью проточной цитометрии. Гистограммы сотовой флуоресценции клеток, несущих флуоресцентный репортерный выражение р STL1-QV обрабатывали 0,2 М NaCl и ингибирует с циклогексимида в различные моменты времени.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Сопоставление динамики экспрессии измеренных с помощью микроскопии и проточной цитометрии. А. Среднее значение интенсивности флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии (сплошная линия) и микроскопии (пунктирная линия) как функции времени для трех биологических повторностях. Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего. В и С. гистограмм нормированной интенсивности флуоресценции при 120 мин после стресса для микроскопии (B) и 60 минут после стресса для проточной цитометрии (C) для трех повторах. Кликните здесь, чтобыпосмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Микроскопия

Лечение колодца с ConA является важным шагом для обеспечения надлежащего изображений клеток. Поскольку ConA имеет низкую растворимость в PBS (5 мг / мл), процесс фильтрования позволяет удаление больших агрегатов, которые присутствуют в нефильтрованной раствора и мешают визуализации. Клетки приложить сравнительно сильно к обрабатываемой поверхности и добавление индуцирующего раствора не должно мешать локализации клеток, что позволяет непрерывного отслеживания до и после стимул. Эта обработка также может быть применен течь каналы или микрожидкостных устройств были клетки подвергаются постоянной 7,15 потока. Если хорошо не должным образом промыть водой после обработки клетки не будет прилипать должным образом к стеклу, по-видимому, потому что ConA в растворе связывается непосредственно на клетки и предотвращает их с образованием прочной связи на поверхности стекла. После стадии промывки, также могут оставаться сухой 3 -4 ч перед добавлением клеток, не влияя заметно связывания клеток к стеклу.

Выбор времени экспозиции для флуоресцентного канала очень важная установка для успеха эксперимента. Поскольку флуоресценции клетки увеличится по всей покадровой, важно, чтобы проверить заранее с индуцированным образца, что является максимальным временем экспозиции, которые могут быть использованы, чтобы избежать насыщения изображений при приобретении. Еще один параметр, чтобы принять во внимание при выборе времени экспозиции является отбеливание флуоресцентного сигнала. Для каждого образца, нужно найти компромисс между яркости изображения и деградации сигнала из-за обесцвечивания во время покадровой. Интервал времени между каждым приобретения также влияет сильно отбелки флуорофора. Поскольку экспрессия белка является относительно медленный процесс, мы обычно используем 10-15 мин. интервалы. Если другие более быстрые процессы должны быть Followed параллельно с экспрессии белка, было бы целесообразно использовать различные временные шаги по всей покадровой фильма (1-2 мин в начале и в 5-15 мин для последующих приобретений).

Контроль плотности клеток является важным параметром учитывать. Если плотность слишком низка, только несколько клеток будет присутствовать в каждом поле зрения приводит к плохой статистики для набора данных. Однако, если плотность слишком высока, это может помешать сегментации, отслеживание и количественной оценки клеток, что делает его трудно извлечь требуемую информацию из изображений. Для определения плотности посева, один дополнительный параметр, чтобы учесть это продолжительность эксперимента. Если эксперимент длится несколько циклов деления, рекомендуется начать с редкой поле зрения, что будет постепенно заполнить в течение времени ходе визуализации за счет деления клеток и успокаивается клеток в растворе. В протоколе, мы предлагаем использоватьOD 600 из 0,02, в зависимости от типа эксперимента мы выполняем мы используем OD 600 от 0,05 для коротких покадровой фильмов до 0,005 для более длинных.

Число клеток, проанализированных явно ключевым параметром для справедливости эксперимента. Иногда в качестве несколько как 20-30 клетки комбинируют для генерирования одного набора данных. Однако, чтобы начать с статистически значимые массивы данных, сто клеток или более, вероятно, необходимо. Увеличение объектива определяет размер отображаемого области и тем самым количество отображаемого клеток. Для измерений экспрессии белка, где целью является для измерения среднего флуоресценции клетки, высокая числовая апертура 40X погружения цель является лучшим решением обеспечивая как хороший сигнал-шум и большое поле зрения. Если суб-клеточные структуры должны быть проанализированы, с увеличениями (60X или 100X цели) часто необходимы, в результате измерения меньшим числом клеток. Появление sCMOS камеры с размером детектора почти в четыре раза больше, чем один из обычных ПЗС является явным преимуществом для получения более клеток на поле зрения.

С моторизованной XY-стадии, можно изображения в нескольких параллельных полей зрения, чтобы увеличить количество клеток в конечном наборе данных. Однако, есть компромисс между числом позиций XY посещаемых и скорости получения изображения. В зависимости от скорости стадии и количества записанных иллюминации, это, как правило, целесообразно изображения десять позиций в менее чем за минуту. Для количественной оценки быстро сигнальных событий, это может стать ограничивающим фактором. Для измерений экспрессии белка, где изменения флуоресценции происходят на более медленном масштабе времени, как правило, не является ограничением. Кроме того, поскольку эти эксперименты экспрессии длиться в течение нескольких часов, и из-за медленного временным разрешением, необходимой, она становится выгодно изображений нескольких образцов параллельно. Несколько соседних скважин чан быть затравку дикого типа и мутантных клеток, различные стимулы могут быть применены к каждой лунке или биологических повторяет может быть измерена параллельно. Сканирование через все скважин с 96-луночный планшет достигается обычно с воздуха цели для микроскопии экранов 16. Из-за низкой численности эндогенных белков в дрожжах, их количественное требует масла цели с высокой числовой апертурой. Это ограничивает строго диапазон, который может быть путешествовал с целью. Тем не менее мы регулярно изображения четыре соседних скважин, оставаясь близко к их общему углу. Это, однако, более сложной в изображении большее количество скважин. Вода цели с автоматическим дозаторов может обойти эту проблему за счет незначительной потери в яркости.

Проточной цитометрии

Сбор достаточное количество клеток вряд ли проблема с цитометров. Обычно 10000-100000 клетки могут быть приобретены через минуту. Однако, поскольку нет образ тон приобрел клеток, важно правильно выбрать популяции клеток для анализа. Память клеток на основе измеренных вперед и боковых рассеивается может позволить, чтобы выбрать отдельные клетки, а не кластеры клеток и для удаления остатков клеток из анализа. На рисунке 2, каждый Гистограмма представляет собой населением около 5000 клеток, которые были отобраны на основе их рассеяния свойствам от 10000 событий измерить.

Разбив кластеры клеток в отдельных клетках, обработку ультразвуком культуры клеток дополнительный способ улучшить качество полученных данных. Это справедливо как для микроскопии, где кластеры клеток может быть очень трудно сегменте должным образом. Продолжительность этого этапа должна быть проверена экспериментально. Мы обычно выполняют два цикла обработки ультразвуком в водяной бане 30 с до одной минуты с последующим встряхиванием клеточной суспензии. Длительное ультразвуком может привести к лизису нескольких клеток. Тем не менее, мы не сделали оbserve последнюю регуляцию стресс отзывчивых генов из-за этой экспериментальной стадии. Следует отметить, что агрегация клеток представляет собой фон зависит фенотип, например W303 клетки отображения сильную тенденцию к агрегации, чем S288C клеток.

Изменчивость измерений одиночных клеток

На фиг.3А, среднее и стандартную ошибку для трех независимых экспериментов, выполненных цитометрии потока и микроскопии отложена. Незначительные различия между трех кривых возникают из-за того, что экспериментальные ошибки относительно небольшим для этих простых измерений и что многие клетки измеряется (более 5000 для проточной цитометрии, между 370-550 для микроскопии). Временная эволюция кривых микроскопии является более гладким, чем один из данных проточной цитометрии. Один вероятной причиной такого поведения является процесс подготовки образца. Для микроскопии, всех временных точках в эксперименте в результате того же события стресса, в то время как дляFACS, образец для каждой временной точки подчеркнуто индивидуально. Небольшие вариации в объеме напряжений и культуры растворов может привести к небольшой разницей в выходе экспрессии генов. Один из вариантов стратегии будет подчеркнуть 5 мл культуры клеток и удаления аликвоты В нужное время для подавления их с циклогексимида. Оба метода работают хорошо, мы используем метод подготовки микропробирку, потому что это обеспечивает большую гибкость, а также хорошо подходит для измерений кривых доза-ответ, где несколько концентрации NaCl должны быть измерены одновременно.

Низкий уровень шума в этих усредненных кривых, однако, не отражают весь спектр изменчивости, присутствующих на одном уровне клетки. На фиг.3В и 3С, гистограммы выражении, измеренные с помощью микроскопии и проточной цитометрии в одной точке времени нанесены. Эти две панели хорошо иллюстрируют тот факт, что технические различия между повторами относительно невелики, ESPECially в сравнении с большой изменчивостью, наблюдаемой в выражении отдельных клеток. Различие в формах распределения между микроскопии и проточной цитометрии измерений возникает из того факта, что с проточной цитометрии общего клеточного интенсивности количественно в то время как в микроскопии изображений рассчитывали среднее клеточное интенсивность. Этот последний средние измерения из вариаций в размерах клеток и, следовательно, приводит к более узких распределений.

Эти два методы, представленные здесь, позволяют изучать количественно поведение отдельных клеток. Эта функция, как правило, скрыты в традиционных биологических измерений, выполненных на уровне населения. Понимание того, как изменчивость в ответ отдельных клеток возникает можем предложить важную информацию комплексной регуляции биологических процессов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Авторы благодарят Маттиас Петра и его группу в Институте биохимии в ETH в Цюрихе, где были разработаны эти методы. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Швейцарии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base ForMedium CYN6202
CSM amino-acid mix ForMedium DCS0011
Concanavalin A GE Healthcare 17-0450-01
Cycloheximide Fluka Aldrich Sigma C7698 Toxic
ySP9 W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34 pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope Nikon Ti-Eclipse
Microscope control software Micro-manager Ver 1.4.11
Incubation chamber LIS The Box
Fluorescence light source Lumencor SpectraX
Camera Hamamatsu Flash 4.0
Flow cytometer BD FACS calibur
Sonicator bath Telesonic TUC-150
8-well-slide Thermo Lab-tek 155409
96-well-plate Matrical bioscience MGB096-1-2-LG
FACS tube BD Falcon 352054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
  2. de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
  3. Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
  4. Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
  5. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
  6. Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
  7. Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
  8. de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
  9. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
  11. Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
  12. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
  13. Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
  14. Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
  15. Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
  16. Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).

Tags

Клеточная биология выпуск 80 Дрожжи проточной цитометрии микроскопия флуоресценции передачи сигнала отдельные клетки сигнализация МАРК Saccharomyces CEREVISIAE
Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pelet, S., Aymoz, D., Durandau, E.More

Pelet, S., Aymoz, D., Durandau, E. Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells. J. Vis. Exp. (80), e50637, doi:10.3791/50637 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter